一種豬icsi受精卵制備用操作皿的制作方法
【專利摘要】本發明設計一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，包括在Φ60mm的一次性細胞培養皿上依次制作設定尺寸的操作液微滴、用于制動的PVP微滴、注射針處理微滴、和精液培養微滴，所述精液培養微滴包括呈H型結構的第一精液培養微滴、精液篩選橋和第二精液培養微滴，利用精液篩選橋的作用，選取大量高質量精子。達到在短時間內實現大量豬ICSI操作目的，減少豬ICSI操作過程選擇精子的時間，減少卵母細胞在空氣中暴露的時間，提高豬ICSI胚胎的存活率。
【專利說明】
一種豬I CS I受精卵制備用操作皿的制作方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002]單精子卵胞楽內注射技術(IntracytoplasmicSperm Inject1n，簡稱:ICSI，也有稱之為:胞質內單精子注射技術)，對于轉基因豬和克隆豬的研究，以及用于研究異種器官移植的供體具有廣闊的應用前景，豬作為生物技術研究和應用中的一個理想動物模型，日益受到眾多研究者的青睞。然而，僅僅依靠通過采集體內胚胎是遠遠不夠的，因此，建立合理的體外胚胎生產技術是非常必要的，而長期困擾豬體外胚胎生產體系改進的一個主要因素是多精入卵的發生率較高。作為一種家畜胚胎工程新技術，采用ICSI可以解決豬的多精入卵問題。ICSI是在操作皿上，通過顯微操作系統，將選取的精子直接注射入體外培養成熟且已經消化掉顆粒細胞的卵母細胞內完成。因此，操作皿的制作方法直接關系到豬ICSI受精卵制備的效率及ICSI胚胎的早期發育。
[0003]實驗室進行豬ICSI的受精卵制備過程中，種豬精子人工采集并經過初步稀釋后，在17°C環境中大約可保存一周時間，但精子在采集、運輸、保存的過程中，受不可避免的種豬質量、外界環境溫度微量變化、運輸過程中的晃動等多種不利因素影響，儲存的精子中，都會有一定比例的死亡精子，且隨著保存時間的延長，死亡精子所占比率會快速遞增，在此期間質量好的精子還會主動吸附到死亡精子而形成一團，這就給ICSI操作帶來非常不利影響，為了解決這個問題，傳統方法是操作者ICSI之前，耗費大量時間對精子進行預處理;或者是ICSI過程中對精子進行選擇。然而不管采用哪種方法，其處理過程均會耗費大量時間和人力物力，比如對精子預處理時，需耗用大量液體進行死精子的篩選處理，一旦處理不夠徹底，將造成死精子及精液中雜質黏進注射針管壁現象，從而大大降低了 ICSI成功率，增加了受精卵制備成本。
[0004]常規ICSI操作皿包括:ICSI皿、PVP圓形微滴、PVP條形微滴和緩沖培養基微滴，進行ICSI操作的過程是吸取一定量含有精子的培養基加到PVP條形微滴中制動后即完成ICSI。現代技術中，在制備轉基因豬時，由于需要注射大量的豬ICSI胚胎，若采用傳統ICSI方法，勢必大大增加操作者選擇優良精子的時間，從而定增加了操作人員的工作強度且降低了工作效率。中國發明專利《一種ICSI操作皿制作方法KCN104480063A)所公開的，是專門針對部分男性人類嚴重少精、梗阻性無精癥患者的ICSI操作皿制作方法，該方法所依據的原理是:將精子培養基條形微滴由傳統方法的1.0yL，增量100倍為0.1mL，培養基內極少數質量好的精子會向長寬各為(1.8?2.2)cm、(0.4?0.6)cm的條形微滴邊緣移動，再從移動中的質量好的精子中選取一個，并用帶精子的顯微穿刺針將精子注射至卵子內即完成ICSI操作皿制作，采用該方法雖能在短時間內找到并吸取質量較好精子完成ICSI操作，減少卵子在培養箱外暴露時間，最大限度的減少溫度、濕度和CO2濃度變化對卵子紡錘體等超微結構的損傷。但并不能簡單的將該方法移植到豬ICSI的受精卵制備用操作皿制作中，其原因是:豬ICSI的目的是用來進行轉基因豬制備，而制備轉基因豬所需要移植的胚胎數要遠遠大于人，因此，豬ICSI時，需要操作者制備大量ICSI胚胎，需要同時選取大量高質量的精子，若采用《一種ICSI操作皿制作方法》(CN104480063A)所公開的方案，同樣存在效率低下問題;其二是《一種ICSI操作皿制作方法》(CN104480063A)所公開的方案中，培養基內僅有極少數質量好的精子向條形微滴邊緣移動，同時需要依靠熟練操作者細心的觀察才能發現其中質量最好精子，而豬ICSI操作過程中需要一次注入大量含精子培養基，再讓培養基中的高質量精子自動分選出來，方能達到縮短操作者選擇精子的時間，提高豬ICSI操作質量，并從一定程度上降低了操作人員的工作強度，提高了工作者的工作效率，達到省時省力即可篩選優質精子的目的。

【發明內容】

[0005]本發明是針對【背景技術】所提出問題，設計一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，達到在短時間內實現大量豬ICSI操作目的，減少豬ICSI操作過程選擇精子的時間，減少卵母細胞在空氣中暴露的時間，提高豬ICSI胚胎的存活率。
[0006]為了達到所述目的，本發明所采用的技術方案是:
一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，其特征在于:所述制作步驟及制作條件如下:
步驟一:用6118011200微升移液器吸取150仙的1^-199，在0 60111111的一次性細胞培養皿的圓心沿X軸正負向做一個長2 ± 0.2cm、寬0.5 ± 0.1?11的長方形^11-199操作液微滴(4)，所述操作液微滴(4)用于放置豬卵母細胞并進行ICSI操作;設定所述一次細胞培養皿的圓心為原點；
步驟二:在按步驟一完成的操作液微滴(4)的上側和下側平行位置，各做一個與操作液微滴(4)平行且長寬尺寸相等的濃度為7%?9%的PVP微滴，其中:位于操作液微滴(4)上側的是上PVP微滴(3 )、位于位于操作液微滴(4)下側的是下PVP微滴(5 )，所述上PVP微滴(3 )和下PVP微滴(5)均用于精子的制動操作；
步驟三:分別在按步驟二中完成的上PVP微滴(3)的上側和下PVP微滴(5)的下側，各做三個10 土 1.0yL的濃度為7%?9%的PVP注射針處理微滴，其中:位于上PVP微滴(3)上側的三個微滴是上注射針處理微滴(2)、位于下PVP微滴(5)下側的三個微滴是下注射針處理微滴
(6)，所述上注射針處理微滴(2)和下注射針處理微滴(6)均用于顯微注射針注射前的潤洗以及，豬ICSI操作過程中管壁粘有精子時的注射針處理；
步驟四:在按步驟一完成的操作液微滴(4)的X軸負向緊靠培養皿的邊緣部位，沿Y軸正負方向做一個高I 土 I.0cm、寬0.4 ±0.1cm的第一精液培養微滴(1.1)，所述第一精液培養微滴(1.1)用于放置精子;再在所述第一精液培養微滴(I.I)的中部沿X軸正向，用受精液做一長I ± 0.lcm、寬0.1 ± 0.05cm的用于精子游動的精液篩選橋(1.2)；最后在所述精液篩選橋(1.2 )的右端，沿Y軸正負方向做一高2 ± 0.2cm、寬0.5 ± 0.1 cm的第二精液培養微滴(1.3)。其有益效果是:大量位于第一精液培養微滴(1.1)的精子，經沿又窄又長的精液篩選橋
(1.2)正向游動，最后能夠順利到達第二精液培養微滴(1.3)的部分精子即為高質量的可用備選精子。
[0007]步驟五:將石蠟油覆蓋在按步驟一?步驟四制作完成的所有微滴及精液篩選橋
(1.2)上; 步驟六:用顯微注射針直接在第二精液培養微滴(1.3)中吸取質量較好的精子，再注射在上PVP微滴(3 )或下PVP微滴(5 )中進行制動，再在上PVP微滴(3 )或下PVP微滴(5 )中吸取制動后的精子，在操作液微滴(4)中進行注射，注射操作之前，先將注射針置于上注射針處理微滴(2)或下注射針處理微滴(6)共六個微滴中的任一個微滴中進行潤洗，注射時，用固定針將卵母細胞的極體處于12點或者6點鐘位置，注射針從卵母細胞的3點鐘方向進去，注入精子后，輕輕反復回吸胞質，保證精子注射卵母細胞內，注射完成后輕輕退針，完成一個豬ICSI胚胎的制備。其有益效果是:注射操作之前，先將注射針置于六個10tiL8%PVP微滴中的任一微滴中進行潤洗，以保證注射時注射針管壁的平滑，避免精子粘在注射針的管壁不能夠順暢的注射入卵母細胞中。
[0008]所述步驟一中TCM-199操作液微滴(4)的配方為:添加7.Syg/mL細胞松弛素和4mg/mL牛血清白蛋白的HEPES緩沖的TCM-199 ；
所述步驟四中受精液的配方為:113.1mM NaCL，3mM KCL,7.5mM CaCL2.2H20 ,20mMTri s, I ImM Glucose ,5mM Sodium pyruvate,lOOIU/mL Penicillin,100yg/mLStreptomycin Sulphate，按此配方稱重后，溶于純水中。
[0009]本發明一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法所依據的原理是:本發明中豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法中所做的精子微滴由第一精液培養微滴(1.1)、精液篩選橋(1.2)和第二精液培養微滴(1.3)三部分組成，其中精液篩選橋(1.2)可以作為活力較強精子篩選的通道，活力較強的精子通過精液篩選橋(1.2)較窄的通道快速游出到第二精液培養微滴(1.3)中并很快移動至微滴邊緣，操作者在微滴邊緣即可快速吸取大量質量較好的精子用于制動并進行注射，減少了篩選死精子的時間，同時避免死精子及精液中雜質黏進注射針管壁的危險。
[0010]采用本發明中提供的技術方案可以得到如下的效果:
本發明提供了一種新的豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，使用過程中，操作者能夠快速、方便的吸取質量較好的精子，減少了操作者選擇精子的時間，提高操作者的注射效率，減少卵母細胞在空氣中暴露的時間，提高注射后豬ICSI受精卵的存活率和卵裂率。
[0011]在制備轉基因豬時，由于需要注射大量的豬ICSI胚胎，采用本發明中提供的方法制作豬ICSI操作皿，可以大大縮短操作者選擇精子的時間，從一定程度上降低了操作人員的工作強度，提高了工作者的工作效率。
【附圖說明】
[0012]圖1是本發明一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法示意圖。
[0013]圖1中標記:1.1一第一精液培養微滴，1.2—精液篩選橋，1.3—第二精液培養微滴，2—上注射針處理微滴，6—下注射針處理微滴，3—上PVP微滴，5—下PVP微滴，4 一操作液微滴。
【具體實施方式】
[0014]下面結合附圖對技術方案的實施作進一步的詳細描述，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制，凡在本發明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換或改進等，均應包含在本發明的權利要求范圍之內，本技術方案中未詳細述及的，均為公知技術。
[0015]參見圖1，本發明一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，其制作步驟及制作條件如下:
步驟一:用6118011200微升移液器吸取150仙的1^-199，在0 60111111的一次性細胞培養皿的圓心沿X軸正負方向做一個長2cm、寬0.5cm的長方形TCM-199操作液微滴4，所述操作液微滴4用于放置豬卵母細胞并進行ICSI操作;設定所述一次細胞培養皿的圓心為原點；
步驟二:在按步驟一完成的操作液微滴4的上側和下側平行位置，各做一個與操作液微滴4平行且長寬尺寸相等的濃度為8%的PVP微滴，其中:位于操作液微滴4上側的是上PVP微滴3、位于位于操作液微滴4下側的是下PVP微滴5，所述上PVP微滴3和下PVP微滴5均用于精子的制動操作；
步驟三:分別在按步驟二中完成的上PVP微滴3的上側和下PVP微滴5的下側，各做三個1yL的濃度為8%的PVP注射針處理微滴，其中:位于上PVP微滴3上側的三個微滴是上注射針處理微滴2、位于下PVP微滴5下側的三個微滴是下注射針處理微滴6，所述上注射針處理微滴2和下注射針處理微滴6均用于顯微注射針注射前的潤洗以及，豬ICSI操作過程中管壁粘有精子時的注射針處理；
步驟四:在按步驟一完成的操作液微滴4的X軸負向緊靠培養皿的邊緣部位，沿Y軸正負方向做一個高lcm、寬0.4cm的第一精液培養微滴1.1，所述第一精液培養微滴1.1用于放置精子;再在所述第一精液培養微滴1.1的中部沿X軸正向，用受精液做一長lcm、寬0.1cm的用于精子游動的精液篩選橋I.2;最后在所述精液篩選橋1.2的右端，沿Y軸正負方向做一尚2cm、寬0.5cm的第二精液培養微滴1.3。這時大量位于第一精液培養微滴1.1中的精子，經沿又窄又長的精液篩選橋1.2正向游動，最后能夠到達第二精液培養微滴1.3的精子即為高質量的可用備選精子。
[0016]步驟五:將石蠟油覆蓋在按步驟一?步驟四制作完成的所有微滴及精液篩選橋1.2 上；
步驟六:用顯微注射針直接在第二精液培養微滴1.3中吸取質量較好的精子，再注射在上PVP微滴3或下PVP微滴5中進行制動，再在上PVP微滴3或下PVP微滴5中吸取制動后的精子，在操作液微滴4中進行注射，注射操作之前，先將注射針置于上注射針處理微滴2或下注射針處理微滴6共六個微滴中的任一個微滴中進行潤洗，注射時，用固定針將卵母細胞的極體處于12點或者6點鐘位置，注射針從卵母細胞的3點鐘方向進去，注入精子后，輕輕反復回吸胞質，保證精子注射卵母細胞內，注射完成后輕輕退針，完成一個豬ICSI胚胎的制備。注射操作之前，先將注射針置于其中任意一個10uL8%PVP微滴中進行潤洗，以保證注射時注射針管壁的平滑，避免精子粘在注射針的管壁不能夠順暢的注射入卵母細胞中。
[0017]所述步驟一中TCM-199操作液微滴4的配方為:添加7.Syg/mL細胞松弛素和4mg/mL牛血清白蛋白的HEPES緩沖的TCM-199 ；
所述步驟四中受精液的配方為:113.1mM NaCL，3mM KCL,7.5mM CaCL2.2H20 ,20mMTri s, I ImM Glucose ,5mM Sodium pyruvate,lOOIU/mL Penicillin,100yg/mLStreptomycin Sulphate，按此配方稱重后，溶于純水中。
[0018]本發明一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法所依據的原理是:本發明中豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法中所做的精子微滴由第一精液培養微滴1.1、精液篩選橋1.2和第二精液培養微滴1.3三部分組成，其中精液篩選橋1.2可以作為活力較強精子篩選的通道，活力較強的精子通過精液篩選橋1.2較窄的通道快速游出到第二精液培養微滴1.3中并很快移動至微滴邊緣，操作者在微滴邊緣即可快速吸取大量質量較好的精子用于制動并進行注射，減少了篩選死精子的時間，同時避免死精子及精液中雜質黏進注射針管壁的危險。
[0019]本發明所用操作皿為美國NEST公司生產:型號705001。
[0020]本發明中所用顯微注射針為美國Sunlight Medical公司生產，型號H07047BH。
[0021]在本發明的描述中，需要理解的是，術語“中心”、“縱向”、“橫向”、“長度”、“寬度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“頂”、“底” “內”、“外”、“順時針”、“逆時針”、“軸向”、“徑向”、“周向”等指示的方位或位置關系為基于附圖所示的方位或位置關系，僅是為了便于描述本發明和簡化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構造和操作，因此不能理解為對本發明的限制。
[0022]此外，術語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括至少一個該特征。在本發明的描述中，“多個”的含義是至少兩個，例如兩個，三個等，除非另有明確具體的限定。
[0023]在本發明中，除非另有明確的規定和限定，術語“安裝”、“相連”、“連接”、“固定”、“固連”等術語應做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或成一體;可以是機械連接，也可以是電連接;可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個元件內部的連通或兩個元件的相互作用關系，除非另有明確的限定。對于本領域的普通技術人員而言，可以根據具體情況理解上述術語在本發明中的具體含義。
[0024]在本發明中，除非另有明確的規定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接觸，或第一和第二特征通過中間媒介間接接觸。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或僅僅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或僅僅表示第一特征水平高度小于第二特征。
【主權項】
1.一種豬ICSI受精卵制備用操作皿的制作方法，其特征在于:所述制作步驟及制作條件如下: 步驟一:用Gilson200微升移液器吸取150yL的TCM-199，在Φ60πιπι的一次性細胞培養皿的圓心沿X軸正負向做一個長2 ± 0.2cm、寬0.5 ± 0.1 cm的長方形TCM-199操作液微滴⑷，所述操作液微滴(4)用于放置豬卵母細胞并進行ICSI操作;設定所述一次細胞培養皿的圓心為原點； 步驟二:在按步驟一完成的操作液微滴(4)的上側和下側平行位置，各做一個與操作液微滴(4)平行且長寬尺寸相等的濃度為7 %?9%的PVP微滴，其中:位于操作液微滴(4)上側的是上PVP微滴(3)、位于位于操作液微滴(4)下側的是下PVP微滴(5)，所述上PVP微滴(3)和下PVP微滴(5)均用于精子的制動操作； 步驟三:分別在按步驟二中完成的上PVP微滴(3)的上側和下PVP微滴(5)的下側，各做三個10 土 I.0yL的濃度為7 %?9 %的PVP注射針處理微滴，其中:位于上PVP微滴(3)上側的三個微滴是上注射針處理微滴(2)、位于下PVP微滴(5)下側的三個微滴是下注射針處理微滴(6)，所述上注射針處理微滴(2)和下注射針處理微滴(6)均用于顯微注射針注射前的潤洗以及，豬ICSI操作過程中管壁粘有精子時的注射針處理； 步驟四:在按步驟一完成的操作液微滴(4)的X軸負向緊靠培養皿的邊緣部位，沿Y軸正負方向做一個高I ± I.0cm、寬0.4 ±0.1 cm的第一精液培養微滴(1.1)，所述第一精液培養微滴(1.1)用于放置精子;再在所述精液培養微滴(1.1)的中部沿X軸正向，用受精液做一長I±0.lcm、寬0.1 ±0.05 cm的用于精子游動的精液篩選橋(1.2)；最后在所述精液篩選橋(I.2)的右端，沿Y軸正負方向做一高2 ±0.2cm、寬0.5 ±0.Icm的第二精液培養微滴(1.3)；步驟五:將石蠟油覆蓋在按步驟一?步驟四制作完成的所有微滴及精液篩選橋(1.2)上； 步驟六:用顯微注射針直接在第二精液培養微滴(1.3)中吸取質量較好的精子，再注射在上PVP微滴(3)或下PVP微滴(5)中進行制動，再在上PVP微滴(3)或下PVP微滴(5)中吸取制動后的精子，在操作液微滴(4)中進行注射，注射操作之前，先將注射針置于上注射針處理微滴(2)或下注射針處理微滴(6)共六個微滴中的任一個微滴中進行潤洗，注射時，用固定針將卵母細胞的極體處于12點或者6點鐘位置，注射針從卵母細胞的3點鐘方向進去，注入精子后，輕輕反復回吸胞質，保證精子注射卵母細胞內，注射完成后輕輕退針，完成一個豬ICSI胚胎的制備； 所述步驟一中TCM-199操作液微滴(4)的配方為:添加7.5yg/mL細胞松弛素和4mg/mL牛血清白蛋白的HEPES緩沖的TCM-199 ； 所述步驟四中受精液的配方為:113.1mM NaCL，3mM KCL,7.5mM CaCL2.2H20 , 20mMTri s, I ImM Glucose ,5mM Sodium pyruvate,lOOIU/mL Penicillin,100yg/mLStreptomycin Sulphate，按此配方稱重后，溶于純水中。
【文檔編號】C12N5/073GK105861423SQ201610242170
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月19日
【發明人】張立蘋, 鄭新民, 肖紅衛, 劉西梅, 畢延震, 李莉, 華再東, 華文君, 任紅艷
【申請人】湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所