硒代蛋氨酸用于制備治療阿爾茨海默癥藥物的用途
【專利摘要】本發明涉及一種硒代蛋氨酸用于制備治療阿爾茨海默癥藥物的用途，具體的，硒代蛋氨酸具有提高動物學習記憶能力、抑制腦內Aβ的聚集以及Tau蛋白及其磷酸化水平、降低動物體腦內GSK-3β表達、降低腦內炎癥反應，緩解神經細胞的突觸損傷，提高腦內SOD的活性及還原性谷胱甘肽含量的功效。硒代蛋氨酸對阿爾茨海默癥具有顯著性的治療作用，且治療作用穩定。是臨床上治療阿爾茨海默癥藥物的一個很好的選擇。
【專利說明】砸代蛋氨酸用于制備治療阿爾茨海默癥藥物的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及藥物治療疾病領域。具體的涉及一種硒代蛋氨酸用于制備治療阿爾茨海默癥藥物的用途。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默癥的高發病率、高危害性給患者及社會帶來了沉重的負擔，現有技術中硒酸鈉和亞硒酸鈉對阿爾茨海默癥具有一定的治療作用，但其缺點是在生物體內具有較強的毒性，生物利用率低，治療作用不夠穩定。
[0003]故目前迫切需要找到適合于臨床的有效治療藥物。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種治療阿爾茨海默癥的藥物。
[0005]為實現上述目的，本發明提供一種硒代蛋氨酸(Se-Met)用于制備治療阿爾茨海默癥藥物的用途。
[0006]本發明保護了一種硒代蛋氨酸用于制備治療阿爾茨海默癥藥物的用途。
[0007]本發明還保護了一種硒代蛋氨酸用于制備提高動物學習記憶能力的藥物的用途。
[0008]本發明還保護了一種砸代蛋氣Ife用于制備抑制腦內A β的聚集以及Tau蛋白及其磷酸化水平的藥物的用途。
[0009]本發明還保護了一種硒代蛋氨酸用于制備降低動物體腦內GSK_3i3表達的藥物的用途。
[0010]本發明還保護了一種硒代蛋氨酸用于制備降低腦內炎癥反應，緩解神經細胞的突觸損傷的藥物的用途。
[0011]本發明還保護了一種硒代蛋氨酸用于制備提高腦內SOD的活性及還原性谷胱甘肽含量的藥物的用途
[0012]本發明還保護了一種含有所述硒代蛋氨酸的藥物，其特征在于，給藥方式為通過加入飲用水方式給藥。針對鼠，其濃度為6ug/ml，通過加入飲用水方式持續12周時間。
[0013]本發明所述硒代蛋氨酸的藥物，其特征在于，所述藥物是膠囊或藥片形式。還可以是其他藥物形式。比如液態注射劑，液態口服劑、藥丸等多種形式。
[0014]所述硒代蛋氨酸具有極強的抗氧化性，是機體攝入硒的主要化合物之一，在機體內的生物活性高、利用率高，毒性低。
[0015]通過動物實驗證明硒代蛋氨酸對阿爾茨海默癥具有顯著性的治療作用，且治療作用穩定。
[0016]本發明的實施例從細胞水平和動物水平兩個方面驗證了硒代蛋氨酸對于阿爾茨海默癥的治療作用。
[0017]細胞水平:
[0018]1、硒代蛋氨酸對N2A細胞(小鼠神經瘤細胞)的增值活力表現為低促高抑，但硒代蛋氨酸的可用的有效濃度范圍較大(O~50uM)。
[0019]2、硒代蛋氨酸可以顯著性的降低A β 1-42所誘導得Ν2Α細胞的腦內ROS水平，抑制Ν2Α細胞的凋亡。
[0020]動物水平上:
[0021]1、硒代蛋氨酸可以明顯提高4月齡AD小鼠認知能力，緩解腦內Αβ和Tau的聚集，抑制Tau蛋白過度磷酸化，降低腦內炎癥反應，降低腦內氧化應激水平及突觸損傷，在一定程度上改善和減緩了 AD的發病進程。
[0022]2、硒代蛋氨酸能夠明顯改善8月齡AD小鼠學習記憶能力，降低腦內Tau的聚集及其過度磷酸化，修復受損的突觸蛋白，降低腦內炎癥反應，提高腦內抗氧化能力，對AD有明顯的治療效果。
[0023]3、硒代蛋氨酸能夠降低腦組織中GSK3 0的表達水平，從而抑制Tau蛋白的過度磷酸化，從而改善轉基因AD小鼠的相關病理特征。
[0024]硒代蛋氨酸對AD治療的各個病理指標變化的結果如下:
[0025]1、Αβ所導致的腦內老年斑是AD的顯著特征
[0026]2、Tau及其磷酸化位點蛋白的過表達是導致AD出現腦內神經纖維纏結的主要原因
[0027]3、星形膠質細胞的標記物GFAP反應AD腦內的炎癥水平
[0028]4、SOD活力、還原性谷胱甘肽含量反應了腦內的抗氧化水平
[0029]5、突觸前蛋白synaptophysin及突觸后蛋白PSD95在腦內的表達水平反映AD腦內的神經元的突觸傳遞受損情況
[0030]6、水迷宮實驗能夠直接的反映出AD動物的認知能力的強弱
[0031]本發明的硒代蛋氨酸可以顯著性提高4、8月齡AD小鼠的學習記憶能力、抑制腦內Αβ的聚集以及Tau蛋白及其磷酸化水平，降低腦內GSK-3 0的表達；降低腦內炎癥反應，緩解神經細胞的突觸損傷，提高腦內SOD的活性及還原性谷胱甘肽含量；因此硒代蛋氨酸能夠從各個發病指標上改善和治療AD，在臨床上具有潛在的有效治療作用。本發明的實驗結果也證明硒代蛋氨酸能夠作為特效的AD臨床治療藥物。
[0032]本發明實施例的實驗結果說明:
[0033]Morris水迷宮檢測其空間記憶能力發現=Se-Met組小鼠的游泳逃避潛伏期明顯的低于對照組，且與對照組相比其運動能力也無明顯差異；空間探索試驗檢測24h、72h記憶結果表明=Se-Met組較對照組其原平臺象限停留時間及跨越平臺次數均有所上升。這說明在Se-Met給藥治療之后，Se-Met組的三轉基因AD小鼠認知能力缺陷得到了明顯的改善，也進一步證明了 Se-Met在不改變小鼠運動能力的情況下，可以顯著的延緩認知障礙的發生。接著免疫熒光檢測海馬區A β的表達發現:Se-Met組的A β斑塊數量顯著少于對照組，這表明Se-Met可以降低腦內Aβ表達。而western-blot檢測腦內BACEl蛋白表達發現:無論海馬區還是皮層區，其表達水平無明顯變化。免疫熒光檢測Tau蛋白陽性表達發現，在Se-Met組的海馬和皮層區中Tau蛋白的陽性率顯著下降。免疫熒光檢測海馬區Tau-ps404蛋白發現，Se-Met組較其對照組Tau_ps404的陽性率明顯降低。Western-blot檢測小鼠腦內海馬和皮層區的Tau蛋白及其各位點磷酸化蛋白表達水平發現:對照組與Se-Met組均無明顯差異，進一步檢測了不可溶性的Tau蛋白表達水平，其結果表明Se-Met組明顯低于對照組。因此，以上Tau蛋白及其磷酸蛋白檢測結果指出:Se-Met可以顯著降低腦內Tau蛋白及磷酸化蛋白(Tau-ps404)的表達，且在早期治療過程中，其可能是通過降低不可溶性的Tau及其磷酸化蛋白從而降低Tau及其相關蛋白的表達,延緩神經纖維纏結的形成。
[0034]上述檢測結果說明，Se-Met對AD的兩大主要病理特征AP和Tau都有明顯的緩解作用，然后我們利用免疫熒光檢測了腦內的炎癥水平即星形膠質細胞的表面標記物GFAP的表達。檢測結果表明=Se-Met組的GFAP表達量顯著低于對照組；且Se-Met在一定程度上也改善了星形膠質細胞結構的病變；這說明Se-Met可以明顯的降低腦內炎癥水平。根據炎癥水平的顯著變化，我們又用Western-blot檢測突觸前、后蛋白(Synaptophysin、PSD95)表達水平發現=Se-Met組的海馬區和皮層區神經元突觸前后蛋白表達水平顯著高于對照組。因此，Se-Met在一定程度上能夠抑制神經元突觸受損，從而延緩認知障礙的發生。且在Se-Met組小鼠腦內的海馬及皮層區，SOD活性較對照組有所增加，NO,MDA含量并無明顯變化；在谷胱甘肽檢測中發現，在總谷胱甘肽無明顯差異的情況下，Se-Met組的還原性谷胱甘肽含量顯著高于對照組。這些結果進一步說明了 Se-Met可以抑制腦內氧化應激，降低炎癥水平，延緩突觸受損的發生。
[0035]從4月齡AD小鼠治療后的檢測結果發現，Se-Met對AD小鼠有明顯的早期治療效果。為了深入的研究Se-Met在AD小鼠中的治療作用，接下來我們進一步檢測了其對8月齡AD小鼠的治療結果。Morris水迷宮檢測其空間記憶能力發現:與4月齡一致，在不影響實驗小鼠運動能力的條件下，Se-Met可以明顯降低小鼠游泳的逃避潛伏期，而空間探索試驗檢測24h、72h記憶結果也表明=Se-Met組較對照組其原平臺象限停留時間及跨越平臺次數均有上升。這說明在Se-Met給藥治療之后，8月齡Se-Met組的AD小鼠認知能力缺陷得到了明顯的改善，空間記憶能力顯著提升。在4月齡檢測結果中我們發現，Se-Met治療后，AD小鼠腦內Tau蛋白的相關病理指標發生了顯著性的變化，因此我們重點檢測了小鼠腦內Tau及其磷酸化蛋白的表達情況。免疫熒光檢測Tau蛋白陽性表達發現，Tau蛋白的陽性率在Se-Met組的海馬區和皮層區中顯著下降。免疫熒光檢測海馬區Tau-ps404蛋白發現，Se-Met組較其對照組Tau-ps404的陽性表達顯著降低，且與4月齡結果一致。為進一步驗證以上結果，我們同樣用Western-blot定量檢測了腦內Tau及Tau_ps404蛋白的表達水平。我們發現在8月齡實驗組中，在腦內海馬區或皮層區，無論是可溶性還是不可溶性的Tau及Tau-ps404蛋白，Se-Met組較對照組都有顯著性降低。因此我們可以得出:Se-Met可以顯著性的降低腦內Tau蛋白及其磷酸化蛋白的表達，且Se-Met可以同時降低可溶與不可溶性Tau蛋白的表達水平，從而減少腦內的神經纖維纏結。
[0036] 接著發明人同樣檢測了腦內的炎癥水平，免疫熒光檢測結果表明:Se-Met組的GFAP陽性率顯著低于對照組；且Se-Met在一定程度上也改善了星形膠質細胞結構的病變；這表明Se-Met在AD發病的中后期同樣可以顯著性的降低腦內炎癥水平。且Western-blot檢測突觸前、后蛋白(Synaptophysin、PSD95)表達水平發現:與4月齡結果一致，Se-Met組的海馬區和皮層區神經元突觸前后蛋白表達水平也顯著高于對照組。因此，在發病期Se-Met在一定程度上能夠恢復神經元突觸受損，從而改善認知記憶能力。進一步檢測Se-Met治療后腦內氧化應激水平發現:總谷胱甘肽在腦內海馬和皮層區無明顯差異，但Se-Met組的還原性谷胱甘肽含量顯著高于對照組。這表明Se-Met的抗氧化功效在AD的后期治療中起了重要的作用，通過提高還原性谷胱甘肽的含量，從而在機體內起到抗氧化的效果。
[0037]通過4、8月齡給藥治療及一系列AD常規指標的檢測， 申請人:發現=Se-Met不僅可以在AD發病早期延緩其發病進程，且在發病后期具有明顯的治療作用。整合結果分析其治療機制，不難得出:Se-Met在體內可以降低AP、Tau及其磷酸蛋白的表達水平，抑制老年斑、及神經纖維纏結的形成，逆轉突觸蛋白的降低，降低腦內的炎癥水平，并通過提高還原型谷胱甘肽的含量發揮抗氧化功能，從而達到緩解和改善認知及記憶能力障礙的治療效果。GSK-3P是AD發生過程中一個重要的激酶，腦內炎癥反應的增強能夠激活其過量表達；且體外研究表明，GSK-3P可參與并調控腦內Tau蛋白及其磷酸化蛋白的表達水平[34]。因此，通過Western-blot檢測發現,在4、8月齡實驗組中，給藥組的可溶性GSK-3 ^表達水平顯著降低，但不可溶性的GSK3P無明顯變化；這是由于在正常生理活動中GSK-3P蛋白是以可溶性移動蛋白發揮生理功能，而不可溶性的GSK-3P蛋白往往是沒有生理功能的膜結合蛋白等[36]，這與本發明實驗所得到的結果是一致的，且在本發明的實驗中GSK-3P可能是Se-Met對AD治療機制中的一個關鍵激酶。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為硒代蛋氨酸對N2a細胞增殖的影響圖；
[0039]圖2為硒代蛋氨酸、A ^ !_42對N2a細胞ROS的影響圖；
[0040]圖3為硒代蛋氨酸、A卟42對N2a細胞早期凋亡影響的檢測圖。
[0041]圖4為硒代蛋氨酸、A卟42對N2a細胞早期凋亡影響的檢測圖；
[0042]圖5為Morris水迷宮定位航行檢測結果圖；
[0043]圖6為Morris水迷宮定位航行實驗中實驗小鼠找到平臺的運動軌跡圖；
[0044]圖7為Morris水迷宮空間探索實驗結果圖(*p〈0.05;n=12)；
[0045]圖8為小鼠海馬CA3區A3卜42免疫熒光檢測圖(20X );
[0046]圖9為小鼠海馬CA3區A3卜42免疫熒光檢測結果比較圖。
[0047]圖10為小鼠海馬區Tau5免疫熒光檢測圖(20X);
[0048]圖11為小鼠海馬區Tau5免疫熒光檢測結果比較圖。
[0049]圖12為小鼠皮層區Tau5免疫熒光檢測圖(20 X )；
[0050]圖13為小鼠皮層區Tau5免疫熒光檢測結果比較圖；
[0051]圖14為小鼠海馬區Tau-ps404免疫熒光檢測圖；
[0052]圖15為小鼠海馬區Tau-ps404免疫熒光檢測結果比較圖；
[0053]圖16為小鼠腦組織海馬區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平Western-blot電泳條帶圖；
[0054]圖17為小鼠腦組織海馬區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0055]圖18為小鼠腦組織皮層區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測Western-blot電泳條帶圖；
[0056]圖19為小鼠腦組織皮層區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0057]圖20為小鼠腦組織非可溶性Tau蛋白表達水平檢測Western-blot電泳條帶圖；[0058]圖21為小鼠腦組織非可溶性Tau蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0059]圖22為小鼠海馬區GFAP免疫熒光檢測圖(20 X )；
[0060]圖23為小鼠海馬區GFAP免疫熒光檢測結果比較圖；
[0061]圖24為小鼠腦組織海馬區突觸前后蛋白表達水平檢測Western-blot電泳條帶圖；
[0062]圖25為小鼠腦組織海馬區突觸前后蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0063]圖26為小鼠腦組織皮層區突觸前后蛋白表達水平檢測Western-blot電泳條帶圖；
[0064]圖27為小鼠腦組織皮層區突觸前后蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0065]圖28為超氧化物歧化酶SOD活力檢測圖；
[0066]圖29為腦組織海馬區谷胱甘肽含量檢測圖；
[0067]圖30為腦組織皮層區谷胱甘肽含量檢測圖；
[0068]圖31為小鼠腦組織糖元合成酶激酶(GSK-3 ^ )表達水平檢測電泳條帶圖；
[0069]圖32為小鼠腦組織糖元合成酶激酶(GSK-3 ^ )表達水平檢測結果比較圖；
[0070]圖33為Morris水迷宮定位航行檢測結果圖；
[0071]圖34為Morris水迷宮定位航行檢測結果小鼠找到平臺的運動軌跡圖；
[0072]圖35為Morris水迷宮空間探索實驗結果圖；
[0073]圖36為小鼠大腦海馬區Tau5免疫熒光檢測圖(20 X )；
[0074]圖37為小鼠大腦海馬區Tau5免疫熒光檢測結果比較圖；
[0075]圖38為小鼠皮層區Tau5免疫熒光檢測圖(20 X )；
[0076]圖39為小鼠皮層區Tau5免疫熒光檢測結果比較圖；
[0077]圖40為小鼠海馬區Tau_ps404免疫熒光檢測圖(20 X )；
[0078]圖41為小鼠海馬區Tau-ps404免疫熒光檢測結果比較圖；
[0079]圖42為小鼠腦組織海馬區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測電泳條條帶圖；
[0080]圖43為小鼠腦組織海馬區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0081]圖44為小鼠腦組織皮層區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測電泳條帶圖；
[0082]圖45為小鼠腦組織皮層區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0083]圖46為小鼠腦組織非可溶性Tau蛋白表達水平檢測電泳條帶圖；
[0084]圖47為小鼠腦組織非可溶性Tau蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0085]圖48為小鼠海馬區GFAP免疫熒光檢測圖(20 X )；
[0086]圖49為小鼠海馬區GFAP免疫熒光檢測結果比較圖；
[0087]圖50為小鼠腦組織海馬區突觸前后蛋白表達水平檢測圖；
[0088]圖51為小鼠腦組織海馬區突觸前后蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0089]圖52為小鼠腦組織皮層區突觸前后蛋白表達水平檢測電泳條帶圖；
[0090]圖53為小鼠腦組織皮層區突觸前后蛋白表達水平檢測結果比較圖；[0091]圖54腦組織海馬區谷胱甘肽含量檢測；
[0092]圖55為腦組織皮層區谷胱甘肽含量檢測圖；
[0093]圖56為小鼠腦組織糖元合成酶激酶(GSK-3 ^ )表達水平檢測電泳條帶圖；
[0094]圖57為小鼠腦組織糖元合成酶激酶(GSK-3 ^ )表達水平檢測結果比較圖。
【具體實施方式】
[0095]下面通過【具體實施方式】結合附圖對本發明作進一步詳細說明。但本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第 三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0096]實驗主要試劑:
[0097]硒代蛋氨酸(Seleno-DL-methionine)購買自sigma,單一化合物，純度≤99%,白色粉末狀，-18°C保存。
[0098]動物模型:AD三轉基因小鼠(B6; 129-PsenltmlMpm Tg (APPSwe, tauP301L) ILfa/J)及野生型對照小鼠(B6; 129SF2/J):購買于美國Jax實驗室。
[0099]多聚甲醒，0-actin—抗，a-tublin—抗:sigma ;氯化鈉,氯化鉀,磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，NaOH:廣州化學試劑廠；
[0100]無水乙醇，工業酒精，二甲苯，工業石蠟，蜂蠟，冰乙酸，氨水，鹽酸，KH550，檸檬酸三鈉，中性樹膠:南山化試科技；
[0101]多聚賴氨酸，尼氏染液，熒光抗猝滅封片劑，SOD活性試劑盒，NO總含量試劑盒，MDA含量試劑盒，GSH試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒，顯影液，定影液:碧云天；
[0102]雙氧水:東江化學試劑有限公司；
[0103]DAB,免疫組化試劑盒，免疫組化油性筆:福建邁新生物科技；
[0104]Tris堿，甘氨酸(Gly)，EDTA:上海生工；
[0105]SDS:廣州化學試劑廠；
[0106]蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑:羅氏生物；
[0107]4* 蛋白 loading buffer:武漢博士德；
[0108]蛋白預染 marker:Fermentas ;
[0109]PVDF 膜:Mi I Iipore ；
[0110]化學發光液ECL =Thermol ；
[0111]1-42:蘇州強耀生物科技有限公司
[0112]1-42 一抗，GFAP —抗，Tau5 —抗:Abcam ；PS404 一抗，PS422 —抗，PS202 —抗，PS262 一抗，T235 一抗，BACE-1 一抗=Epitomics ；
[0113]PSD-95 一抗，Synaptophy sin—抗，GSK-30:基因公司；
[0114]羊抗鼠二抗，羊抗兔二抗:欣博盛；
[0115]羊抗鼠DL488熒光二抗，羊抗兔DL488熒光二抗，羊抗兔DL649熒光二抗，羊抗鼠DL649熒光二抗:聯科生物。
[0116]實驗主要儀器:[0117]高溫試驗箱:隆安；通風柜:深圳申立；石蠟切片機:萊卡；正置顯微鏡CX21:Olympus Corporation ;立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海博訊實業有限公司；
[0118]正置突光顯微鏡CX51,突光共聚焦顯微鏡:01ympus Corporation ；
[0119]恒溫水浴鍋:上海精宏；酶標儀:Model550 ;蛋白電泳儀，電轉儀=Tanon ；
[0120]電子分析天平(BSllOS):Sartorius ； [0121]超聲波破碎儀:寧波新芝科技股份有限公司；
[0122]高速冷凍離心機5804R:Eppendorf ；
[0123]恒溫培養搖床(THZ-300):上海一恒科技有限公司；
[0124]顯影儀:Carestream。
[0125]圖1為硒代蛋氨酸對N2a細胞增殖的影響圖(**p〈0.01，***p〈0.001，n=3)，其中A:硒代蛋氨酸處理12h B:硒代蛋氨酸處理24h C:硒代蛋氨酸處理48h ；
[0126]圖2為硒代蛋氨酸、A3卜42對N2a細胞ROS的影響圖(**p〈0.01，***p<0.0OlVSControl, #p<0.05VS A3 卜42，n=3);其中 A:A^ ^42 處理細胞 6h B:A3 卜42 處理細胞 24h ；
[0127]圖3為硒代蛋氨酸、A卟42對N2a細胞早期凋亡影響的檢測圖。
[0128]圖4為硒代蛋氨酸、A @卜42對N2a細胞早期凋亡影響的檢測圖(***p〈0.001VSControl, #p<0.05VS A^ 卜42，n=3)；
[0129]圖5為Morris水迷宮定位航行檢測結果圖，A:實驗小鼠逃避潛伏期(*p〈0.05;n=12) ；B:實驗小鼠游泳平均速度；
[0130]圖6為Morris水迷宮定位航行實驗中實驗小鼠找到平臺的運動軌跡圖；其中A-D表示分別從一、二、三、四個象限入水軌跡圖。
[0131]圖7為Morris水迷宮空間探索實驗結果圖(*p〈0.05;n=12)，A:實驗小鼠24h記憶-原平臺象限所停留時間；B:實驗小鼠24h記憶-跨越原平臺次數；C:實驗小鼠72h記憶-原平臺象限所停留時間；D:實驗小鼠72h記憶-跨越原平臺次數；圖8為小鼠海馬CA3區A3卜42免疫熒光檢測圖(20X )，A:對照組CA3區；B:Se-Met組CA3區；(圖部分還有兩張熒光圖a和b))
[0132]圖9為小鼠海馬CA3區A卟42免疫熒光檢測結果比較圖。
[0133]圖10為小鼠海馬區Tau5免疫熒光檢測圖(20X) (**p〈0.01 ;n=3)，A、B、C:對照組小鼠大腦海馬區齒狀回、CA3區、CAl區；D、E、F =Se-Met組小鼠大腦海馬區齒狀回、CA3區、CAl 區。
[0134]圖11為小鼠海馬區Tau5免疫熒光檢測結果比較圖。
[0135]圖12為小鼠皮層區Tau5免疫熒光檢測圖(20 X )，A:對照組小鼠大腦皮層區；
[0136]B:Se-Met組小鼠大腦皮層區；
[0137]圖13為小鼠皮層區Tau5免疫熒光檢測結果比較圖；
[0138]圖14 為小鼠海馬區 Tau-ps404 免疫熒光檢測圖(20 X ) (***p〈0.001 ;n=3)，A、B、C:對照組小鼠大腦海馬區CA3區、齒狀回、CAl區；D、E、F =Se-Met組小鼠大腦海馬區CA3區、齒狀回、CAl區；
[0139]圖15為小鼠海馬區Tau-ps404免疫熒光檢測結果比較圖；
[0140]圖16為小鼠腦組織海馬區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平Western-blot電泳條帶圖；[0141]圖17為小鼠腦組織海馬區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0142]A:Tau5蛋白灰度值定量分析；B:Tau-ps404蛋白灰度值定量分析；
[0143]C:Tau-ps202蛋白灰度值定量分析；D:Tau-ps422蛋白灰度值定量分析；
[0144]E:Tau-ps235蛋白灰度值定量分析；
[0145]圖18為小鼠腦組織皮層區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測Western-blot電泳條帶圖；
[0146]圖19為小鼠腦組織皮層區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0147]A:Tau5蛋白灰度值定量分析；B:Tau-ps235蛋白灰度值定量分析(*p〈0.05;n=3)；
[0148]C:Tau-ps404蛋白灰度值定量分析；D:Tau-ps202蛋白灰度值定量分析；
[0149]圖20為小鼠腦組織非可溶性Tau蛋白表達水平檢測Western-blot電泳條帶圖(**p<0.01, ***p<0.001;n=3) A:皮層區 Western-blot 電泳條帶圖;B:海馬區 Western-blot電泳條帶圖；
[0150]圖21為小鼠腦組織非可溶性Tau蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0151]A:皮層區Tau5蛋白灰度值定量分析；B:海馬區Tau5蛋白灰度值定量分析；
[0152]圖22為小鼠海馬區 GFAP免疫熒光檢測圖(20 X ) (**p<0.01; n=3)
[0153]A:對照組小鼠大腦海馬區CAl區；B:對照組小鼠大腦海馬區CA3區；
[0154]C:對照組小鼠大腦海馬區齒狀回；D:實驗組小鼠大腦海馬區CAl區；
[0155]E:實驗組小鼠大腦海馬區CA3區；F:實驗組小鼠大腦海馬區齒狀回；
[0156]圖23為小鼠海馬區GFAP免疫熒光檢測結果比較圖；
[0157]圖24為小鼠腦組織海馬區突觸前后蛋白表達水平檢測Western-blot電泳條帶圖(*p<0.05;n=3)
[0158]A:突觸前蛋白Western-blot電泳條帶圖；B:突觸后蛋白Western-blot電泳條帶圖；
[0159]圖25為小鼠腦組織海馬區突觸前后蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0160]A:突觸前蛋白灰度值定量分析；B:突觸后蛋白蛋白灰度值定量分析
[0161]圖26為小鼠腦組織皮層區突觸前后蛋白表達水平檢測Western-blot電泳條帶圖(***p〈0.001;n=3)
[0162]A:突觸前蛋白Western-blot電泳條帶圖；B:突觸后蛋白Western-blot電泳條帶圖；
[0163]圖27為小鼠腦組織皮層區突觸前后蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0164]A:突觸前蛋白灰度值定量分析；B:突觸后蛋白蛋白灰度值定量分析；
[0165]圖28為超氧化物歧化酶SOD活力檢測圖，A:海馬區；B:皮層區；
[0166]圖29為腦組織海馬區谷胱甘肽含量檢測圖(*p〈0.05;n=3), A:還原性谷胱甘肽；
[0167]B:總谷胱甘肽；
[0168]圖30為腦組織皮層區谷胱甘肽含量檢測圖(*p〈0.05;n=3), A:還原性谷胱甘肽；
[0169]B:總谷胱甘肽；
[0170]圖31為小鼠腦組織糖元合成酶激酶(GSK-3P )表達水平檢測電泳條帶圖，[0171]A-B:皮層區、海馬區可溶性GSK-3 P電泳條帶圖；
[0172]圖32為小鼠腦組織糖元合成酶激酶(GSK-3P )表達水平檢測結果比較圖；
[0173]A-B:皮層區、海馬區可溶性GSK-3P灰度值定量分析量分析；(_p〈0.001;n=3)
[0174]圖33為Morris水迷宮定位航行檢測結果圖，A:小鼠逃避潛伏期(*p〈0.05;n=12)；
[0175]B:小鼠平均游泳速度；
[0176]圖34為Morris水迷宮定位航行檢測結果小鼠找到平臺的運動軌跡圖；
[0177]A-D:分別為從一、二、三、四個象限入水軌跡圖；
[0178]圖35為Morris水迷宮空間探索實驗結果圖，A:實驗小鼠24h記憶-原平臺象限所停留時間:實驗小鼠24h記憶-跨越原平臺次數；C:實驗小鼠72h記憶-原平臺象限所停留時間；D:實驗小鼠72h記憶-跨越原平臺次數；
[0179]圖36為小鼠大腦海馬區Tau5免疫熒光檢測圖(20X ) (*p<0.05;n=3),
[0180]A、B、C:對照組海馬區齒狀回、CA3區、CAl區
[0181]D、E、F:Se_Met組海馬區齒狀回、CA3區、CAl區；
[0182]圖37為小鼠大腦海馬區Tau5免疫熒光檢測結果比較圖；
[0183]圖38為小鼠皮層區Tau5免疫熒光檢測圖(20 X ) (*p<0.05;n=3)
[0184]A:對照組皮層區；B =Se-Met組皮層區；
[0185]圖39為小鼠皮層區Tau5免疫熒光檢測結果比較圖；
[0186]圖40為小鼠海馬區Tau_ps404免疫熒光檢測圖(20X) (*p<0.05;n=3)
[0187]A、B、C:對照組海馬區CA3區、齒狀回、CAl區
[0188]D、E、F:Se_Met組海馬區CA3區、齒狀回、CAl區；
[0189]圖41為小鼠海馬區Tau-ps404免疫熒光檢測結果比較圖；
[0190]圖42為小鼠腦組織海馬區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測電泳條條帶圖，
[0191]A:Tau5蛋白電泳條帶圖；B:Tau-ps404蛋白電泳條帶；
[0192]C:Tau-ps202 蛋白電泳條帶；(*p<0.05，**p〈0.01，***p〈0.001;n=3)
[0193]圖43為小鼠腦組織海馬區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0194]A:Tau5蛋白灰度值定量分析量分析；B:Tau-ps404蛋白灰度值定量分析量分析；
[0195]C:Tau-ps202蛋白灰度值定量分析量分析；
[0196]圖44為小鼠腦組織皮層區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測電泳條帶圖，
[0197]A:Tau5蛋白電泳條帶圖；B:Tau-ps404蛋白電泳條帶；
[0198]圖45為小鼠腦組織皮層區可溶性Tau蛋白及其磷酸化蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0199]A:Tau5蛋白灰度值定量分析量分析；
[0200]B:Tau-ps404 蛋白灰度值定量分析量分析；(*p〈0.05, ***p<0.001;n=3)
[0201]圖46為小鼠腦組織非可溶性Tau蛋白表達水平檢測電泳條帶圖(、〈0.01，***p〈0.001)；
[0202]A:皮層區Tau5蛋白電泳條帶圖；B:海馬區Tau5蛋白電泳條帶圖；[0203]C:海馬區Tau_ps404蛋白電泳條帶；
[0204]圖47為小鼠腦組織非可溶性Tau蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0205]A:皮層區Tau5蛋白灰度值定量分析量分析；
[0206]B:海馬區Tau5蛋白灰度值定量分析量分析；
[0207]C:海馬區Tau-ps404蛋白灰度值定量分析量分析；
[0208]圖48為小鼠海馬區GFAP免疫熒光檢測圖(20 X ) (*p<0.05;n=3)
[0209]A、B、C:對照組海馬區CAl區、CA3區、齒狀回；
[0210]D、E、F:Se_Met組海馬區CAl區、CA3區、齒狀回；
[0211]圖49為小鼠海馬區GFAP免疫熒光檢測結果比較圖；
[0212]圖50為小鼠腦組織海馬區突觸前后蛋白表達水平檢測圖(*p〈0.05，***p〈0.001;n=3)
[0213]A:突觸前蛋白Western-blot電泳條帶圖；B:突觸后蛋白Western-blot電泳條帶圖；
[0214]圖51為小鼠腦組織海馬區突觸前后蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0215]A:突觸前蛋白灰度值定量分析；B:突觸后蛋白蛋白灰度值定量分析；
[0216]圖52為小鼠腦組織皮層區突觸前后蛋白表達水平檢測電泳條帶圖(***p〈0.001;n=3)
[0217]A:突觸前蛋白Western-blot電泳條帶圖；B:突觸后蛋白Western-blot電泳條帶圖；
[0218]圖53為小鼠腦組織皮層區突觸前后蛋白表達水平檢測結果比較圖；
[0219]A:突觸前蛋白灰度值定量分析；B:突觸后蛋白蛋白灰度值定量分析；
[0220]圖54腦組織海馬區谷胱甘肽含量檢測(#p〈0.01;n=3), A:還原性谷胱甘肽；
[0221]B:總谷胱甘肽；
[0222]圖55為腦組織皮層區谷胱甘肽含量檢測圖，A:還原性谷胱甘肽；B:總谷胱甘肽；
[0223]圖56為小鼠腦組織糖元合成酶激酶(GSK-3P )表達水平檢測電泳條帶圖(*p<0.05;n=3)
[0224]A-B:皮層區、海馬區可溶性GSK-3 ^電泳條帶圖；
[0225]圖57為小鼠腦組織糖元合成酶激酶(GSK-3 ^ )表達水平檢測結果比較圖。
[0226]A-B:皮層區、海馬區可溶性GSK-3 ^灰度值定量分析量分析。
[0227]實施例1:細胞水平檢測硒代蛋氨酸的功效
[0228]將硒代蛋氨酸以IuM的濃度加入到細胞培養基中以觀察其對AP誘導的N2A細胞(小鼠神經瘤細胞)的治療作用。采用CCK-8法檢測不同濃度Se-Met對N2a細胞活力的影響;N2a細胞經Se-Met預處理后，加入A3卜42 (IOuM)共培養6小時;FITC_annexin V /PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡水平變化；DCFH-DA標記法檢測細胞內總活性氧(ROS)水平變化。
[0229]1.CCK-8檢測細胞的活力
[0230]CCK-8檢測發現:結果見圖1:硒代蛋氨酸對N2a細胞的活力影響存在與時間相關的劑量效應，作用12h時，隨著硒代蛋氨酸濃度升高，細胞活力逐漸增強，高濃度組(50 PM，100 u M)表現出顯著效應(p〈0.001);作用24h后,低濃度(0.1 u M, I U M, 10 u M)硒代蛋氨酸持續表現為促進增殖作用，其中0.1uM、1uM促增殖作用最顯著(p〈0.001)，而高濃度組的增殖減緩；作用時間延長至48h時，0.1 PM、I PM硒代蛋氨酸對N2a細胞的仍然表現出顯著的促進增殖作用(P〈0.01)，相反，高濃度的硒代蛋氨酸表現出顯著的抑制N2a細胞增殖的作用(p〈0.001)，即48h時硒代蛋氨酸對N2a細胞的增殖具有有“低促高抑”作用。
[0231]2.流式細胞儀檢測細胞ROS水平
[0232]結果見圖2 4 01_42處理611后吧&細胞1?05水平顯著增高(？〈0.01)，硒代蛋氨酸預處理組的ROS有所降低；A卟42處理24h后細胞ROS較對照組有更顯著的升高(p〈0.01)，而硒代蛋氨酸預處理的細胞ROS明顯降低(p〈0.05);說明AP H2會刺激細胞ROS的升高，而硒代蛋氨酸能抑制A卟42的這種影響。
[0233]3.流式細胞儀檢測細胞早期凋亡水平
[0234]A卟42作用后N2a早期凋亡率顯著升高(p〈0.001 )，而硒代蛋氨酸預處理能顯著抑制A 卟42對細胞的毒性作用，細胞早期凋亡率顯著降低(p〈0.05)。
[0235]實施例2:動物水平檢測硒代蛋氨酸的功效
[0236]選取4、8月齡的3XTg AD小鼠作為藥物實驗對象(見表1)，硒代蛋氨酸(Se-Met)以6ug/ml的濃度加入其飲水中，持續給藥12周。治療結束后，Morris水迷宮檢測小鼠的空間記憶及探索能力；采用免疫熒光、Western-Blot及特異性試劑盒分別檢測以下幾個方面的變化:AP、Tau及其各位點的磷酸化蛋白、炎癥反應(GFAP)、突觸前后蛋白(synaptophysin及PSD95)、氧化應激水平(SOD、MDA、NO、谷胱甘肽)；并檢測BACE-1、GSK-3 ^表達水平變化，對AP、Tau的影響機制進行一定的研究。
[0237]表1:實驗動物分組及治療方案
[0238]
【權利要求】
1.一種硒代蛋氨酸用于制備治療阿爾茨海默癥藥物的用途。
2.一種硒代蛋氨酸用于制備提高動物學習記憶能力的藥物的用途。
3.—種硒代蛋氨酸用于制備抑制腦內A β的聚集以及Tau蛋白及其磷酸化水平的藥物的用途。
4.一種硒代蛋氨酸用于制備降低動物體腦內GSK-3 0表達的藥物的用途。
5.一種硒代蛋氨酸用于制備降低腦內炎癥反應，緩解神經細胞的突觸損傷的藥物的用途。
6.一種硒代蛋氨酸用于制備提高腦內SOD的活性及還原性谷胱甘肽含量的藥物的用途。
7.一種含有權利要求1-6任一所述硒代蛋氨酸的藥物，其特征在于，給藥方式為通過加入飲用水方式給藥。
8.權利要求7所述硒代蛋氨酸的藥物，加入到飲用水后的終濃度為6ug/ml。
9.一種含有權利 要求1-6任一所述硒代蛋氨酸的藥物，其特征在于，所述藥物是膠囊。
10.一種含有權利要求1-6任一所述硒代蛋氨酸的藥物，其特征在于，所述藥物是藥片。
【文檔編號】A61P25/28GK103479606SQ201310452104
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】宋國麗, 倪嘉纘, 張中豪, 劉瓊, 石慶學 申請人:深圳大學