專利名稱：一種p28^GANK單克隆抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學生物工程技術領域，是一種p28eAffi單克隆抗體及其用于制備肝癌的預后評估制劑或肝癌治療藥物的用途。
背景技術：
p28GANK是存在于人肝細胞中的一種蛋白，通常在正常細胞中含量較少，但在肝癌細胞中含量很高。它的編碼框包含2 個氨基酸，分子量為25kDa，含有6個重復ankyrin 序列，GeneID :5716。本發明人曾制備了兔抗人p28eANK多克隆抗體用于肝癌鑒別診斷并申請了專利(詳見《肝癌鑒別診斷用P^抗體及其制備》，專利號ZL 03116825. 6)。近來有報道p28GAffi主要是通過調控內質網應激(ER stress)、NF-κ B、P53及Rb 信號通路發揮其促癌作用。？觀—直接結合徹認/順-^加速順-^出核；P^ganK結合泛素蛋白連接酶MDM2介導p53的泛素化降解；p^GANK結合腫瘤抑制蛋白Rb并驅動Rb的核內磷酸化失活及核轉錄因子E2F-1釋放，加速細胞周期(Gastroenterology 2005 ；128 2029-2041 ；CellResearch 2009Nov ； 19 (11) :1243-57. ；2007Dec ；17 (12) :1020-9)。曾有報道影響肝癌預后的因素主要是腫瘤大小和血管侵犯，并通常伴隨腫瘤多發性。目前，越來越多的研究表明預判肝癌的復發尚需發掘其他更為有效的預后因素。以往研究提示p28eAffi在肝癌發生發展中可能發揮了重要作用，但是它如何調控肝癌進程尚不明確，至今未見PZSmm的表達水平可直接作為肝癌復發轉移的預后判斷因素，以及用于肝癌個性化治療的相關報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種P^mnk單克隆抗體，并將其用于制備肝癌預后檢測試劑或用于制備治療肝癌的藥物。本發明人根據肝癌中MSgam蛋白的高表達現象，研究了 MSgank對肝癌細胞轉移能力的調控，通過實驗發現，蛋白P^gank可以促進肝癌細胞的轉移，即P^gmk能夠通過調控 PI3K-AKT-HIF1 α通路促進肝癌的轉移，并且p28eAffi蛋白的表達強弱與肝癌患者的預后密切相關。如果用它的單克隆抗體特異識別反映出肝病患者組織樣本中p28eANK的本底表達水平，就能對患者的預后作出預判分析；進而設想，如果用相應單克隆抗體抑制p28eAffi功能， 阻斷p28eMK的促癌作用，就有可能對那些自身肝臟中P^mnk本底表達水平較高的患者起到個性化的治療效果。所以P^mnk的單克隆抗體可以用于肝癌的預后判別以及個性化治療。 本發明制備了 P^mm的單克隆抗體，并提供了新用途。本發明的鼠抗人p28eAffi單克隆抗體的制備方法如下1.針對p28eANK的編碼框氨基酸全序列設計并合成3個多肽，序列分別為多肽1:131-145，NPDAKDHYEATAMHRC多肽2 180-194，CDEERVEEAKLLVSQ多肽3 199-214，YIENKEEKTPLQVAKGC ；
2.將上述多肽分別與鑰孔慽血蘭蛋白(keyholelimpet hemocyanin，KLH)耦聯， 作為免疫原免疫小鼠；3.取免疫鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合；4.經多輪篩選出合成多肽反應陽性的細胞克隆，作為抗人PZSmm蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株；5.通過在小鼠體內接種雜交瘤細胞生產腹水抗體，將腹水進行純化，得到抗人 p28GAffi的單克隆抗體。本發明提供了抗人p28eMK的單克隆抗體，該單克隆抗體識別分別位于p28eAffi氨基酸序列 NPDAKDHYEATAMHRC、CDEERVEEAKLLVSQ 和 YIENKEEKTPLQVAKGC 的抗原表位。本發明中的多肽可用多肽合成儀合成。多肽片段可用戊二醛連接法等與KLH等載體蛋白耦聯，作為免疫原免疫小鼠，并用于單克隆抗體篩選。抗人p28eANK的單克隆抗體的雜交瘤細胞株可采用本技術領域常規的方法制備。比如，取經免疫的小鼠的脾細胞，與小鼠的骨髓瘤細胞如SP2/0細胞融合，經篩選后即可獲得雜交瘤細胞。單克隆抗體的獲得可采用本技術領域常規的方法，即通過在小鼠體內接種雜交瘤細胞并產生腹水抗體，取出腹水經純化而得到。本發明的雜交瘤細胞株，也稱雜交瘤細胞系160CT8531和161CT7112，所制備的單克隆抗體是一種免疫球蛋白，可特異性結合人p28eMK蛋白。經鑒定，所制備的免疫球蛋白是 IgG型的單克隆抗體。本發明還提供了上述抗人p28eAffi的單克隆抗體在檢測肝病患者預后判別中的應用，其中的檢測是指Western Blot和免疫組化檢測。本發明為P^mnk的臨床個性化治療應用提供了新的思路。


圖1.是單克隆抗體Western Blot檢測人p28GAffi蛋白的掃描圖。其中，泳道1，3，5是肝癌細胞SMMC-7721裂解液，泳道2，4，6是含有外轉 myc-p28GANK的細胞系SMMC_7721-p^GANK裂解液。一標識的是外源性p28GAffi。圖2.是單克隆抗體p28GAffi免疫組化檢測人P^gank蛋白的組織切片圖，其中，A為單克隆抗體160CT8531免疫組化檢測的肝癌組織Q00X)；B為單克隆抗體161CT7112免疫組化檢測的肝癌組織Q00X)。圖3.是單克隆抗體P^gank免疫組化檢測200例人肝癌樣本中P^gank表達水平后統計分析對患者預后(無瘤生存率Disease-Free Survival和總生存率Overall Survival)的曲線圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作詳細描述，但本發明的實施不僅限于此。實施例1.抗人p28eAffi的單克隆抗體的制備和純化1.抗原的合成和耦聯抗原多肽合成設計參考GenBank，GeneID :5716，具體序列% NPDAKDHYEATAMHRC (SEQ ID NO 1) , CDEERVEEAKLLVSQ (SEQ ID NO :2)， YIENKEEKTPLQVAKGC(SEQ ID NO :3)，由百奇生物科技(上海)有限公司通過多肽自動合成儀用固相多肽合成法合成。多肽與鑰孔慽血蘭蛋白(KLH)的耦聯采用《分子克隆實驗指導》第2版，薩姆布魯克著，金冬雁譯，科學出版社，北京，1999，第865頁描述的戊二醛連接法。2.單克隆抗體的制備和純化將上述1中純化的多肽KLH偶聯物100 μ g以PBS稀釋后與等體積完全弗氏佐劑 (CFA)混勻乳化，免疫5-6周齡的雌性BALB/c小鼠5只，雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和后雙腿進行肌肉注射，每個區域大約用1/8的免疫原，將剩余免疫原的1/2進行腹腔注射。 1周后加強免疫50 μ g，完全弗氏佐劑，腹腔注射。2周后加強免疫50 μ g，不完全弗氏佐劑 (IFA)，腹腔注射。3周及以后，每周直接腹腔注射50 μ g加強免疫。第5周起，每周尾靜脈采血，ELISA測定效價，應用多肽KLH偶聯物抗原1. 25 μ g/ml包被，10% FCS封閉，將血清稀釋后加入，應用羊抗小鼠IgG標記HRP作為二抗，OPD顯色，使用酶標儀(Bio-Rad550型) 在492nm讀數。第4次采血的ELISA結果OD值均大于0. 75。取傳染了人p28GAM蛋白的穩定細胞系SMMC-7721/p28GANK 1 X IO6個，用細胞裂解液裂解后，常規flfestern Blot檢測。在免疫小鼠的同時準備小鼠骨髓瘤細胞SP2/0細胞(購自ATCC)。最后一次加強免疫3天后，取Wfestern Blot和免疫組化檢測效果最好的小鼠的脾細胞，與SP2/0細胞比例5 1，在PEG1500的作用下進行融合反應，植入96孔板，37°C、5% CO2條件下培養。培養14天后，鏡下檢測生長出克隆細孔為融合陽性孔，計算總融合率>95%。盡量選擇單克隆細胞孔的上清進行ELISA檢測。ELISA陽性的克隆用Western Blot和免疫組化檢測 SMMC-7721/p28GANK細胞，篩選出來的克隆亞克隆兩次，每次flfestern Blot和免疫組化檢測效果最好的克隆。篩選得到3個克隆。6-8周齡的雌性BALB/c小鼠用石蠟油腹腔注射10天后，取雜交瘤細胞以2X106 個細胞/只進行腹腔注射。7-14天后從小鼠腹腔抽出富含抗體的腹水進行檢測和純化。純化采用ftOteinG親和層析法。ftOteinG親和層析柱用PBS平衡柱子后取腹水過柱，然后用PBS洗柱至OD值接近零，以50nmol/L的甘氨酸鹽酸溶液洗脫，收集洗脫液，測定各收集管的OD值，保留峰值區的洗脫液，透析純化。實施例2.抗人p28eAffi的單克隆抗體的鑒定和檢測應用1.單克隆抗體的Wfestern Blot檢測應用變性的蛋白樣品進行SDS-PAGE蛋白電泳；通過電轉儀將蛋白轉移至硝酸纖維素膜(Schleicher&Schell 公司)；含 5% BSA 的 TBST 封閉 lh，TBST 洗一次，5min ；含 4% BSA 的TBST稀釋抗p28GAM單克隆抗體一抗(1 μ g/ml)，孵育濁，TBST洗三次，每次5min ；含4% BSA的TBST稀釋IR-800標記的抗小鼠二抗，孵育lh，TBST洗四次，每次5min ；用紅外線激光掃描儀Odyssey掃描。結果見圖1。結果表明該單克隆抗體能較為特異地識別人p28eMK 分子。2.單克隆抗體的免疫組化檢測應用切片置于60°C恒溫箱中烘烤20分鐘并脫蠟；3% H2O2 (80%甲醇)室溫10分鐘滅活內源性過氧化物酶，PBS洗3次各5分鐘。0. OlM枸櫞酸鈉緩沖液(pH6. 0)高壓修復抗原，PBS洗3次各5分鐘；山羊血清封閉，室溫20分鐘，甩去多余液體；滴加以抗體稀釋液稀釋的抗p28GAM單克隆抗體一抗(10 μ g/ml)，室溫孵育池，PBS洗3次各5分鐘；滴加HRP標記的二抗50 μ 1，室溫孵育lh，PBS洗3次各5分鐘；DAB顯色5_10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS洗3次各5分鐘；蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10-15分鐘； 脫水、透明、封片、拍照。結果見圖2。結果表明，該單克隆抗體能較為特異地識別人PZSmm分子。3.抗人p28eANK單克隆抗體針對肝癌患者的預后判斷應用①運用肝癌組織芯片(其中包含隨機選取2001年-2006年在上海東方肝膽外科醫院行肝癌根治術的原發性肝細胞癌患者標本200例)，相應標本具有完善病史及隨訪資料記錄入選患者的性別、年齡，腫塊大小、腫塊象限、具體病理亞型、免疫組化結果、淋巴結轉移、門脈癌栓、肝內血管侵犯等情況。記錄術后無瘤生存時間(Disease-Free Survival, DFS)、總生存時間(Overall Survival, OS)及復發轉移情況。②p28GAffi表達檢測及評估利用免疫組化方法檢測組織芯片中P^gam的表達情況，計算出每張照片中p28eAffi的表達強度，并通過計算得出每位患者癌及癌旁組織中p28eMK 的平均表達強度。利用統計軟件分析p28eMK的表達與肝癌患者各種臨床特征及預后參數 (總生存率、無瘤生存率、總生存時間、無瘤生存時間等)的關系，制成曲線圖，結果見圖3。 結果表明，該抗體檢測到的樣本本底p28eAffi的表達強弱與患者預后密切相關。
權利要求
1.一種抗人p28eANKm單克隆抗體的制備方法，步驟如下a)合成作為半抗原的多肽，其序列如SEQID NO :1_3所示；b)將上述多肽與匙孔慽血藍蛋白KLH偶聯，作為免疫原免疫小鼠；c)取免疫鼠的脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞融合；d)經多輪篩選出與合成多肽反應陽性的細胞克隆，作為抗人p28eAffi單克隆抗體的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株保藏號為；e)通過在小鼠體內接種雜交瘤細胞產生腹水抗體，將腹水進行純化，得到抗人p28eMK 的單克隆抗體；或者通過體外細胞培養，分離純化，得到抗人p28eANK的單克隆抗體。
2.權利要求1所述方法制備的抗人p28eAffi的單克隆抗體。
3.權利要求2所述的抗人p28GANK的單克隆抗體在制備肝癌患者預后評估分析Western Blot和免疫組化檢測試劑中的應用。
4.權利要求2所述的抗人p28eMK單克隆抗體在制備治療肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及醫學生物工程技術領域，是一種p28GANK單克隆抗體及其用于制備肝癌的預后評估制劑或肝癌治療藥物的用途。p28GANK蛋白在肝癌細胞中表達異常升高，并且其表達強弱與患者預后密切相關，因此p28GANK在肝癌發生發展中的作用已被日益重視。本發明提供了抗人p28GANK的單克隆抗體，還提供了該抗人p28GANK的單克隆抗體在檢測判別肝癌患者預后分析和個性化治療中的應用價值。本發明為p28GANK的臨床個性化治療應用提供了新的思路。
文檔編號C12N5/18GK102532313SQ201010585000
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月13日 優先權日2010年12月13日
發明者付靜, 王紅陽, 羅韜, 胡棟平, 董立巍, 陳瑤 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學