專利名稱：一種腫瘤標志物cd25自身抗體及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫學技術領域，是一種用于制備腫瘤早期診斷試劑和開發治療腫瘤的靶向藥物。
背景技術：
大量研究表明，血清或血漿中的腫瘤相關抗原能誘導機體產生自身抗體，在腫瘤患者血清中既存在腫瘤抗原，也存在針對該腫瘤抗原的自身抗體。因此，既可以利用抗體檢測腫瘤抗原，也可以利用抗原檢測腫瘤自身抗體，但利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高得多。很多腫瘤相關抗原不僅在腫瘤患者體內存在，在正常人體內也存在，因此檢測腫瘤相關抗原作為診斷依據可信性差。而自身抗體在正常人體內含量很低檢測不到或根本不存在，若體內自身抗體水平明顯增高，則表明體內存在異常免疫情況，表明體內相關抗原水平發生波動，預示疾病的存在或原有疾病加重。近年來的研究表明，在惡性腫瘤體積發展到可用現代影像學技術檢出之前3-5 年，患者血中可出現高濃度的腫瘤相關抗原自身抗體。因此,檢測血中腫瘤相關抗原自身抗體具有預測腫瘤發病風險和早期診斷腫瘤的重要價值。是腫瘤臨床診斷領域的重點發展方向之一。在國外已有診斷肺癌和乳腺癌的早期診斷試劑盒市售。然而，目前所報道的抗體檢測方法敏感度低，特異性差，假陰性比率可高達50%以上。其主要原因是由于每一種腫瘤相關抗原自身抗體在患者中的陽性檢測率平均在10%左右。如何提高診斷試劑敏感度是當前需要亟待解決的關鍵問題。比較行之有效的方法是尋找新的可充當腫瘤標志物的自身抗體，然后與現有已知的自身抗體組合成具有敏感度高和特異性強的診斷試劑盒。腫瘤可通過各種直接或間接的機制來逃避機體免疫系統的監控。一系列的研究已經證明，調節性Treg細胞與腫瘤免疫逃避機制密切相關。在肺癌、乳腺癌、卵巢癌以及出現淋巴結轉移的黑色素瘤患者的外周血淋巴細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞中，存在Treg細胞比例增高現象。Treg通過細胞與細胞直接接觸或通過細胞因子的釋放，對效應性CD4+/CD8+T 細胞活化和增殖發揮抑制作用。其效應機制主要是抑制CD4+T細胞增生、抑制腫瘤特異性抗原激活的⑶4+效應細胞分泌IL-2，抑制⑶8+IFN 2C和TNF2A產生，并在腫瘤微環境中能限制CTLs細胞毒性顆粒釋放，使腫瘤細胞逃逸免疫殺傷。本發明中的CD25是Treg細胞的主要表面標志物。調節性Treg細胞是來源于胸腺的⑶4+T細胞，其組成性表達的IL 2受體的α鏈被命名為⑶25，⑶25是Treg細胞活化的重要標志。⑶25作為I型跨膜蛋白對多種T細胞和B細胞活化亦發揮關鍵作用。CD25與CD122共同組成高親和力的IL 2受體，它們可溶性受體即SIL-2R被證實與多種腫瘤發生相關，已成為幾種腫瘤發生進展的臨床標志物。 國內外研究顯示，在⑶4+/⑶25+Τ細胞中，只有⑶4+/⑶25hight細胞才是具有免疫抑制功能的Tregs。同時研究發現肺癌、卵巢癌、胃腸道腫瘤等多種腫瘤患者外周血和腫瘤局部 Tregs增加。Tregs通過抑制活化的T細胞，限制免疫反應的發生，從而在維持腫瘤免疫耐受中發揮重要作用。動物實驗已證實，給荷瘤小鼠應用抗CD25單抗可抑制動物體內Tregs，可提高小鼠抗腫瘤免疫功能。體外實驗證實從外周血中去除Tregs，可以產生更多的細胞毒細胞，包括CTL和LAK/NK細胞等。最新研究發現，在腦膠質瘤患者中隨疾病進程，CM+/ F0XP3+Tregs細胞時間依賴性增加的同時伴隨⑶25的高度表達，而應用抗⑶25單抗可顯著抑制⑶4+/FOXP3+Tregs細胞的增加。本發明通過自行設計的⑶25的抗原表位多肽，檢測腫瘤患者血清及血漿中自身抗體水平并開發相應的試劑，預測腫瘤發生的危險性，并為腫瘤新藥研究提供可靠的數據。

發明內容
本發明要解決的技術問題是公開一種腫瘤標志物CD25自身抗體。本發明同時公開了⑶25自身抗體的用途。本發明提供的一種腫瘤標志物CD25自身抗體的氨基酸序列為EIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVE 純度> 95 %，pH > 7. O。本發明所述的CD25抗原多肽在制備預測腫瘤早期診斷試劑盒中的應用。本發明利用自行設計的CD25蛋白的線性多肽，采用ELISA法檢測肺癌和食管癌患者血清及血漿中抗CD25蛋白的特異性自身IgG抗體。自身IgG抗體水平升高表明腫瘤患者體內CD25蛋白的表達量增加，預示患者可能出現原發性或繼發性腫瘤，可以預測腫瘤發生與復發的危險性，指導臨床醫生對腫瘤的早期診斷。⑶25蛋白質氨基酸序列見Tab. ITab. I 0)25抗原多肽序列表
縮寫 CD25 ETYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVE 純度 >95%, pH>7.0抗原抗體的結合實際上只發生在抗原決定簇和抗體的抗原結合位點之間，兩者在空間結構和空間構型上完全互補。因此抗原決定簇就可以代表整個蛋白與抗體結合的狀態與親和特性。另外，以重組蛋白為抗原，要經過載體構建、轉染、表達、篩選、純化等繁瑣的過程，蛋白空間結構復雜，抗原表位不易暴露，因此抗原抗體結合的特異性差。另外，ELISA法的高靈敏性對純化技術的穩定性要求極高，成本昂貴。發明人遵循以下原則設計線性多肽抗原①選擇細胞膜蛋白表面區域選擇不形成a-helix的序列；③兩端的肽段比中間的排列合理；④避免蛋白內部重復；⑤避免同源性強的肽段；⑥序列中盡量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro，但有1_2個Pio利于肽鏈結構穩定，對產生特異性抗體有益。此外，該多肽抗原必須含有人類白細胞二類抗原(HLA) 系統的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DP and HLA-DQ的限制性表位。這些表位可被90% 以上華人群體的HLA 二類抗原系統所識別。基于以上抗原設計原則及CD25蛋白的生物學特性，本發明利用生物信息學和多個表位預測模擬軟件，分析與抗原性相關的參數，設計了的線性氨基酸序列(見Tab. I)。加框部分是多肽片段在蛋白質中的位置。CD25 interleukin-2 receptor subunit alpha precursor[Homo sapiens]I mdsyllmwglltfimvpgcqaelcdddppeiphatfkamaykegtmlnceckrgfrriks
權利要求
1.一種腫瘤標志物CD25自身抗體，其特征在于氨基酸序列為 EIYHFVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVE 純度> 95 %，pH > 7. O。
2.根據權利要求I所述的腫瘤標志物CD25自身抗體在制備預測腫瘤早期診斷試劑盒中的應用。
全文摘要
一種腫瘤標志物CD25自身抗體及應用，屬于免疫學技術領域，本發明提供了一種免疫應答調節基因CD25的抗原氨基酸序列。應用CD25多肽抗原檢測肺癌和食管癌患者血中相應的特異性自身抗體，這種自身抗體可作為為腫瘤標志物評估肺癌和食管癌發生的危險度。這種抗原多肽及其抗體可用于制備腫瘤早期診斷試劑和開發治療腫瘤的靶向藥物。
文檔編號C07K16/28GK102585000SQ20121004117
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月22日 優先權日2012年2月22日
發明者關松磊, 劉寶剛, 孫世龍, 尉軍, 李光輝 申請人:尉軍