專利名稱：反基因V－erbB寡核苷酸及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及反基因V-erbB寡核苷酸，其多肽產物，包含其的藥物組合物及其在診斷和治療骨髓增生異常綜合征、白血病和其他多種腫瘤中的應用。
基因治療是近十多年來發展起來的疾病治療新技術，它是通過糾正致病基因的異常或用新的基因進行替換的辦法達到治療疾病的目的。鑒于目前腫瘤治療手段的局限性和不徹底性，乃至多數腫瘤患者治療后若干年便復發和死亡，人們對腫瘤的基因治療抱有很高的期望。然而現有技術中用病毒載體將正常基因導入體內的方法，雖有某些療效，但面臨一系列難題。而用反義寡核苷酸硫代磷酸酯作基因治療則避免了因使用病毒載體而帶來的一系列問題。硫代磷酸所帶來的某些毒性是人體可接受和能克服的，因而十分安全。然而，由于反義寡核苷酸是針對癌細胞靶基因的mRNA而設計的，而癌細胞能源源不斷地從細胞核內產生mRNA，因而不可能有鞏固的療效。而在此基礎上發展起來的反基因寡核苷酸則針對癌基因的特定的突變位置而設計，使之進入細胞后能在細胞核內形成鞏固的DNA三鏈結構而抑制該基因的表達和擴增，從而為腫瘤基因治療帶來新的希望。
骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)俗稱白血病前期(preleukemia)，是一組惡性的骨髓造血干細胞病，多數病人骨髓增生過度但分化成熟障礙，因而其外周血中有形成分減少，出現貧血、出血、血細胞減少及頭暈、乏力等癥狀。多數病人診斷后若干月或若干年發展為急性白血病，且無有效治療方法。
已知V-erbB和V-erbA為雞原始紅細胞增多癥(AvianErythroblastosis)病毒癌基因。前者同源于表皮生長因子受體(EGFR)基因，具有轉化紅系祖細胞的功能；后者具有阻斷上述紅系祖細胞分化成熟的作用。二者協同作用導致雞原始紅細胞增多癥或稱紅白血病。
骨髓增生異常綜合征(MDS)具有五個不同亞型，其中難治性貧血(Refractory Anemia，RA)是其基本型。它可以轉化為原始粒細胞增多RA(即RAEB)和轉化中的RAEB(即RAEBT)和急性白血病(Acute Leukemia，AL)。RAEBT患者骨髓中原始和早幼紅細胞增多時還可以再診斷為紅白血病而與上述雞紅白血病相同。RA患者骨髓單一紅系統過度增生時亦可診斷為紅血病。而紅血病可以發展為紅白血病。說明紅血病—紅白血病與MDS—RA和RAEB、RAEBT等并無本質區別。提示V—erbB和V—erbA之血細胞副本C—erbB和C—erbA異常可能在人MDS、白血病發病中起重要作用。
以往的研究業已證明，人外周血淋巴細胞染色體脆性部位(Fragile Site，FS)高表達提示腫瘤易感性。腫瘤患者FS往往與腫瘤細胞染色體斷點以及癌基因位置相同或相近。本發明人發現一例白血病前期患者外周淋巴細胞表達Fra(7)(P11)和Fra(3)(P14)等。Fra(7)(P11)與C—erbB相毗鄰，患者骨髓紅系病態造血(Myelodysplasia)明顯，因而高度懷疑C—erbB受累。于是，本發明人選用V—erbB和V—erbA作探針進行Southetn印跡雜交，證明MDS與C—erbB重排/擴增和C—erbA缺失/失活相關，雜交結果有診斷和治療意義。在此基礎上，本發明人應用V—erbB PCR和正基因寡核苷酸原位雜交方法，進而確定C-erbB重排位置，其PCR產物和原位雜交結果均有診斷和發病學意義。由此完成本發明。
因此，本發明的第一個目的在于提供應用反基因技術原理用于治療MDS、白血病和其他多種腫瘤的反基因寡核苷酸及其較短的副本。所述的反基因寡核苷酸是針對V-erbB DNA序列中可疑的重排位置即原位雜交中所用正基因寡核苷酸而設計合成的反基因寡核苷酸。
本發明的第二個目的在于提供一種藥物組合物，其包括本發明的寡核苷酸及一種藥物學可接受的載體，用于治療MDS、白血病和其他多種腫瘤。
本發明的第三個目的在于提供一種反基因寡核苷酸組合(配方)，其包括本發明的寡核苷酸和與癌癥發病相關基因的反基因寡核苷酸。
本發明的第四個目的在于提供與所述反基因寡核苷酸相對應的正基因寡核苷酸，其能用于診斷MDS、白血病和其他多種腫瘤。
本發明的第五個目的在于由本發明的反基因或正基因寡核苷酸轉錄得到的mRNA，及所述mRNA表達的多肽，包含該多肽的疫苗。
具體地說，首先本發明涉及反基因V-erbB寡核苷酸，其能用于治療MDS、白血病和其他多種腫瘤。所述的寡核苷酸具有如下核苷酸序列5′ATGGCAGAGCTGGCAAAC(SEQ ID NO1)5′AATTCTCAGGTGGGCCTG(SEQ ID NO2)本發明的反基因V—erbB寡核苷酸是朝著C-erbB的重排部位而設計合成的，因其與正基因C—erbB重排部位堿基互補而能靶向地結合并抑制正基因C—erbB的異常表達或轉錄，或者同正基因C—erbB mRNA結合而阻斷其翻譯為致癌性蛋白。因此，運用本領域人員公知的反基因技術，本發明的寡核苷酸可用于治療C—erbB重排/擴增和C—erbA缺失/失活相關的MDS、白血病及其他多種腫瘤。在本發明的一個優選實施方案中，本發明的寡核苷酸經硫代磷酸修飾，這種修飾后的產物具有抑制核酸酶的作用并使其達到細胞內的靶位置。
因此，本發明的另一方面涉及包含SEQ ID NO1和/或SEQ IDNO2的寡核苷酸及藥物學可接受的載體的藥物組合物，所述的藥物組合物可給予MDS、白血病及其他多種腫瘤患者，藥物組合物中包含的載體可以是本領域熟知的載體或賦形劑。一種反基因寡核苷酸組合(配方)，其包括本發明的寡核苷酸和與癌癥發病相關基因的反基因寡核苷酸。
已知骨髓中原始和早幼粒細胞比例的增加，不僅是MDS轉白血病，也是慢性粒細胞白血病急性轉變的集中表現，同時也是白血病原發和復發的集中表現。從以下實施例可知運用本發明的反基因V—erbB寡核苷酸能快速而有效地使MDS模型大鼠骨髓中原始和早幼粒細胞降低到正常水平(≤5％)，從而為基因治療MDS等惡性腫瘤疾病提供了一種途徑。
根據本發明的另一方面，本發明還涉及與所述的反基因寡核苷酸相對應的正基因寡核苷酸，所述的正基因寡核苷酸經標記后例如可以用作診斷探針，與骨髓細胞樣品進行原位雜交以判斷個體是否患有MDS等惡性腫瘤。或者應用本發明人發明的引物，經V-erbBPCR方法檢測患者骨髓的C—erbB基因異常與否，從而診斷MDS等惡性腫瘤。所述的正基因寡核苷酸可以以本領域已知的任何方法進行標記，如生物素、地高辛等。
與病毒介導的基因治療相比，用本發明的反基因寡核苷酸作基因治療有許多優點。除了作用快速，操作簡便外，沒有因載體(如逆病毒或腺病毒)DNA或RNA的導入細胞而帶來一系列難以評估的不良后果是最大的優點。本發明的寡核苷酸的作用特點是癌基因重排位置的原位修復，而非導入外源基因，因而它不同于一般的反義基因治療。后者是針對癌基因mRNA而設計合成反義寡核苷酸，而由于癌細胞能源源不斷地從細胞核內產生mRNA，所以有限的反義寡核苷酸的治療作用是有限和短暫的。
以下將參照附圖和實施例詳細描述本發明。


圖1顯示實施例2中用本發明的反基因V—erbB寡核苷酸治療后大鼠MDS的效果。
圖2顯示實施例2中用本發明的反基因V—erbB寡核苷酸治療后，大鼠MDS血象恢復正常。
圖3顯示實施例2中用本發明的反基因V—erbB寡核苷酸治療過程中大鼠MDS體重增加。
實施例1反基因和正基因V—erbB寡核苷酸的合成在DNA合成儀(型號394型，來源PE公司)上自動合成如下的寡核苷酸5′ATGGCAGAGCTGGCAAAC(SEQ ID NO1)5′AATTCTCAGGTGGGCCTG(SEQ ID NO2)實施例2反基因V-erbB寡核苷酸治療MDS的效果選擇幼年天津大鼠(TR，來自天津醫科大學動物室)和Wistar大鼠(WR，來自軍事醫學科學院營養所動物室)各10只，分為4組，每組5只。按以往的方法(馮寶章等，中國實驗血液學雜志，1996，4(3)309)，經尾靜脈注射二甲基苯蒽(DMBA)。TR二組中一組為空白對照，另一組為實驗組，每只動物每周注射1次，連續注射4次。WR二組中第一組和第二組分別注射1次和3次。而后觀察各組動物發病情況。
根據以往的工作，3次注射DMBA的大鼠有9/14發生MDS。注射后2個月發病，并有3-4個月MDS期。選擇3次注射DMBA的Wistar大鼠作基因治療模型。
將實施例1合成的2條反基因V—erbB寡核苷酸，經磷酸硫代修飾。使用之前用生理鹽水溶解，濃度為10.0OD/ml,MDS大鼠每天尾靜脈注射1次，連續注射3天。劑量為0.56mg/kg體重。
在對3次給藥組(5只)進行觀察過程中，發現2只WR幾乎同時發病并診斷為MDS—RA(即難治性貧血)。當它們從RA發展到RAEB(原始細胞增多型RA)階段時，將其中1只(WR1)選作基因治療實驗鼠，另一只(WR2)作為對照鼠。實驗鼠經尾靜脈注射V—erbB反基因寡核苷酸，每天1次，連續3天為一個療程。而后進行觀察。注射反基因寡核苷酸后1個月左右，發現對照鼠精神萎摩不振，且見尾根部生長3—4公分大小的瘤子(病理檢查確認為肉瘤)。骨髓檢查確診為紅白血病，并死于尿路受肉瘤壓迫而致的尿潴留。而實驗鼠不僅精神好，而且骨髓檢查發現實驗鼠的原始和早幼粒細胞從V—erbB反基因寡核苷酸治療前的13.0％下降為3.0％。血象和骨髓象明顯改善。反基因治療后3個月再作骨髓象和血象檢查時發現二者均正常。詳見圖1、2。初步結果說明，本發明的反基因寡核苷酸對大鼠MDS有良好的療效，而治療前后體重檢查結果說明此反基因寡核苷酸毒性不明顯(圖3)。將此只雄性實驗鼠與1只未孕的雌性Wistar大鼠同窩喂養48天后，雌鼠生育一胎14只健康活潑的幼仔，進一步說明本發明的反基因寡核苷酸雖經硫代但毒性不顯且安全性能好。
本發明的反基因V—erbB寡核苷酸不同給藥次數和方案對大鼠MDS骨髓的影響見表1。從表1可見，進行治療的16只大鼠原始和早幼粒細胞均有明顯下降，其中15只大鼠的骨髓象恢復正常。并且本發明的兩種寡核苷酸單獨給藥或聯合給藥均有療效。而對照鼠(0—0，B—7)骨髓原始和早幼粒細胞百分比上升，提示疾病在進展。隨后應用相同的劑量，1—3個療程對8只MDS—RAEB大鼠進行口服治療，取得與上述相同的結果。局部用藥治療3例食管癌和2例宮頸癌早期病人均有效，使重度增生逆轉為正常。表1 16只大鼠MDS注射本發明的反基因寡核苷酸(B1和B2)后骨髓變化的觀察MDS MDS注 射后 骨髓原始＋早幼粒細胞％給藥方法大鼠 亞型 觀察時間(月) 治療前治療后(變量)WR 0-0 RAEB 3.0 10.021.0(-11.0) 0B-0 RAEB 3.0 13.53.0(10.5) B1，B2×3B-1*RAEB 2.5 15.0無惡性細胞 B1，B2×3B-4 RAEB 2.5 11.06.0(5.0)B1，B2×2B-7 RAEB 2.5 11.516.0(-5.5) 0A-4 RAEB 3.0 17.012.0(5.0) B1，B2×2C-2 RAEB 3.5 9.0 5.0(4.0)B1，B2×3C-8 RAEB 3.5 8.5 4.5(4.0)B1，B2×3D-3 RAEB 3.0 13.06.0(7.0)B1，B2×1D-5 RAEB 3.0 9.5 2.5(7.0)B1，B2×1E-2 RAEB 3.0 7.0 4.5(2.5)B2×3E-5 RAEB 3.0 6.5 3.0(3.5)B2×1D-4 RAEB 2.5 6.5 2.5(4.0)B1，B2×1D-1 RAEB 2.5 9.5 2.0(7.5)B1×3D-2 RAEB 2.5 11.53.0(8.5)B1×3F-5 RA 2.5 5.0 1.0(4.0)**B1，B2×1F-1 RAEB 2.5 7.5 1.5(6.0)B1，B2×1TR G-2RAEB 1.0 10.05.0(5.0)B1，B2×3*該鼠觀察期間死于炎癥**該鼠在尾部發生肉瘤，轉移至骨髓如上所述，我們建立的大鼠MDS模型同時也是肉瘤等其他腫瘤模型。本發明的V-erbB反基因寡核苷酸對MDS有良好療效，對其他腫瘤看來也有療效。鑒于腦膠質瘤有C-erbB基因擴增，應用本發明的V-erbB反基因寡核苷酸治療其早期病變可能也有相似的療效。常見惡性腫瘤如食管癌、胃癌、肺癌和宮頸癌等的早期病變看來也有療效，因為它們均有與MDS相同的C-erbB重排/擴增。
實施例3用V—erbB正基因寡核苷酸診斷MDS的效果1.原位雜交法檢測如實施例1所述合成對應于SEQ ID NO1的V—erbB正基因寡核苷酸，并用地高辛(DIG)標記該寡核苷酸，采用該標記的寡核苷酸作為探針，經原位雜交方法檢測了33例MDS和19例對照及3例可疑MDS的C—erbB基因的擴增情況，結果顯示全部33例MDS的原位雜交均呈陽性，19例對照組中有1例呈陽性，3例可疑MDS均為陽性。
2.PCR方法A.按常規方法提取骨髓細胞模板DNA。
B.以5’CACTGTGTGAAGGCCTGC(P1)和5’CTTATAAATAGTGCCAAAAGC(P2)為引物，97℃7分鐘進行模板變性，然后進行32個循環，每個循環中變性條件為94℃0.5分鐘，退火條件為52℃1分鐘和延伸條件為72℃2分鐘。最后一次循環后72℃延伸5分鐘。PCR產物在1.8％瓊脂糖凝膠上電泳檢測。根據電泳帶型作基因診斷。
依照上述方法檢測了23例MDS和25例對照及3例可疑MDS的C-erbB基因的重排情況，結果23例MDS中有18例PCR結果呈陽性，25例對照中有1例為陽性，3例可疑MDS中有2例為陽性。
權利要求
1一種反基因寡核苷酸，具有如下核苷酸序列5′ATGGCAGAGCTGGCAAAC(SEQID NO1)5′AATTCTCAGGTGGGCCTG(SEQ ID NO2)。
2如權利要求1所述的反基因寡核苷酸，其特征在于包括所述的寡核苷酸特異的mRNA。
3一種與權利要求1所述的反基因寡核苷酸互補的正基因寡核苷酸。
4一種經權利要求2所述的寡核苷酸制備的多肽疫苗。
5一種藥物組合物，它含有權利要求1所述的反基因寡核苷酸以及藥物學上可以接受的載體。
6一種反基因寡核苷酸組合(配方)，它含有權利要求1所述的寡核苷酸和癌癥發病相關基因的反基因寡核苷酸。
7一種診斷試劑盒，它含有權利要求3中所述的寡核苷酸。
8權利要求1中所述的反基因寡核苷酸在制備治療骨髓異常增生綜合征、白血病和其他多種腫瘤藥物中的應用。
9權利要求3中所述的寡聚核苷酸在制備用于診斷骨髓異常增生綜合征基因診斷試劑中的應用。
10一對PCR引物序列，具有如下核苷酸序列5’-CACTGTGTGAAGGCCTGC-3’，和5’-CTTATAAATAGTGCCAAAAGC-3’。
全文摘要
本發明涉及反基因V－erbB寡核苷酸,其多肽產物,包含其的藥物組合物及其在診斷和治療骨髓增生異常綜合征、白血病和其他多種腫瘤中的應用。
文檔編號C07K14/435GK1326938SQ0010902
公開日2001年12月19日 申請日期2000年6月1日 優先權日2000年6月1日
發明者馮寶章 申請人:馮寶章