中藥地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及中藥地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應 用。
【背景技術】
[0002] 地榆為薔薇科植物地榆（Sanguisorba officinalis L)或長葉地榆（Sanguisorba officinalis L.var.longifolia(Bert.)Yiiet Li)的干燥根。我國全國各地均有產，主產 于浙江、安徽、山東、湖南、湖北等地。地榆性微寒，味苦、澀、酸，歸肝、胃、大腸經，有涼血止 血、解毒斂瘡等功效，臨床常用于便血、濤血、血病、崩漏、水火燙傷、通腫瘡毒等病癥的治療 (參見：清·孫星衍，孫星翼輯.神農本草經[M].北京：商務印書館，1955. 94.)。
[0003] 地榆也具備有抗菌消炎的作用，但主要集中于金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌等 細菌(參見文獻：吳開云，黃雪芳，彭宣憲.冰片、虎杖、地榆抑菌作用的實驗研究[J].江 西醫學院學報，1996, 36(2) :53-55.)。地榆主要為生用或炒炭用。生地榆是未經炮制的地 榆飲片，常研磨外用治療水火燙傷、濕疹、皮膚潰瘍等疾病，有收斂吸濕的作用。地榆炭是用 炒炭法炮制的地榆飲片，止血作用強，療效勝于生地榆。將生地榆粗提物分別用石油醚、乙 酸乙酯、正丁醇、水萃取后檢測其抗真菌的活性，發現乙酸乙酯萃取部分的抗菌活性效果最 好。
[0004] 目前尚未見地榆有關抗真菌的報道，也未見其作為協同抗真菌增效藥物的相關報 道。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供中藥地榆的新的醫藥用途。
[0006] 本發明提供了中藥地榆作為抗真菌藥物增效藥的新用途，即地榆在制備抗真菌藥 物增效劑中的應用。
[0007] 本發明所述的中藥地榆(地榆)，包括地榆的兩種不同炮制藥材--生地榆和地榆 炭。也包括通過乙酸乙酯萃取等方法提取到的地榆的活性成份。
[0008] 本發明所述的抗真菌藥物為常規抗真菌藥物，包括但不限于氟康唑、卡泊芬凈、特 比萘芬、兩性霉素B等。
[0009] 本發明經體外實驗證實，地榆對氟康唑，咪康唑，卡泊芬凈，兩性霉素B等常規抗 真菌藥物有增效作用，對于耐藥真菌，抗真菌藥物與地榆合用時，能明顯降低常規抗真菌藥 物的藥物劑量，能不同程度地提高常用抗真菌藥對真菌的抑制作用，并能使抗真菌藥物恢 復對耐藥真菌的作用，增強對耐藥真菌的抑制作用。
[0010] 本發明為中藥地榆開辟了新的用途，將其用于抗真菌藥物的增效劑，不僅能提高 藥物的抗真菌作用，而且在臨床真菌耐藥性日趨普遍、耐藥程度日趨嚴重的情況下，使抗真 菌藥物恢復對耐藥真菌的作用，可降低抗真菌藥物的用藥劑量，為患者節省了醫療費用，并 可減少藥物的毒副作用。 toon] 本發明的中藥地榆是我國傳統藥物，具有資源豐富，價格便宜，副作用小等優點， 地榆和抗真菌藥物合用也能夠減少藥物的毒副作用，節省患者的醫藥費用。
【具體實施方式】
[0012] 現結合實施例，對本發明作詳細描述，但本發明的實施不僅限于此。
[0013] 實施例1 :生地榆與抗真菌藥聯用7株念珠菌的作用
[0014] 一、材料和方法
[0015] 1、試劑
[0016] 生地榆：上海雷允上醫藥有限公司中藥部
[0017] 地榆炭：上海雷允上醫藥有限公司中藥部
[0018] 氟康唑注射液：輝瑞制藥有限公司
[0019] 無水乙醇：上海國藥集團有限公司
[0020] 石油醚：上海國藥集團有限公司
[0021] 乙酸乙酯：上海國藥集團有限公司
[0022] 正丁醇：上海國藥集團有限公司
[0023] 中藥提取液的制備：分別取生地榆，地榆炭中藥粉末各5g，加入70%的乙醇溶液 50ml，于室溫下50KHz超聲40分鐘，冷卻后重復超聲兩次，3000 X g，離心5min，取上清液，該 藥生藥濃度為0. lg/mL，放于4°C冰箱保存備用。
[0024] 生地榆乙酸乙酯萃取液的制備：將保存的中藥粗體物40ml，烘干，加水混懸，分 別依次加入萃取液（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇）1~1. 5倍體積，立即充分震蕩混勻，然后 靜置分液漏斗，待液體分層后，從下端出口接取萃取液，每種萃取液重復多次萃取至萃取液 無色或顏色變淡。合并萃取液，旋轉蒸干，取少量用DMSO配置成5. 12mg/mL的溶液。
[0025] 2、菌株
[0026] 菌株：白色念珠菌103 (簡稱103)、白色念珠菌SC5314 (簡稱sc5314)、白色念珠 菌100 (簡稱100)、克柔念珠菌ATCC2159 (簡稱克柔ATCC2159)、熱帶念珠菌ATCC087 (簡 稱熱帶ATCC087)、光滑念珠菌ATCC28226 (簡稱光滑ATCC28226)、近平滑念珠菌22090 (簡 稱近平22090)，均由上海長海醫院真菌室提供，分別采自長海醫院不同科室臨床樣本，并經 形態學和生化學鑒定，也可購自中科院細胞所或ATCC保藏機構等。
[0027] 所有實驗用菌株均于沙堡葡萄糖瓊脂培養基（SDA)劃板活化，白色念珠菌于30°C 培養2周后，分別挑取單克隆再次劃板活化，取第二次所得單克隆置SDA斜面，用上述方法 培養后于4°C保存備用。
[0028] 3、培養液
[0029] 沙堡葡萄糖瓊脂固體培養基（SDA):
[0030] 蛋白胨l〇g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶 液50ml，調整pH至7. 0,以三蒸水定容至1000ml，高壓滅菌（121°C 15min)后于4°C保存備 用。
[0031] YEro 培養液：
[0032] 酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/m氯霉素水 溶液50ml，三蒸水定容至1000ml，高壓滅菌（121 °C，15min)后于4°C保存備用。
[0033] RPMI1640液體培養液：
[0034] RPMI1640 (Gibco BRL) 10g，NaHC032. 0g，嗎啡啉丙磺酸（MOPS) (Sigma) 34. 5g (0· 165M)，加三蒸水900ml溶解，IN NaOH調pH至7. 0(25 °C )，三蒸水定容至1000ml， 0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4°C保存備用。
[0035] 4、儀器設備
[0036] MDF1-100手提式高速中藥粉碎機(上海市民德機械制造有限公司）
[0037] DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英略矛華儀器廠）
[0038] SHZ-D (III)循環水式真空泵(鞏義市英略矛華儀器廠）
[0039] RE-52C旋轉蒸發器(上海青浦滬西儀器廠）
[0040] KQ-C玻璃儀器氣流烘干器(鞏義市英略矛華儀器廠）
[0041] Multiskan MK3型酶標檢測儀(芬蘭Labsystems產品）
[0042] 全溫振蕩培養箱(培英，HZQ-F160)
[0043] MJX型智能霉菌培養箱(寧波江南儀器廠）
[0044] SW-CT-IF型單人雙面凈化工作臺（蘇州凈化有限公司）
[0045] 生物顯微鏡(重慶光學儀器廠XSZ-G)
[0046] 5、菌液制備
[0047] 實驗前，從4°C保存的SDA培養基上挑取念珠菌，接種至Iml YEH)培養液，于30°C， 200rpm振蕩培養，活化兩次后，使真菌處于指數生長期后期。取該菌液IOul至ImlYEro培 養液中，用上述方法再次活化，16h后，用血細胞計數板計數，以RPMI1640培養液調整菌液 濃度至IX IO3~5 X IO3個/ml。
[0048] 6、藥敏反應板的制備
[0049] 取無菌96孔板，于每排1號孔加 RPMI1640液體培養基100 μ 1作空白對照；3~ 12號孔各加新鮮配制的菌液100 μ 1 ;2號孔分別加菌液198 μ 1和受試化合物溶液2 μ 1 ; 12號孔不含藥物，只加菌液100 μ 1作陽性生長對照。2~11號孔進行倍比稀釋，使各孔的 最終藥物濃度分別為 1000、500、250、125、62· 5、3L 25、15· 625、7· 8125、3· 906 和 L 953μ g/ ml，各孔中乙醇含量均低于1%。每次配制藥敏板的同時均制備一質控菌藥敏板，各藥敏板 于30 °C恒溫箱培養。
[0050] 7、最低抑菌濃度（MIC值）的判定
[0051] 在30°C恒溫箱中，白念珠菌培養48h，用酶標分析儀于630nm測各孔OD值。與陽 性對照孔比，以OD值下降80%以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC8q (真菌生長80%被 抑制時的藥物濃度)。
[0052] 當藥物的MIC8tl值超過測定濃度范圍時，按以下方法進行統計：MIC 8tl值高于最 高濃度1000 μ g/ml時，計為">1000 μ g/ml" ；氟康唑MIC8tl值高于最高濃度64μ g/ml 時，計為">64 μ g/ml" ；藥物MIC8tl值為最低濃度或在最低濃度以下時，不作區別，均計為 "彡1.953 μ g/ml"；氟康唑MIC8tl值為最低濃度或在最低濃度以下時，不作區別，均計為 "彡0. 125 μ g/ml "。上述實驗均平行操作2到3次，當MIC8tl值能準確重復或只差一個濃度 時才被接受，并以較高濃度作為MIC8tl值；當MIC8tl值相差兩個濃度以上時，則需重新實驗， 直到符合要求為止。
[0053] 二、實驗結果見表1。
[0054] 表1中藥生地榆提取液與氟康唑合用對7株念珠菌的抗真菌作用（生藥濃度）
[0055]
【主權項】
1. 地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應用。
2. 根據權利要求1所述的地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應用，其特征在于，所述 的地榆為生地榆或地榆炭。
3. 根據權利要求1所述的地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應用，其特征在于，所述 的地榆為地榆通過乙酸乙酯萃取方法提取到的活性成份。
4. 根據權利要求1、2或3所述的地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應用，其特征在于， 所述的抗真菌藥物為氟康唑、卡泊芬凈、特比萘芬，或兩性霉素B。
【專利摘要】本發明涉及醫藥技術領域，具體涉及中藥地榆在制備抗真菌藥物增效劑中的應用。本發明經體外實驗證實，地榆對氟康唑，咪康唑，卡泊芬凈，兩性霉素B等常規抗真菌藥物有增效作用，對于耐藥真菌，抗真菌藥物與地榆合用時，能明顯降低常規抗真菌藥物的藥物劑量，能不同程度地提高常用抗真菌藥對真菌的抑制作用，并能使抗真菌藥物恢復對耐藥真菌的作用，增強對耐藥真菌的抑制作用。本發明為中藥地榆開辟了新的用途，在臨床真菌耐藥性日趨普遍、耐藥程度日趨嚴重的情況下，可降低抗真菌藥物的用藥劑量，為患者節省了醫療費用，并可減少藥物的毒副作用。
【IPC分類】A61P31-10, A61K45-00, A61K36-739
【公開號】CN104857116
【申請號】CN201410060182
【發明人】曹永兵, 葉招澆, 姜遠英, 劉謀志, 閻瀾, 李洪嬌, 王彥, 曹穎瑛, 汪瑞蓮
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫大學
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2014年2月21日