專利名稱：一種豬防御素pBD2多肽及其在抑制豬病原菌中應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種豬防御素PBD2多肽、編碼其的基因及其在抑制豬病原圃中應用。
背景技術：
我國是養豬和豬肉生產大國，生豬飼養量、豬肉產量均位居世界第一，豬肉安全始終是關系到農村經濟發展和社會安定的一個根本問題，具有“無豬不穩，豬糧安天下”的戰略意義。目前抗生素濫用問題嚴重制約了我國養豬業的持續健康發展，甚至已經到了影響國計民生的地步。由于我國養殖業長期依賴抗生素，造成了疫情難解和疫苗失效。因此尋找和開發優質、安全、高效、廉價、無公害的抗生素替代品，已成為目前世界和我國關注的焦點和熱點。防御素是生物界廣泛存在的一類抗菌肽類物質，在哺乳動物體內主要由上皮細胞或免疫細胞產生，除了可以殺死多種細菌、分枝桿菌、真菌、病毒等病原微生物，還能夠迅速動員免疫系統，激活固有免疫和獲得性免疫反應抵抗動物體外各種生物逆境，是機體抵御外界微生物侵襲的第一道化學屏障(Boman, 1995 ；Ganz,2003 ；Yang et al. ,2007) 防御素的抑菌機理和其蛋白結構特點有關。防御素是富含半胱氨酸的陽離子多肽，可以與帶陰離子的細菌細胞膜結合，結合后其分子中的疏水區可插入細胞膜，破壞細胞膜的完整性，使細胞的必需代謝物質外泄，導致病原菌不可逆性死亡。防御素具有抗病毒的作用則是通過與病毒外殼蛋白結合導致病毒失去生物活性(Matsuzaki，2001)。高等動物的細胞由于細胞膜中負電荷含量較低而不會受到防御素的破壞。防御素不直接作用于病原菌的功能蛋白，而是作用于病原菌的細胞膜發揮抑菌作用，因此不會使病原菌對其產生耐藥性。而且與抗生素相比，防御素還具有抗病毒、激活機體免疫力的作用。由于具有以上優點， 防御素可以成為全新的抗病菌、提升免疫的飼料添加劑，未來將在動物養殖、疾病預防和提高畜產品品質等方面發揮巨大作用。目前，在脊椎動物、無脊椎動物和植物中發現的防御素已超過500多種。通過基因克隆和基因組同源序列分析，在豬體內已發現12種防御素，均以β-防御素的形式存在。這些防御素在豬體內的表達部位不同，分布于消化道、呼吸道、淋巴器官、腎、脾、睪丸、 附睪及骨髓等器官內以及中性粒細胞和肺泡巨噬細胞內，對豬先天免疫，特別是黏膜先天免疫，發揮著重要作用(Sang et al. , 2006) 研究發現pBDl不僅可以殺死Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes 和 Candida albicans 等豬致病菌(Shi et al.，1999)，而且可以激活新生仔豬的先天免疫功能，飼喂500 μ g防御素pBDl 可以使新生仔豬獲得對百日咳鮑特菌的免疫能力，預防百日咳鮑特菌引起的支氣管肺炎 (Shokrollah et al.，2006)。在腸道中，防御素可以通過增加其表達量直接殺死入侵的致病性細菌，比如豬致病性沙門氏菌Salmonella Typhimurium可以明顯使豬空腸上皮細胞系的 pBDl 和 pBD2 的表達量增加(Edwin et al. ,2009), Salmonella Enteritidis 感染可以使豬腸道細胞系PBDl的表達量增加10倍(Edwin et al.，2006)。豬防御素還具有促進動物生長的作用，在日糧中添加PBDl的肉用仔雞的生長性能、小腸吸收營養能力以及腸道黏膜免疫能力均有明顯增強(Bao et al.，2008)。由于防御素在動物體內的天然含量很低，提取步驟繁瑣，而化學合成法的生產成本昂貴，嚴重影響了防御素的研究和應用。基因工程法是獲得大量、廉價防御素的最佳途徑。防御素在大腸桿菌、酵母菌、昆蟲、植物中的表達已有相關報道。彭力(2004)在大腸桿菌中表達了人β防御素2，優化了發酵條件和產物分離的方法。任海清(2009)在畢赤酵母 GS115中表達了豬防御素pBDl。JISHU SHI等人(1999)利用桿狀病毒載體，成功的在草地夜蛾體內表達了豬防御素pBDl。王義琴等(2001)人以小球藻作為宿主，成功表達了兔防御素，為兔防御素的產業化奠定了基礎，張秀海等(2000)在番茄中成功地表達了兔防御素 NP-1。雖然在以上所述幾種生物系統中成功表達了防御素，但是防御素的異源表達量低依然是制約防御素產業化應用的瓶頸。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供一種豬防御素pBD2多肽、編碼其的基因及其應用。首先，本發明提供一種豬防御素pBD2多肽，其為由SEQ ID No. 2所示的氨基酸組成的蛋白質。本發明提供的豬防御素pBD2多肽，去除了豬防御素pBD2中的信號肽和部分前導肽，選取了豬防御素PBD2的26 69位氨基酸序列。然而，應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發明的豬防御素PBD2多肽還包括由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID No. 2所不的蛋白質衍生的蛋白質。優選的，衍生蛋白的氨基酸序列與SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的同源性可為 70%以上，優選80%以上，更優選90%以上。本發明還提供上述多肽的基因。優選的，本發明根據酵母菌密碼子的偏好性，通過大量的改造和篩選，篩選出適合酵母菌表達的基因序列，如SEQ ID No. I所示。本發明還提供的含有豬防御素pBD2多肽基因的載體、細胞系及重組菌均屬于本發明的保護范圍。優選的重組菌為酵母菌。本發明還提供制備所述豬防御素pBD2多肽的方法，其為通過發酵所述的重組菌進行制備。在本發明的一個實施方案中，通過高密度發酵所述的重組酵母菌制備豬防御素 PBD2多肽，具體包括如下步驟I)將所述的重組菌的種子液以體積百分比4 6%的接種量接種至含有10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、5g/L葡萄糖和lg/L消泡劑的發酵培養基中進行菌體培養；2)當培養基中的溶解氧消耗完后并再度升至80%以上時，以體積百分比I 3% 的流加量每隔5 7小時流加100%甲醇，控制培養基中的溶解氧濃度大于20%，28°C攪拌誘導培養3-6天。本發明提供的豬防御素pBD2多肽或者本發明重組菌，尤其是酵母菌的發酵上清液能有效的抑制豬常見病原菌的活性，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬鏈球菌、沙門氏菌和/或副豬嗜血桿菌等。本發明改造了豬防御素pBD2的多肽序列，并利用酵母工程菌進行體外表達，可以大量、廉價獲得有生物學活性的防御素，解決了天然防御素難于分離，化學合成法的生產成本昂貴的問題，有利于豬防御素的大規模生產。并且，發酵生產的豬防御素PBD2仍具有較高的生物活性，可抑制多種豬病原菌。


圖I :豬防御素pBD2的cDNA片段的克隆(I. 8%瓊脂糖凝膠)。I、Marker II ;2、 3豬防御素pBD2的cDNA片段。圖2 :酵母重組載體pPIBD的構建過程。圖3:酵母重組載體pPIBD的PCR鑒定電泳圖譜(I. 8%瓊脂糖凝膠)。1、2陽性克隆子；3、陰性對照；4、Marker II。圖4 :青霉素效價標準曲線。圖5 :酵母分泌表達的豬防御素pBD2對金黃色葡萄球菌的抑制作用。其中I為空白對照；2為10U/mL的青霉素溶液100 μ L ;3為15mg豬防御素pBD2多肽的畢赤酵母發酵液的凍干粉對金黃色葡萄球菌的抑制作用；4為25mg豬防御素pBD2多肽的畢赤酵母發酵液的凍干粉對金黃色葡萄球菌的抑制作用。圖6 :酵母分泌表達的豬防御素pBD2的溫度和pH的穩定性。其中，A為溫度，B為 pH。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例I豬防御素pBD2的cDNA序列的克隆。采集北京市順義松林鎮某豬場2周齡腹瀉長白仔豬的新鮮回腸腸道組織lg，超純水沖洗后，用天根公司生產的動物細胞RNA提取試劑盒提取回腸腸道組織的RNA，具體步驟見試劑盒的說明書。提取的RNA用TaKaRa公司生產的RNA反轉錄試劑盒反轉錄獲得cDNA， 具體操作步驟見試劑盒說明書。根據NCBI上公布的豬防御素pBD2的cDNA序列(GenBank序列號AY506573)設計引物擴增 PBD2 的 cDNA 序列，引物序列為pBD2_F :5’ -ACCTGCTTACGGGTCTTG-3’ 和 pBD2_R 5，-CTCTGCT GTGGCTTCTGG-3，。擴增條件為94°C預變性 5 分鐘；94°C熱變性 30 秒，58°C 退火30秒，72°C延伸30秒，30個循環；72°C延伸3分鐘。PCR體系為引物pBD2_F I μ L， pBD2-R I μ L，10 X dNTP 2 μ L，10 X ExTaq Buffer 2 μ L, ExTaq 酶 0· 5 μ L，加超純水補充體系到20 μ L0 PCR電泳結果如圖I所示。PCR產物測序(英駿公司)后，和NCBI上公布的豬防御素pBD2的cDNA序列的同源性是100%。克隆的cDNA序列如SEQ ID No. 3所示。實施例2豬防御素pBD2多肽序列的分析及基因序列的優化用DNAman軟件翻譯SEQ ID No. 3所示序列編碼的多肽序列，如SEQ ID No. 4所示。 用生物信息學軟件分析SEQ ID No.4所示的序列，發現序列中1-21位氨基酸殘基可能是信號肽序列(SignalP 3. O)，21-33位推測是前導肽序列，34-69位推測是成熟肽序列。
選取豬防御素pBD2(SEQ ID No. 4)中的第26_69位序列(SEQ ID No. 2)，編碼其的序列為SEQ ID No. 3所示序列的第76-210位核苷酸。使用軟件分析這段序列的酵母密碼子偏好性，根據密碼子表，改造這段序列的核苷酸，使之成為適合酵母表達的基因，基因序列見SEQ ID No. I,由英駿公司合成。實施例3酵母重組豬防御素pBD2表達載體的構建酵母重組載體pPIBD的構建過程如圖2所示。根據序列2，設計上游引物 pBD2-bc-F 5 ‘-TCTGAATTCACTGGTTTGGGTCAAAGATCCGA C-3，和下游引物 pBD2-bc-R-K 5 ‘ -ATCGGTACCTTATCTAATACAACACTTAGCCTTAC-3 ’，在上游引物5’端引入酶切位點EcoRI，在下游引物5 ‘端引入終止密碼子TTA和酶切位點ΚρηΙ。 以實施例I中由英駿公司合成的豬防御素PBD2多肽基因為模板進行PCR擴增。PCR擴增條件為94°C預變性5分鐘；94°C熱變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，30個循環； 72°C延伸 3 分鐘。PCR 體系為引物 pBD2-bc-F I μ L, pBD2-bc-R-Kl μ L, 10X dNTP 2 μ L, IOXExTaq Buffer 2 μ L，ExTaq酶O. 5 μ L，加超純水補充體系到20 μ L。PCR產物用PCR純化試劑盒(天根公司)純化，純化步驟詳見試劑盒說明書。純化產物送測序公司測序，測序結果用DNAman軟件比對正確。用EcoRI和KpnI酶切PCR純化的產物，酶切體系為PCR純化產物20 μ L， IOXbuffer 25 μ L，EcoRI和KpnI各3 μ L，滅菌超純水補充體系到250 μ L，酶切條件是 37°C溫育3小時。畢赤酵母表達載體pPICZaA(Invitrogen公司)的酶切體系是PCR純化產物 25 μ L, IOXbuffer 25 μ L, EcoRI和KpnI各3 μ L，滅菌超純水補充體系到250 μ L，酶切條件是37°C溫育3小時。豬防御素pBD2多肽基因的酶切產物和pPICZaA的酶切產物用PCR純化回收試劑盒回收。回收后進行連接，連接體系是pPICZaA/EcoRI+KpnI 3 μ L，PCR酶切回收產物 3 μ L，10 X T4DNA連接buffer I μ L，T4-DNA連接酶I μ L，加滅菌超純水補充體系到10 μ L， 4°C過夜連接。連接產物轉化大腸桿菌熱激感受態JM109 (天根公司)。大腸桿菌熱激轉化的方法為將100 μ L感受態細胞在冰上融化，加入IOyL連結產物，輕輕敲打混勻，冰上放置20分鐘。42°C水浴熱擊90秒，取出置于冰上放置5分鐘，加 Λ 900 μ L的LB培養基。37°C搖床150rpm震蕩培養I小時后，取出200 μ L培養液涂布加 Λ 25 μ g/ μ L Zeocin抗生素的LB平板，37°C過夜培養。挑取單菌落做菌落PCR，PCR體系和條件如上所述。PCR產物經I. 8%瓊脂糖凝膠電泳的結果見圖3，PCR產物測序后，與預期片段的同源性達到100%。將構建的重組酵母豬防御素pBD2表達載體命名為pPIBD。實施例4豬防御素重組酵母菌的構建和陽性克隆子的篩選將pPIBD重組載體電擊轉化畢赤酵母GS115的感受態細胞，轉化產物涂布含 100 μ g/μ L Zeocin抗生素的YPD平板，30°C培養48小時。挑取克隆子進行PCR驗證。驗證正確的克隆子是陽性克隆子。GSl 15電轉感受態細胞的制備方法如下挑取畢赤酵母GS115 (Invitrogen)單菌落至5mL YPD培養基中，250rpm, 30 °C， 振蕩培養過夜；1%的接種量接種振蕩培養過夜的畢赤酵母X-33至IOOmL YPD培養基中， 30°C，250rpm,振蕩培養至 0D600nm I. 3—1. 5。菌液轉入 IOOmL 離心管,4000rpm, 4°C，離心5min,棄上清；用IOOmL冰預冷的無菌水重懸菌體，同上離心,棄上清；用50mL冰預冷的無菌水重懸菌體，同上離心，棄上清；4mL冰浴IM山梨醇重懸菌體，然后轉移到5mL離心管中， 同上離心,棄上清；200 μ L IM山梨醇重懸菌體，4°C放置備用。電擊轉化方法為90 μ L制備的感受態細胞中加入10 μ L線性去磷酸化質粒pPIBD，混勻；轉至冰預冷的電轉杯中，冰上放置5min進行電轉，參數設置為1500V，25uF，400Q。電轉后立即加入 ImL冰預冷的IM山梨醇，混勻轉入2mL離心管中，30°C復蘇2小時；不含有pBD2基因的空載體pPICZaA同時電轉化作為陰性對照。實施例5高產豬防御素轉化子的誘導表達挑取pPIBD陽性轉化子單克隆，接種至IOmL BMGY培養基中，28°C，250rpm搖至 0D600nm 4. O (對數生長期，大約16_18h);室溫4000g離心5min，收集細胞，去除上清，用 50mLBMMY培養基重懸細胞至0D600nml. O ;在250mL搖瓶中加入上述培養物，加蓋滅菌棉塞， 放入搖床繼續生長；每24h，加100%甲醇至終濃度2%，誘導72小時后取ImL培養基至
I.5mL離心管，室溫用水平離心機最大轉速離心5min，收集上清至新的離心管中。共挑取了 5個克隆進行抑菌試驗，以攜帶空載體pPICZaA的重組酵母為對照。抑菌實驗的方法是在每個無菌平皿中等距放入4個牛津杯，配制MH培養基(瓊脂含量I. 0% ) 15mL，濕熱滅菌后恒溫至60°C，加入5%金黃色葡萄球菌ATCC 6538菌液混勻，配制成帶金黃色葡萄球菌的瓊脂，震蕩混勻后直接倒在無菌培養皿中，緩緩轉動平板使培養基均勻鋪開。待其凝固，用無菌鑷子小心夾出牛津杯，4°C備用。每個孔中加入IOOyL 待測發酵上清，蓋好皿蓋，小心移至37°C培養箱，平皿正放靜置培養。培養20小時后，打開皿蓋，移去牛津杯，用卡尺測量抑菌圈直徑。結果表明，5個克隆的上清液均能抑制金黃色葡萄球菌，不同克隆之間的抑菌圈直徑也無顯著差異。而空白載體對照的上清液沒有出現抑菌圈。實施例6重組豬防御素酵母菌抑菌效價的測定挑取重組酵母菌，發酵培養后收集上清，-80°C冷凍10小時，用真空凍干機冷凍干燥24小時，收集凍干粉測定抑菌效價。抑菌實驗方法同實施例5。繪制青霉素的標準曲線，繪制方法為配置濃度為O. lIU/mL、0. 25IU/mL、lIU/mL、 2IU/mL、5IU/mL、20IU/mL的青霉素標準溶液。每個平皿等距4個小孔，間隔的3個中加入 O. 5IU/mL的青霉素O. lmL，將每兩個平皿組成一組，共6組，第一組的每個平皿的3個空牛津杯中加入O. lIU/mL的青霉素標準溶液O. lmL，第二組加入O. 25IU/mL的青霉素標準溶液
O.ImL,以此類推，把6個梯度的青霉素標準溶液加入平皿，37°C培養IOh，精確測量各抑菌圈的直徑。以6組所有O. 5IU/mL青霉素抑菌圈直徑的平均值為r’，各組O. 5IU/mL青霉素抑菌圈直徑的平均值與r’的差即為校正值t，梯度各個濃度直徑減去t再平方，即為曲線的橫坐標X，繪制的標準曲線如圖4所示。取2個平皿，每個平皿放4個牛津杯，一個作為空白對照，一個加入10U/mL的青霉素O. ImL,另外2個加入樣品(分別含有15mg和25mg的豬防御素pBD2多肽的畢赤酵母發酵液上清的凍干粉)，37°C培養IOh后，精確測量每個抑菌圈直徑，分別求出標準品溶液和樣品溶液所致的4個抑菌圈直徑的平均值，按照上述標準曲線的制備方法求得校正數后， 帶入方程求出樣品效價。15mg和25mg的豬防御素pBD2多肽的畢赤酵母發酵液上清的凍干粉的效價分別為4. 5U/mL和6U/mL，如圖5所示。實施例7酵母分泌表達的豬防御素pBD2的抑菌譜和最小抑菌濃度采用比濁法鑒定豬防御素重組酵母菌菌發酵上清液凍干粉的抑菌譜和最小抑菌濃度，測試菌株是常見豬病原菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬鏈球菌、沙門氏菌和副豬嗜血桿菌。比濁法的試驗方法為I、檢測菌液的制備取各豬病原菌液體培養物，接種于M-H液體培養基中，37°C培養16-17h，并用M-H培養基調整其菌液濃度，使其在650nm處的吸收值為I. O左右；2、樣品的準備準備36只試管，分為3組。分別裝上4ml的M_H培養基。高壓滅菌。 分別兩次稱取防御素的凍干樣品32000μ g，溶解在SmlM-H液體培養基，混勻，過濾除菌后， 從第I管中取4ml的培養基到第2管中，混勻后再從第2管中取4ml加入到第3管中，如此連續稀釋至第12管，保存第12管中4ml的M-H培養基(含有防御素)。含有M-H的試管中的防御素的濃度依次為:4000 μ g/ml、2000 μ g/ml、1000 μ g/ml、500 μ g/ml、250 μ g/ml、125 μ g/ ml、62. 5 μ g/ml>31. 25 μ g/ml、15. 625 μ g/ml、7. 813 μ g/ml、3. 906 μ g/ml>I. 953 μ g/ml。3、比池法吸光度測定向各試管中加入100 μ L各病原菌培養液,放入恒溫搖床以轉速200r/min，37°C震蕩過夜培養。取過夜培養物200 μ L，加入2800 μ L M-H液體培養基中，分光光度計測定波長650nm處的吸光值。豬防御素重組菌發酵液凍干粉的抑菌譜和最小抑菌濃度如表I所示。表I酵母分泌表達的豬防御素pBD2對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬鏈球菌、沙門氏菌和副豬嗜血桿菌的抑菌效果和最小抑菌濃度
權利要求
1.一種豬防御素PBD2多肽，其為1)由SEQID No. 2所示的氨基酸組成的蛋白質；或2)在SEQID No. 2所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求I所述多肽的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. I所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4所述載體的重組菌。
6.如權利要求5所述的重組菌，其特征在于，其為酵母菌。
7.一種制備權利要求I所述多肽的方法，其為通過發酵權利要求5或6所述的重組菌進行制備。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，通過高密度發酵權利要求6所述的重組菌進行制備，具體包括如下步驟1)將所述的重組菌的種子液以體積百分比4 6%的接種量接種至含有10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨、5g/L葡萄糖和lg/L消泡劑的發酵培養基中進行菌體培養；2)當培養基中的溶解氧消耗完后并再度升至80%以上時，以體積百分比I 3%的流加量每隔5 7小時流加100%甲醇，控制培養基中的溶解氧濃度大于20%，28°C攪拌誘導培養3-6天。
9.權利要求I所述多肽或根據權利要求7或8所述方法發酵得到的上清液在抑制豬病原菌中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的豬病原菌選自金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌、豬鏈球菌、沙門氏菌和/或副豬嗜血桿菌。
全文摘要
本發明公開了一種豬防御素pBD2多肽、編碼其的基因及其應用。本發明提供的豬防御素pBD2多肽，其為1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸組成的蛋白質；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質。本發明改造了豬防御素pBD2的多肽序列，并利用酵母工程菌進行體外表達，可以大量、廉價獲得有生物學活性的防御素，解決了天然防御素難于分離，化學合成法的生產成本昂貴的問題，有利于豬防御素的大規模生產。并且，發酵生產的豬防御素pBD2仍具有較高的生物活性，可抑制多種豬病原菌。
文檔編號A61K38/17GK102584977SQ201210037950
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月17日 優先權日2012年2月17日
發明者馮秋月, 劉鵬, 吳雅琨, 宋維平, 彭子欣, 王丹玉, 王安如, 王洪彬, 謝飛, 贠桂玲 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 哈爾濱大北農牧業科技有限公司, 漳州大北農農牧科技有限公司