銀線草醇d在制備抑制肝癌細胞克隆形成的藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于化工領域及醫藥領域，涉及銀線草醇D在制備抗肝癌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 原發性肝臟惡性腫瘤起源于肝臟的上皮或間葉組織，前者稱為原發性肝癌，是我 國高發的，危害極大的惡性腫瘤。繼發性或稱轉移性肝癌系指全身多個器官起源的惡性腫 瘤侵犯至肝臟。一般多見于胃、膽道、胰腺、結直腸、卵巢、子宮、肺、乳腺等器官惡性腫瘤的 肝轉移。
[0003] 肝臟是人體最大的實質性器官，承擔人體的各類重要代謝功能，因此，肝臟一旦出 現惡性腫瘤將導致未及生命的嚴重后果。又由于肝臟具有豐富的血流供應，與人體的重要 結構如下腔靜脈、門靜脈、膽道系統等關系密切；肝臟惡性腫瘤發病隱匿，侵襲性生長快速， 其治療甚為困難。
[0004] 目前，治療方法包括手術、肝動脈結扎、肝動脈化療栓塞、射頻、冷凍、激光、微波以 及化療和放射治療等方法。生物治療，中醫中藥治療肝癌也多有應用。目前肝癌的治療以 手術為首，這是因為放療和化療的副作用。許多化療藥物對正常細胞也有殺傷作用，導致患 者自身免疫系統在治療過程中收到較大損傷。副作用較少的藥物鳳毛麟角，因此尋找新的 候選化合物是肝癌預防和治療的重要課題。
[0005] 銀線草為金粟蘭科植物銀線草（Chloranthus Japonicus Sieb)的全草或根及根 莖。倍半萜類化合物是金粟蘭科植物中比較重要的一類化合物，在整個金粟蘭科植物中均 有分布，具有消炎解痙、抑制微生物等生物活性。銀線草中得到半萜類化合物結構復雜其骨 架可分為桉葉烷型、環桉烷型、吉馬烷型、菖蒲烷型等數種類型，同時它們具有內酯、酮、醇、 多聚體等多種形式。
[0006] 銀線草全株供藥用，具有祛濕散寒、活血止痛、散瘀解毒之功效。民間驗方有許多 有關銀線草的記載，如銀線草外敷可治療瘡癤、疥癬、無名腫毒、蛇咬傷、乳腺炎等疾病。
[0007] Kawabata等1990年首次從銀線草中分離出了 1個由2個環桉型倍半廠內酯聚合 而成的二聚體化合物，命名為銀線草醇A(shizuka〇l A)，在1992年從銀線草中分離得到了 3個由2個環桉型倍半萜內酯聚合而成的二聚體化合物，命名為銀線草醇B-D(Shi ZUka〇l B-D) 〇
[0008] 申請號為200910095051. 6、申請日為20091013、名稱為"烏藥烷型二聚倍半萜類 化合物，其制備方法及其在制藥中的應用"的中國發明專利申請中詳細闡述了銀線草醇D 的制備方法，并且表明銀線草醇D能夠明顯增加 L6細胞葡萄糖的消耗量，提示其能夠促進 胰島素的作用，促進糖的攝取和轉運。
[0009] 銀線草醇D，英文名為Shizukaol D，CAS No. :142279-42-3。銀線草醇D是天然產 物，生物利用度較高、性質較穩定，具有臨床使用價值。隨著人們對此類化合物的化學和生 物學研究的深入，其分子作用機制將逐步明確，這將進一步推動此類化合物的化學結構修 飾和構效關系研究，并有助于提高此類化合物的藥用價值。

【發明內容】

[0010] 本發明的目的是提供銀線草醇D的新的藥用用途。
[0011] 本發明提供了銀線草醇D在制備抗肝癌藥物中的應用，尤其是銀線草醇D在制備 抑制肝癌細胞克隆形成的藥物中的應用。
[0012] 本發明中依據：通常，細胞克隆形成率即細胞接種存活率，表示接種細胞后貼壁的 細胞成活并形成克隆的數量；貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆，而形成克隆 的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重 要性狀。
[0013] 本發明所述的藥物制成針劑或者片劑。
[0014] 所述的腫瘤來源于8謹(：-7721、31(-11印1、!1印62、06￥、!1印38或者？0〇^細胞。
[0015] 本發明中，所述的抑制肝癌細胞克隆形成的藥物可以是銀線草醇D和其他治療肝 癌藥物的組合物。例如，所述的其他治療肝癌藥物是索拉菲尼。
[0016] 另一方面，將銀線草醇D加入體外培養的腫瘤細胞的培養液中，夠明顯抑制腫瘤 細胞的增殖和克隆形成。
[0017] 其中，體外培養的腫瘤細胞的培養液中，加入的銀線草醇D的藥物濃度大于0且 小于 50 μ mol/L〇
[0018] 一般而言，加入銀線草醇D的終濃度為1-100 μ Μ。例如，1-5 μ M，1-10 μ M， 5-10 μ Μ,1-20 μ Μ,5-30 μ Μ,1-60 μ Μ,5-90 μ Μ,10-40 μ Μ,1-50 μ Μ,5-60 μ Μ,15-25 μ Μ, 5-50 μ Μ，15-60 μ Μ，25-40 μ Μ，5-40 μ Μ，等等。較好的，銀線草醇D的藥物濃度小于 20 μ mol/L。
[0019] 本發明的一個實施例中采用的肝癌細胞是SMMC-7721細胞。
[0020] 另一個實施例中采用的肝癌細胞是Focus細胞。
[0021] 本發明的小分子化合物可以采用各種常規的制備方法制備。例如，采用人工化學 合成的方法。
[0022] 以本發明的銀線草醇D為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯用。這類 藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但 并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹 配。本發明的銀線草醇D可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑 的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進 行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是 治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的銀線草 醇D還可與其他治療劑一起使用。
[0023] 當本發明的銀線草醇D被用作藥物時，可將治療有效劑量的銀線草醇D施用于哺 乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過 約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然， 具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
[0024] 本發明提供了銀線草醇D在制備抗腫瘤藥物中的應用，尤其是制備抑制肝癌細胞 克隆形成的藥物。腫瘤的發生是由于細胞增殖與分化的異常，侵襲和轉移是腫瘤的另一特 征，本發明的實驗結果生長曲線表明，銀線草醇D能夠抑制腫瘤細胞的增殖。克隆形成試驗 結果顯示，加藥后，腫瘤細胞SMMC-7721和FO⑶S細胞較未加入銀線草醇D的陰性對照組克 隆數明顯下降，說明銀線草醇D能明顯抑制細胞的克隆形成能力。銀線草醇D具有抑制細 胞的貼壁和增殖能力，降低肝癌細胞的生存活性，可以作為治療肝癌藥物的先導化合物。
[0025] 本發明的小分子化合物銀線草醇D是天然產物，抑瘤效果明顯，能夠明顯抑制腫 瘤細胞的增殖和克隆形成，綠色環保，副作用較小，可作為新的抗腫瘤藥物或者其輔助成分 進行開發，為治療和治愈腫瘤提供新的途徑和手段。
【附圖說明】
[0026] 圖1是focus細胞克隆形成結果圖，
[0027] 其中，圖中數字即加藥的終濃度，單位為微摩（μ mol/L)，
[0028] 銀線草醇D處理48小時后的focus細胞，與未加藥的對照組相比，細胞克隆形成 明顯減少。隨著藥物濃度的增加，細胞克隆數逐步下降，說明銀線草醇D抑制FOCUS細胞克 隆形成具有具有濃度依賴性。
[0029] 圖2和圖3是SMMC-7721的細胞克隆形成結果圖，
[0030] 其中，圖中數字即加藥的終濃度，單位為微摩（μ mol/L)。圖2每皿接種1000個 SMMC-7721細胞，圖3每皿接種500個SMMC-7721細胞；
[0031] 與未加藥的對照組相比，銀線草醇D處理48小時后的SMMC-7721細胞，克隆形成 明顯減少，而且具有濃度依賴性。
【具體實施方式】
[0032] 本發明的試驗中采用的實驗方法：
[0033] 1.細胞復蘇
[0034] 1)從液氮罐中取出凍存管，直接投入37°C溫水中，并不時搖動令其盡快融化。
[0035] 2)從37°C水浴中取出凍存管，用吸管吸出細胞懸液，注入離心管并加入10倍以上 培養液，混合后