肉蓯蓉多糖作為疫苗佐劑的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種免疫佐劑，尤其涉及肉蓯蓉多糖在疫苗佐劑中的應用，屬于生物
技術領域。
【背景技術】
[0002] 肉蓯蓉（Herba Cistanche )為列當科植物，是寄生草本植物，生長在沙漠環境 中，主產于我國新疆、甘肅、內蒙古、寧夏等及中亞、西亞一帶的荒漠中，有沙漠"人參"的美 譽，臨床和民間應用廣泛，《中國藥典》收載荒漠肉蓯蓉和管花肉蓯蓉為藥用肉蓯蓉。新疆 是肉蓯蓉的主產區，主產荒漠肉蓯蓉和管花肉蓯蓉。近十余年研究者們對其化學成分和藥 理作用等方面進行了深入細致的研究，發現肉蓯蓉具有免疫調節、神經保護、抗氧化、抗凋 亡、抗炎癥、抗疲勞、抗衰老等多種藥理作用，這些藥理作用與肉蓯蓉所含的多種有效成分， 如多糖、苯乙醇甙、黃酮等密切相關。
[0003] 疫苗佐劑能夠顯著增強疫苗的免疫原性和安全性、節約抗原的用量，對于控制人 類及動物重大疫病的流行起到了非常重要的作用。佐劑一般可在多種疫苗中進行使用。盡 管許多原料可以應用于疫苗佐劑，但是大多只能誘發抗體反應或者產生一些副作用，因此 限制了它的實際應用。目前，能夠用于臨床的免疫佐劑種類很少，唯一通過FDA批準的能用 于人的佐劑一一鋁膠佐劑只能激發體液免疫，不能誘導細胞介導的免疫反應，并且對人免 疫缺陷病毒（HIV)、丙型肝炎病毒（HCV)、流感病毒等抗原無效，所以篩選能夠用于人體和 動物用的安全、高效、無毒副作用的新型疫苗佐劑的研究日益受到重視。
[0004] 理想的新型免疫佐劑應該是對動物機體的細胞或體液免疫均有有效的激發作用、 作用持久穩定、免疫次數減少、副作用小，同時便于生產和易于注射。
[0005] 大量的研究表明，植物來源的多糖對免疫系統發揮多方面的重要調節作用，又無 嚴重毒副反應而成為安全、高效新型疫苗佐劑的候選資源。植物來源的免疫活性物質，具有 資源豐富、價格低廉、毒副作用小、無殘留等優點，因此植物多糖作為佐劑與疫苗配合使用 是佐劑研究發展的重要途徑和新的趨勢。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供肉灰蓉多糖（Aqueous extracts of Cistanche deserticola，AEO))在疫苗佐劑中的應用。
[0007] 本研究發現，肉蓯蓉多糖能夠明顯刺激血清中抗體IgG、IgGjP IgG2a的產生，對 ConA和LPS刺激的淋巴細胞增殖反應明顯增高，可以激發淋巴細胞分泌產生細胞因子IL-4 和IFN-y。表明肉蓯蓉多糖不僅誘發了較強的體液免疫反應，而且誘導了較強的細胞免疫 反應，可以用于疫苗佐劑。
[0008] 為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：本發明涉及所述的肉蓯蓉多糖在 疫苗佐劑中的應用。
[0009] 本發明所述的疫苗為蛋白疫苗、基因疫苗、多肽疫苗、滅活疫苗或減毒活疫苗。
[0010] 本發明所述的肉蓯蓉多糖采用超聲輔助水提醇沉法提取。本發明通過對新鮮或干 燥的新疆肉蓯蓉粉末，石油醚脫脂，加入蒸餾水超聲，濾液濃縮后加入無水乙醇攪拌沉淀， 沉淀物經過離心，真空干燥，得到肉蓯蓉多糖的粗制品； 再對肉灰蓉粗多糖用Sevage試劑（氯仿：正丁醇=4 :1)除蛋白，離心，合并上清，重復 上述操作多次，收集上清，加入乙醇，靜置過夜，沉淀物經過離心，真空干燥，得到肉蓯蓉多 糖可作為疫苗佐劑。
[0011] 本發明使用方法：肉蓯蓉粗多糖與抗原采用皮下途徑一起注射機體。所述的疫苗 為注射制劑，肉灰蓉多糖在所述注射制劑中的劑量為1.5mg/kg~50mg/kg。
[0012] 本發明肉蓯蓉粗多糖在疫苗佐劑中的應用，通過動物分組及免疫方法、ELISA檢測 小鼠血清中抗OVA特異性抗體滴度及細胞免疫學活性等實驗，結果證明肉蓯蓉多糖可以作 為蛋白疫苗、基因疫苗、多肽疫苗、滅活疫苗或減毒活疫苗的佐劑，其免疫增強效果明顯優 于鋁佐劑，其具有副作用小、來源廣泛、易于生產，并且本發明的肉蓯蓉多糖的制備過程簡 單，成本較低，并且收率較高，有利于大規模生產。
【附圖說明】
[0013] 圖1為小鼠免疫OVA特異性抗體IgG滴度檢測結果。
[0014] 圖2為小鼠免疫OVA特異性抗體IgGjPIgG2a的檢測結果。
[0015] 圖3為ConA和LPS刺激后小鼠淋巴細胞增殖反應的情況。
[0016] 圖4為肉蓯蓉多糖佐劑對小鼠淋巴細胞增殖的細胞因子IL-4產生的影響。
[0017] 圖5為肉蓯蓉多糖佐劑對小鼠淋巴細胞增殖的細胞因子IFN-Y產生的影響。
[0018] 圖6為肉蓯蓉多糖佐劑對流感疫苗IgG抗體水平產生的影響。
[0019] 圖7為肉蓯蓉多糖佐劑對流感疫苗IgGjPIgG&抗體水平產生的影響。
[0020] 圖8為肉蓯蓉多糖佐劑對口蹄疫疫苗IgG抗體水平產生的影響。
[0021] 圖9為肉蓯蓉多糖佐劑對口蹄疫疫苗IgGjPIgG&抗體水平產生的影響。
[0022] 圖10為肉蓯蓉多糖佐劑對小鼠OVA基因疫苗IgG抗體水平產生的影響。
【具體實施方式】
[0023] 以下結合本發明具體實施例，對本發明肉蓯蓉多糖在疫苗佐劑的應用進行詳細說 明。
[0024] 實施例1 :不同劑量肉蓯蓉多糖對小鼠免疫模式抗原卵清白蛋白（OVA)的動物實 驗 本實施例肉蓯蓉多糖的制備方法是： 步驟1 :新鮮或干燥的新疆肉蓯蓉粉末，石油醚脫脂，加入蒸餾水超聲，濾液濃縮后加 入無水乙醇攪拌沉淀，沉淀物經過離心，真空干燥，得到肉蓯蓉多糖的粗制品； 步驟2 :肉灰蓉粗多糖用Sevage試劑（氯仿：正丁醇為4 :1)除蛋白，離心，合并上清， 重復上述操作多次，收集上清，加入乙醇，靜置過夜，沉淀物經過離心，真空干燥，得到肉蓯 蓉多糖。
[0025] 實施方法： 試驗材料：肉蓯蓉多糖母液配置：〇.Ig的肉蓯蓉多糖溶解在IOml生理鹽水中，配置成 lOmg/ml的母液。配置OVA母液：0.0 lg OVA溶解在IOml的生理鹽水中，配置成lmg/ml的 母液。
[0026] 動物免疫：將6-8周齡ICR小鼠，隨機分配成7組，每組6只，實驗分組如表1所 示，
每組疫苗溶解在生理鹽水中，每只小鼠注射100微升，第0天皮下注射，第一次注射 后間隔14天進行再次注射，共注射兩次。
[0027] 為了檢測小鼠體液免疫水平，皮下注射后采血，分離小鼠血清，間接ELISA法分別 檢測IgGUgG 1和IgG2Jt體水平。以2 μg/ml OVA抗原包被96孔酶標板中，4°C過夜，3% 牛血清白蛋白37°C封閉2h ;PBST (將Tween 20溶于PBS，使Tween 20的終濃度為0.05% 得到的溶液）洗滌4次；加入按不同倍數稀釋的小鼠血清，37°C孵育Ih ;PBST洗滌4次， 每次5分鐘；加羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記IgGUgG1和IgG2a抗體（Southernbiotech) (均按1:5000稀釋），37°C孵育lh。每孔加入底物TMB，37°C避光顯色5-15min，加入終止 液2mol/L H2SO4，每孔50 y 1，終止顯色，置于450nm/655nm測定每孔光密度值，陽性滴度的 終點為OD值高于等稀釋度陰性血清(生理鹽水組）平均值的2. 1倍。
[0028] 結果如表2和圖1所示(表2中的數值為6只小鼠混合血清的滴度）：生理鹽水對 照組、無抗原的純多糖組，IgG抗體水平較低，表明以上組合不具備免疫效果。無佐劑的OVA 抗原組產生了低水平的IgG，這表明OVA抗原有一定的免疫效果。相比以上組合，鋁佐劑組， 含佐劑的低劑量組、中劑量組、高劑量組均能產生高水平的IgG，并且AE⑶100 y g組的效果 最為顯著，與抗原對照組相比，抗體滴度增強了 30倍，略高于鋁佐劑組，而且抗體的持續時 間較長。上述結果表明，佐劑肉蓯蓉多糖能夠使OVA蛋白疫苗誘導機體產生很高的體液免 疫反應。
抗體亞型檢測結果如表3和圖2 (表3中的數值為6只小鼠的平均值土標準差，不同 字母表示P < 0. 01):生理鹽水對照組、無抗原的純多糖組，IgGjP IgG2a的抗體水平較低， 表明以上組合不具備免疫效果。無佐劑的OVA抗原組產生了一定水平的IgGjP IgG2a，這表 明OVA抗原有一定的免疫效果。相比以上組合，鋁佐劑組能夠產生高水平的IgG1，但是產生 的IgG2a的水平較低，含佐劑的低劑量組、中劑量組、高劑量組均能產生較高水平的IgG i，并 且AE⑶100 y g組的效果最為顯著，與抗原對照組相比差異顯著（P〈0. 05)，與鋁佐劑相當， 而含佐劑的各組均能夠產生較高水平的IgG2a，AECD100 y g組的效果最為顯著，與抗原對 照組和鋁佐劑相比差異極顯著（P〈〇. 01)，抗體亞型檢測的結果表明，佐劑肉蓯蓉多糖不僅 能夠能夠使OVA蛋白疫苗誘導機體產生很高的體液免疫反應，也可以產生很高水平的細胞 免疫反應。
用MTT法檢測小鼠免疫后的細胞免疫水平，具體如下：第二次皮下免疫后7天處死小 鼠，在無菌條件下，取小鼠脾臟，研碎，用紅細胞裂解液除去紅細胞，并過尼龍柱除去B細胞 制成單細胞懸液，PBS液洗三次，離心并進行細胞計數，調整細胞濃度到IX IO6個/ml，每 組細胞懸液分4份加入96孔細胞培養板中：其中一份加入OVA抗原至終濃度10 y g/ml， 一份加入ConA (刀豆蛋白A)或LPS (脂多糖）至終濃度為5 y g/ml或10 y