專利名稱：抑制人體腫瘤細胞生長的反義寡核苷酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及抑制人體腫瘤細胞生長的寡核苷酸，具體地講涉及抑制人體腫瘤細胞生長的反義寡聚脫氧核苷酸及含有所述寡核苷酸的組合物，以及將所述寡核苷酸用于制備抗腫瘤藥物的用途。
raf基因編碼對絲氨酸、蘇氨酸特異的蛋白激酶，這種蛋白激酶在有絲分裂信號途徑中起者重要作用。raf一旦被激活就可以直接激活有絲分裂原激活蛋白激酶的激酶(MEK)。raf基因不可控的高表達會引起細胞的無限增殖，導致腫瘤的發生。
資料表明，c-raf激酶對人體許多種腫瘤的發生和發展起關鍵作用，(Johnson,B.E.et.al.(1993).Chest.103(1suppl):15-25；Vainio,H.(1995),J.of Occupational &Environmental Medicine,37(1):69-76)。c-raf基因最初是在鼠類肉瘤病毒引發的腫瘤中發現的(Rapp,U.R.et,aL.PNAS,80:4218-4222)。隨后在人體中也發現了c-raf激酶(Bonner,T.I.et,al.Nucleic Acids Res.14(2):1009-1015)，隨后，人們搞清了c-raf基因的序列及主要功能，根據功能分類，c-raf基因屬于原癌基因類，其主要功能是與ras基因編碼的蛋白相結合，把信號通過細胞表面受體傳遞到細胞核中，引起細胞增殖，它是ras下游信號通道的一個中央調控子。在人體多種腫瘤組織中，發現有ras基因突變存在的大約占50％以上，因此阻斷c-raf基因mRNA的轉譯，使ras激酶不能與raf激酶相結合，從而使ras激酶失去致癌功能，這會對由ras突變所引發的腫瘤具有相當有效的治療效果。
反義核酸是在原核細胞及真核細胞內天然存在的一種基因表達的抑制物(Mizuno,T.Chou,M-Y.and Inouye,M.(1984).PNAS81(1966-1970)Heywood,S.M.Nucleic Acids Res,14,6771-6772(1986))，這些核酸片斷的功能是結合到互補的mRNA序列上，阻斷mRNA翻譯蛋白質分子的過程(Paterson,B.M.,Roberts,B.E.,and Kuff,E.L.,(1977).PNAS,74,4370-4374)。反義寡聚脫氧核苷是一小段人工合成的脫氧核苷，它的堿基順序與人們選擇作為阻斷目標的基因的某一段互補，依照堿基配對法則可以與存在于細胞質中的特定基因的mRNA結合，阻斷其翻譯蛋白質分子。
在細胞內部，一個拷貝的基因會產生200-300條mRNA，翻譯出10萬個有生物學功能的蛋白質分子。傳統藥物一般是作用于具有生物學功能的蛋白質分子。所以與傳統藥物相比，反義核酸藥物具有高選擇性，高效性及低副作用等優點，特別是在抑制腫瘤生長及抗病毒繁殖方面，已有許多反義核酸藥物在完成臨床前期的研究和開發后進入臨床Ⅰ、Ⅱ期試驗(Stein,C.A.,et,al.(1994).Curr.Opin.Onco.6:587-594),(Crook,S.T.(1995).HematologicPathology,9(2):59-72))。
本發明目的之一是提供一種反義寡聚脫氧核糖(DNA)或核糖(RNA)序列，其特征在于可特異性結合c-raf基因mRNA的不同區域。
本發明的另一目的是提供含有本發明寡核苷酸的藥物組合物。
本發明的另一目的是提供了本發明寡核苷酸用于制備抗腫瘤藥物的用途。
本發明以c-raf基因的5′端，3′端非轉譯區攻擊位點，設計了一系列反義核酸。采用亞磷酰胺固相合成法合成了相應的核酸分子，還合成了陽性對照Pac10及陰性對照Pac23各一個，其長度均為20個核苷酸殘基。采用人體肺癌細胞株A549作為靶受體，對合成的反義核酸進行初步篩選。篩選結果表明，其中六個寡聚反義核苷酸均具有不同程度的抑制人體腫瘤細胞生長的特性，將它們分別定名為Pac14,Pac16,Pac17,Pac18,Pac19,Pac21，其中Pac14具有最高的抑制人體腫瘤細胞生長的活性。
具有抑制人體腫瘤細胞生長活性的Pac系列寡聚反義核苷酸堿基組成及順序如下所示Pac14:5′-GAG GGA GCC AGG CCG CCC CA--3′20merPac16:5′-AAT CCC ATG TGT CTC CAC CT-3′20merPac17:5′-ACA TGC ATT CCT CCA GAA CC-3′20merPac18:5′-TGA AGA AAG TCC CGC CTG TG-3′20merPac19:5′-TGT GCA AAA TGT CTG GCG CT-3′20merPac21:5′-GGC CAG AGT CTC GGC AGT CC---3′20mer陽性對照Pac10序列如下Pac10:5′-TCC CGC CTG TGA CAT GCA TT---3′ 20mer陰性對照Pac23序列如下Pac23:5′-CAC GGT GCG TCG ACG CAC TA-3′20merPac系列反義寡聚核苷酸均是長為20個核苷酸殘基并經過硫代修飾的寡聚核苷酸，攻擊目標位于c-raf基因的5′端及3′端非轉譯區，它們可在細胞質中與c-raf基因的信使核糖核酸特異性結合，阻止raf蛋白的產生，從而抑制了ras的功能，最終抑制了腫瘤細胞的生長，其對腫瘤細胞的抑制活性隨著濃度的增加而增強，其中Pac14抑制raf激酶的活性高達90％。反義寡核苷酸是通過與目標基因的信使核糖核酸(mRNA)特異性雜交來發揮其生物學功能的，從核酸雜交的特性看，RNA與mRNA雜交的親和力比DNA與mRNA雜交的親和力要高，從而在藥用方面具有更大的價值，但是由于目前合成RNA的成本遠高于合成DNA的成本，考慮到臨床應用的成本要求，目前作為臨床應用試驗的反義寡核苷酸藥物均為寡聚脫氧核糖(DNA)，但將來合成RNA成本有可能降低，可能會在臨床上采用反義寡聚核糖(RNA)取代反義寡聚脫氧核糖(DNA)作為藥用。
反義核酸的生物學活性是序列特異性的，互補于某一基因特定位點的反義核酸其互補的長度不同，生物學活性高低也不同，一般講來，反義核酸與目標基因互補長一些，生物學活性會高，但較長的反義核酸其合成成本會高很多，所以作為藥用目的的反義核酸，研究者均會同時考慮成本和藥用活性選取一個合適的長度，本發明中反義核酸長度均為20個堿基。當然延長或縮短一至數個堿基而互補于同一基因位點的反義核酸也會具有程度不同的相同生物學活性。同時互補于相同基因位點附近的反義核酸若結合部位有不同程度的重疊，被認為具有程度不同的序列同源性，也會具有不同程度的相同生物學活性。在人體內存在著大量的核酸外切酶，反義寡核苷酸若不經過化學修飾會很快被降解，從而失去活性。反義寡核苷酸的化學修飾有很多種方法，常見的有硫代修飾反義核酸和2′-甲氧基修飾反義核酸等，目前硫代反義核酸的藥理學，藥代動力學，毒理學等臨床前研究是各種化學修飾中研究的最為全面的，硫代反義核酸在體內可以有效地抵御核酸酶的降解，并且可以激發RNA酶H的活性，降解與之雜交的mRNA鏈，所以目前臨床試驗應用的反義核酸均為硫代反義核酸。同時人們也在進行其它化學修飾的反義核酸臨床前藥物研究，以期進行臨床應用。所以某一特定序列的反義核酸可以通過不同的化學修飾作為化學組份不同的化合物，在臨床上都具有藥物活性。
綜上所述，本發明所述的互補于raf基因不同部位的反義核酸具有抑制人體腫瘤細胞株生長的特性，在腫瘤的治療方面顯示出誘人的前景。可以通過不同的化學修飾，采用不同的長度和不同程度同源性的序列發展為具有臨床應用價值的抗腫瘤藥物。
可以將本發明的寡序列與藥用載體結合，用于動物，包括哺乳動物和人。所述藥用載體包括磷酸鹽緩沖液(pH7.4)以及其他常用的載體和緩沖液。圖例說明

圖1．顯示反義核酸Pac系列對c-raf基因表達的抑制的Northernblot(核酸雜交)結果的照片。
將A549細胞株分成對照組(無處理)和反義核酸處理組，在1640培養基中將細胞接種，培養至細胞總數為10萬，在培養液中加入濃度為10ug/ml的脂質體，處理組用800nM的不同的反義核酸處理。24小時后提取細胞RNA進行c-raf基因mRNA的定量監測。制備c-raf基因的核酸探針與硝酸纖維膜上的樣品進行核酸雜交，以G3PDH作為內部參照。
圖中，0號樣品為無處理組，10號樣品為陽性對照，23號樣品為陰性對照，其它為不同的Pac系列的反義核酸樣品。圖中可見Pac系列反義核酸不同的抑制活性。圖2．顯示反義核酸在抑制細胞生長體系中，加入脂質體的作用。
將A549細胞株分成對照組(無處理)和反義核酸處理組，每組內分為加入脂質體處理的樣品和不加脂質體處理的樣品，在1640培養基中將細胞接種，培養至細胞總數為10萬，相應樣品中加入濃度為10ug/ml脂質體，處理組用800nM的不同的反義核酸處理。每個樣品均作2次。24小時后提取細胞RNA進行c-raf基因mRNA的定量監測。制備c-raf基因的核酸探針與硝酸纖維膜上的樣品進行核酸雜交，以G3PDH作為內部參照。
圖中Nooligo表示無處理組，14,12號樣品表示用Pac14,Pac12反義核酸處理的樣品。+表示加入脂質體，-表示不加入脂質體，從圖中可以看到，在培養細胞中，只有加入脂質體，反義核酸才能有生物學活性。圖3．Pac系列反義核酸對人體腫瘤細胞株A549生長的抑制(1)將A549細胞株分成對照組(無處理)和反義核酸處理組，在1640培養基中將細胞接種，培養至細胞總數為10萬，在培養液中加入濃度為10ug/ml的脂質體，處理組用800nM的不同的反義核酸處理4小時，24小時后用MTT法測定反義核酸對細胞生長的抑制作用，用酶標儀于554nm處測定每一樣的吸光值，數值高低線性反映出反義核酸對細胞生長的抑制作用。
圖中黑色豎直條表示無反義核酸處理組，淺灰色豎直條表示反義核酸陰性對照，深灰色豎直條表示不同的反義核酸處理結果。圖4．Pac系列反義核酸對腫瘤細胞株A549的生長的抑制(2)。
將A549細胞株分成對照組(無處理)和反義核酸處理組，在1640培養基中將細胞接種，培養至細胞總數為10萬，在培養液中加入濃度為10ug/ml的脂質體，處理組用800nM的不同的反義核酸處理4小時，24小時后用MTT法測定反義核酸對細胞生長的抑制作用，用酶標儀于554nm處測定每一樣的吸光值，數值高低線性反映出反義核酸對細胞生長的抑制作用。
圖中豎直條圖代表不同反義核酸樣品對A549細胞生長的不同抑制程度。control表示陰性對照，其它數字表示不同的Pac系列反義核酸樣品。實施例1．反義核酸攻擊目標的確定及反義核酸的合成在c-raf基因圖譜上選定反義核酸攻擊的位點，所選擇的位點均位于c-raf基因5′端非轉譯區及3′端非轉譯區。
使用美國PE公司應用生物系統部(AppliedBiosystems)制造的391-04型DNA-RNA合成儀及其配套試劑，以亞磷酰胺固相合成法合成硫代的(Phosphorothioate)所設計的反義核酸。合成原料均由合成儀生產廠商提供，主要原料有四種二異丙基β-氰乙基亞磷酰胺單體腺苷(A)，鳥苷(G)，胸腺嘧啶苷(T)，胞嘧啶苷(C)四種控制孔徑玻璃粉(Control Pore Glass)固相合成載體(A,G,C,T)蓋帽物試劑乙酸酐/二甲基吡啶/四氫呋喃，1-甲基咪唑/四氫呋喃硫代反應試劑二硫化四乙基秋蘭姆(TETD)/乙腈脫三苯甲基試劑三氯乙酸/二氯甲烷液體溶劑乙腈和三氯甲烷合成規模為10微摩爾，固相載體量為50微摩爾，堿基單體溶于無水乙腈中，濃度為100毫摩爾，其它試劑濃度及用量均按照儀器手冊進行。合成過程完全由電腦自動控制。
合成產物由濃氨水(28％)切割收集在密封耐壓的玻璃瓶中，于55℃,15小時進行脫保護處理。脫保護結束后用旋轉蒸發儀在40℃,0.1MPa負壓下脫去粗產品中的氨，用Pharmacia的G-25分子篩葡聚糖凝膠層析，進行純化脫鹽去除不完全的短片斷。層析產物凍干得白色粉末狀物質，儲存于-20℃。進行產品分析。1．用聚丙烯凝膠電泳方法鑒定純度及分子量；2．DNA測序法確定序列；3．P31NMR(核磁共振)確定硫代程度。實施例2．以培養細胞初步篩選反義核酸選用人體肺癌A549腫瘤細胞株作為初步篩選試驗的系統。參照Miwa,W.等的文獻(Miwa,W.et,al.(1994)BiologicalChemistry Hoppe-Seyler,375(10):705-709)對培養于1640中的腫瘤細胞進行如下處理將A549細胞分成對照組(無處理)和反義核酸處理組。在1640培養基中，將細胞接種，培養至細胞總數培養至10萬。加入濃度為10ug/ml的脂質體，處理組用800nM的反義核酸處理4小時。24小時后提取RNA進行c-raf基因mRNA的定量監測。制備c-raf基因的DNA探針與樣品進行核酸雜交(Northernblot)。(Sambrook,J.,et,al.Molecular Colning:A Laboratory Manual.2nd.ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor,N.Y.)核酸雜交的結果由Pharmacia Image Master掃描儀定量得出。以對照組細胞的c-raf mRNA含量為100％，結果如圖1所示。圖中，0號樣品為無處理組，10號樣品為陽性對照，23號樣品為陰性對照，其它為不同的Pac系列的反義核酸樣品。從圖1中可清楚地看到反義核酸Pac14,Pac16,Pac17,Pac18,Pac19,Pac21均具有不同程度的腫瘤抑制活性。實施例3．MTT法測量Pac系列反義核酸對腫瘤細胞A549生長的抑制作用將A549細胞分為對照組(無處理)及反義核酸處理組，在1640培養基培養至細胞總數為10萬，加入濃度為10ug/ml的脂質體，處理組加入反義核酸處理4小時，24小時后用MTT法測定反義核酸對細胞生長的抑制作用，用酶標儀于554nm處測定每一樣品的吸光值，數值高低線性反應出反義核酸對細胞生長的抑制作用。從圖4中可以看出，Pac系列反義核酸對A549細胞生長具有不同程度的抑制作用，其中Pac14對細胞生長有最大的抑制活性。實施例4．Pac14的化學組成結構將Pac14經碘處理，將磷酸硫酯鍵轉化為磷酸二酯鍵，然后用常規DNA測序方法測定Pac14的核苷酸組成，結果如下5′-GAG GGA GCC AGG CCG CCC CA-3′與設計序列一致。以10％聚丙烯酰胺凝膠電泳測定Pac14的分子量，結果為6500，與理論分子量6423相符。
Pac14是20個脫氧核苷以磷酸硫酯鍵相連的寡聚脫氧核苷，其攻擊位點位于c-raf基因5′端非轉譯區。實施例5．含寡核苷酸的藥物組合物作為動物(包括人類)體內給藥的反義核酸藥物組合物組成如下寡核苷酸Pac14 10mg/ml一水合磷酸-氫鈉1.73mg/ml七水合磷酸氫二鈉 14.33mg/ml氯化鈉 4.4mg/ml注射用水 適量本發明中其它幾種反義寡核苷酸可采用同樣配方。
勿用贅言，本發明的反義核酸具有很大的可能通過不同的化學修飾，采用不同的長度和不同程度同源性的序列發展為具有臨床應用價值的抗腫瘤藥物。單獨使用或與其它藥物聯合使用進行腫瘤病的治療，這些在本領域的普通技術人員看來是顯而易見的。序列表(1)．一般情況Ⅲ．序列總數6(2)．序列情況Ⅰ．序列特性A．長度20堿基B．類型核酸C．鏈接單鏈C．構型線型Ⅱ．分子類型脫氧核糖Ⅳ．是否反義核酸是Ⅵ．序列說明第1號序列Pac145′-GAG GGA GCC AGG CCG CCC CA-3′20mer(2)．序列情況Ⅰ．序列特性A．長度20堿基B．類型核酸C．鏈接單鏈C．構型線型Ⅱ．分子類型脫氧核糖Ⅳ．是否反義核酸是Ⅵ．序列說明第2號序列Pac165′-AAT CCC ATG TGT CTC CAC CT-3′20mer(2)．序列情況Ⅰ．序列特性A．長度20堿基B．類型核酸C．鏈接單鏈C．構型線型Ⅱ．分子類型脫氧核糖Ⅳ．是否反義核酸是Ⅵ．序列說明第3號序列Pac175′-AGA TGC ATT CCT CCA GAA CC-3′20mer(2)．序列情況Ⅰ．序列特性A．長度20堿基B．類型核酸C．鏈接單鏈C．構型線型Ⅱ．分子類型脫氧核糖Ⅳ．是否反義核酸是Ⅵ．序列說明第4號序列Pac185′-TGA AGA AAG TCC CGC CTG TG-3′20mer(2)．序列情況Ⅰ．序列特性A．長度20堿基B．類型核酸C．鏈接單鏈C．構型線型Ⅱ．分子類型脫氧核糖Ⅳ．是否反義核酸是Ⅵ．序列說明第5號序列Pac195′-TGT GCA AAA TGT CTG GCG CT-3′20mer(2)．序列情況Ⅰ．序列特性A．長度20堿基B．類型核酸C．鏈接單鏈C．構型線型Ⅱ．分子類型脫氧核糖Ⅳ．是否反義核酸是Ⅵ．序列說明第6號序列Pac215′-GGC CAG AGT CTC GGC AGT CC-3′ 20mer
權利要求
1．一種寡聚反義脫氧核糖(DNA)或核糖(RNA)，其特征在于可特異性結合c-raf基因mRNA的不同區域，所述寡核苷酸序列選自1．Pac14:5′-GAG GGA GCC AGG CCG CCC CA--3′2．Pac16:5′-AAT CCC ATG TGT CTC CAC CT-3′3．Pac17:5′-ACA TGC ATT CCT CCA GAA CC-3′4．Pac18:5′-TGA AGA AAG TCC CGC CTG TG-3′5．Pac19:5′-TGT GCA AAA TGT CTG GCG CT-3′6．Pac21:5′-GGC CAG AGT CTC GGC AGT CC---3′及其同源序列。
2．權利要求1中的反義寡核苷酸，其中所述同源序列與序列1-6有至少70％的同源性。
3．權利要求1中的反義寡核苷酸，其中所述同源序列與序列1-6有至少80％的同源性。
4．權利要求1中的反義寡核苷酸，其中所述同源序列與序列1-6有至少90％的同源性。
5．含有權利要求1中的反義寡核苷酸序列及可藥用載體的藥物組合物。
6．權利要求1的寡核苷酸用于制備抗腫瘤藥物的用途。
全文摘要
本發明闡述用化學方法合成一系列序列特異的反義寡核苷酸,其堿基排列順序與人體內c－raf基因的一段序列互補,這些寡核苷酸可在細胞內特異地與人體c－raf基因的信使核糖核酸(mRNA)雜交,從而阻止c－raf基因編碼的c－raf激酶的表達,達到抑制腫瘤細胞增長的作用。這些反義寡核苷酸可用來發展成為抑制人體腫瘤生長的藥物。
文檔編號A61K48/00GK1221749SQ97125789
公開日1999年7月7日 申請日期1997年12月30日 優先權日1997年12月30日
發明者胡前進 申請人:杭州賽獅生物技術開發有限公司北京分公司, 梁民