專利名稱：一種順鉑長循環脂質體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及順鉬長循環脂質體及其制備方法。
背景技術：
順鉬自1978年被批準為抗腫瘤藥物后，在臨床的應用非常廣泛。順鉬可以單獨或與其他藥物聯合使用來治療不同的癌癥，如膀胱癌、卵巢癌、頭頸癌以及肺癌等。順鉬具有較高的細胞毒性，一般認為，其在進入細胞內部后被水解，形成具有高活性的水合順鉬。水合順鉬與DNA形成共軛物，從而導致DNA 二級結構發生變化，阻礙DNA的轉錄和復制，最終導致細胞的凋亡。然而，順鉬對腫瘤細胞缺乏特異性，它在病灶殺滅腫瘤細胞的同時，也殺傷體內的正常細胞，產生嚴重的毒副作用。脂質體作為藥物載體安全無毒、生物相容性好。具有合適粒徑，高載藥量的脂質體可以被動靶向腫瘤組織，降低藥物毒性。而長循環脂質體更是能夠避免脂質體被巨噬細胞吞噬，使脂質體順利到達腫瘤組織。因此，長循環脂質體具有越來越高的實際應用價值。將順鉬制備成長循環脂質體能夠降低順鉬毒副作用，然而順鉬脂質體的制備面臨兩個難題。 第一，順鉬親脂性差且水溶性不佳，在水中的溶解度4°C時約lmg/ml ；第二，順鉬只能通過被動的方法載入脂質體內，無法參照已上市的阿霉素脂質體Doxil等進行pH梯度主動載藥。上述兩個原因通常造成順鉬脂質體的載藥量較低。目前已經進入臨床試驗的順鉬脂質體SPI-077通過加熱增加順鉬的溶解度。SPI-077制備過程中，水化溫度為65°C。在此溫度下，順鉬具有較高的溶解度，約為8mg/ml。但是此方法制備的順鉬長循環脂質體載藥量依然較低，到達腫瘤部位后釋藥不足，導致抗腫瘤活性降低。有人將順鉬轉化成順鉬衍生物 CDDP3，它具有較高的水溶性，且在氯離子存在下容易轉化為CDDP。然后通過靜電作用力將 CDDP載入脂質體或其他載體中。這一方法不僅解決了順鉬溶解性的問題，同時靜電作用力能夠提高脂質體的載藥量，但是制備方法相當繁瑣。有專利報道，帶正電荷的水合順鉬與帶負電荷的磷脂酰甘油衍生物在適當比例的乙醇水溶液中形成膠束，再將膠束用磷脂材料包裹形成脂質體，該專利產品Lipoplatin目前已進行臨床三期試驗。因此，利用帶負電荷的磷脂酰甘油衍生物來通過靜電作用力實現順鉬高載藥量的目的是可行的。

發明內容
本發明的目的是提供具有較高載藥量的順鉬長循環脂質體及其一種更為簡單易行的制備方法。該脂質體的制備建立在Lipoplatin的基礎上，省略膠束的制備過程，直接制得脂質體。該脂質體的高載藥量是通過帶負電荷的磷脂材料與帶正電荷的水合順鉬靜電作用實現的。本發明提供的順鉬長循環脂質體的制備方法先得到帶有負電荷的磷脂材料，再制備帶正電荷的水合順鉬溶液，最后在水相體系中，將帶正電的水合順鉬和帶負電荷的磷脂材料通過靜電作用，制得順鉬長循環脂質體。上述順鉬長循環脂質體，其特征在于，帶負電荷的磷脂材料中含有帶負電荷的磷脂酰甘油脂質衍生物。順鉬長循環脂質體，其特征在于，上述磷脂酰甘油脂質衍生物選自于以下一種或幾種的組合二棕櫚酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二癸酰基磷脂酰甘油(DCPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)和二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)。順鉬長循環脂質體，其特征在于，帶負電荷的磷脂材料的用量為20% 50%。
順鉬長循環脂質體，其特征在于，磷脂材料還包含電中性組分膽固醇、大豆磷脂酰膽堿(SPC)、甲氧基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)。順鉬長循環脂質體，其特征在于，膽固醇用量為7% 15%，SPC用量為30% 60%, mPEG-DSPE 用量為 7% 15%。順鉬長循環脂質體，其特征在于，帶正電荷的水合順鉬的制備，是將順鉬溶解于雙蒸水中，攪拌使其充分水合制得，或者是將順鉬與硝酸銀溶于雙蒸水中，反應后棄去沉淀制得。更具體的，本發明提供一種順鉬長循環脂質體的制備方法a)將適量的DPPG，SPC，膽固醇，mPEG-DSPE置于250ml的茄形瓶中，加入適量氯仿甲醇=2 1的混合溶液使磷脂材料溶解，將茄形瓶接入旋轉蒸發儀，最大轉速旋轉蒸發除去有機溶劑，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥過夜，除盡有機溶劑。b)將摩爾比DPPG 順鉬為1 2. 5 1量的順鉬置于西林瓶中，加入適當體積的雙蒸水，在50°C，轉速為300rpm條件下恒溫磁力攪拌器中攪拌4h。或者將摩爾比2 1的硝酸銀溶液與順鉬溶液反應，棄去沉淀，得水合順鉬。c)將上述所得水合順鉬溶液加入磷脂膜中，50°C水化30min得順鉬長循環脂質體。


圖1為實施例5順鉬長循環脂質體與順鉬注射劑體外釋放曲線圖2為實施例5順鉬長循環脂質體與順鉬注射劑體外細胞毒性試驗數據曲線
具體實施例方式實施例1a)帶負電荷磷脂薄膜的制備將7. 5mg 的 DPPG，16mg 的 SPC，4mg 膽固醇，4. 2mg 的 mPEG-DSPE 置于 250ml 的茄形瓶中，加入15ml氯仿甲醇=2 1的混合溶液使磷脂材料溶解，將茄形瓶接入旋轉蒸發儀，最大轉速旋轉蒸發除去有機溶劑，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥過夜，除盡有機溶劑。b)水合順鉬制備將;3mg的順鉬置于西林瓶中，加入的雙蒸水，在50°C，轉速為300rpm條件下恒溫磁力攪拌器中攪拌4h。c)順鉬長循環脂質體的制備將上述所得水合順鉬溶液加入磷脂膜中，50°C水化30min得順鉬長循環脂質體。實施例1-實施例5的包封率和載藥量測定按如下方法進行通過葡聚糖G-50柱分離制備的順鉬長循環脂質體中的脂質體與游離藥物。收集游離藥物。脂質體破乳劑選用 5%的Triton X-IOO0按照中國藥典2010版二部附錄VB高效液相色譜法，在220nm波長處測定順鉬的峰面積，另精密稱取對照品適量，同法測定，以外標法計算順鉬的包封率和載藥量。實施例1順鉬長循環脂質體的包封率為50%，載藥量為4. 3%。說明當DPPG用量為22%，SPC用量為46%，膽固醇用量為12%，mPEG-DSPE用量為12%時，載藥量較高，載藥量高于SPI-077 (文獻報道載藥量為1 % )。實施例2a)帶負電荷磷脂薄膜的制備將11. 3mg 的 DPPG，16mg 的 SPC，4mg 膽固醇，4. 2mg 的 mPEG-DSPE 置于 250ml 的茄形瓶中，加入15ml氯仿甲醇=2 1的混合溶液使磷脂材料溶解，將茄形瓶接入旋轉蒸發儀，最大轉速旋轉蒸發除去有機溶劑，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥過夜，除盡有機溶劑。b)水合順鉬制備將;3mg的順鉬置于西林瓶中，加入的雙蒸水，在50°C，轉速為300rpm條件下恒溫磁力攪拌器中攪拌4h。c)順鉬長循環脂質體的制備將上述所得水合順鉬溶液加入磷脂膜中，50°C水化30min得順鉬長循環脂質體。本實施例中，順鉬的包封率為51%，載藥量為4.0%。說明當DPPG用量為四％， SPC用量為42%，膽固醇用量為10%，mPEG-DSPE用量為11 %時載藥量較高，載藥量高于 SPI-077(文獻報道載藥量為)。實施例3a)帶負電荷磷脂薄膜的制備將15mg 的 DPPG，16mg 的 SPC，4mg 膽固醇，4. 2mg 的 mPEG-DSPE 置于 250ml 的茄形瓶中，加入15ml氯仿甲醇=2 1的混合溶液使磷脂材料溶解，將茄形瓶接入旋轉蒸發儀，最大轉速旋轉蒸發除去有機溶劑，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥過夜，除盡有機溶劑。b)水合順鉬制備將;3mg的順鉬置于西林瓶中，加入的雙蒸水，在50°C，轉速為300rpm條件下恒溫磁力攪拌器中攪拌4h。c)順鉬長循環脂質體的制備將上述所得水合順鉬溶液加入磷脂膜中，50°C水化30min得順鉬長循環脂質體。本實施例中，順鉬的包封率為56%，載藥量為4.0%。說明當DPPG用量為36%， SPC用量為38 %，膽固醇用量為9%，mPEG-DSPE用量為10 %時載藥量較高，載藥量高于 SPI-077 (文獻報道載藥量為1 % )。實施例4a)帶負電荷磷脂薄膜的制備將30mg 的 DPPG，32mg 的 SPC，8mg 膽固醇，8. 4mg 的 mPEG-DSPE 置于 250ml 的茄形瓶中，加入15ml氯仿甲醇=2 1的混合溶液使磷脂材料溶解，將茄形瓶接入旋轉蒸發儀，最大轉速旋轉蒸發除去有機溶劑，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥過夜，除盡有機溶劑。b)水合順鉬制備將6mg的順鉬置于西林瓶中，加入的雙蒸水，在50°C，轉速為300rpm條件下恒溫磁力攪拌器中攪拌4h。c)順鉬長循環脂質體的制備將上述所得水合順鉬溶液加入磷脂膜中，50°C水化30min得順鉬長循環脂質體。本實施例中，順鉬的包封率為73%，載藥量為5.2%。說明當DPPG用量為36%，SPC用量為38%，膽固醇用量為9%，mPEG-DSPE用量為10%時，適當提高磷脂和順鉬的濃度，包封率和載藥量提高。實施例5a)帶負電荷磷脂薄膜的制備將30mg 的 DPPG，32mg 的 SPC，8mg 膽固醇，8. 4mg 的 mPEG-DSPE 置于 250ml 的茄形瓶中，加入15ml氯仿甲醇=2 1的混合溶液使磷脂材料溶解，將茄形瓶接入旋轉蒸發儀，最大轉速旋轉蒸發除去有機溶劑，形成磷脂薄膜。磷脂膜真空干燥過夜，除盡有機溶劑。b)水合順鉬制備將IOmg的順鉬置于西林瓶中，加入IOml的雙蒸水，在50°C中溶解，再將153mg硝酸銀溶于IOml雙蒸水中，配置濃度為90mM的硝酸銀溶液，取720 μ 1的硝酸銀溶液加入上述順鉬溶液中，50°C條件下充分反應，棄去沉淀，即得水合順鉬。c)順鉬長循環脂質體的制備將上述所得水合順鉬溶液加入磷脂膜中，50°C水化30min得順鉬長循環脂質體。本實施例中，順鉬的包封率為80%，載藥量為9.0%。說明當DPPG用量為34%， SPC用量為36%，膽固醇用量為9%，mPEG-DSPE用量為10%時，應用硝酸銀沉淀法制備水合順鉬可使包封率和載藥量提高。用激光散射法測定實施例5中順鉬長循環脂質體的粒徑和粒徑分布。測定條件 波長633nm，溫度25°C，角度為90°。從測定結果可知，順鉬長循環脂質體的平均粒徑為118nm。實施例5中，測得順鉬長循環脂質體的表面帶負電荷，大小為-44mv。圖1是實施例5制備的順鉬長循環脂質體和順鉬注射劑的體外釋放曲線。體外釋放測定方法精密移取新鮮制備的經過純化的順鉬脂質體2ml于透析袋中(30KD)。放入 20ml釋放介質中，分別于0、1、2、4、8、16、24、36、48、7池取樣lml，同時補充新鮮介質lml，按中國藥典2010順鉬含量測定方法測定順鉬峰面積，計算累計釋放百分率。試驗結果表明順鉬長循環脂質體體外具有緩釋效果。圖2是實施例5制備的順鉬長循環脂質體和順鉬注射劑體外細胞毒性試驗數據曲線。測定方法將A549肺癌細胞用胰酶消化稀釋后接種到96孔板，每孔接種90 μ L含細胞5000個，培養Mh ；細胞貼壁后，將不同濃度的脂質體依次加到96孔板上，每孔10 μ L， 終濃度為100、50、10、2、1、0. lmg/L，每個濃度設為5個復孔，每塊板設一組正常對照組(加 10 μ L純凈水，不含脂質體)和空白凋零孔(只加培養液，不含細胞和脂質體)，在培養箱內培養48h。之后棄去上清液，然后每孔加MTT溶液20 μ L繼續孵育4h，終止培養。小心吸棄孔內培養上清液，再每孔加IOOyL溶解液，振蕩使結晶物充分溶解，最后進行比色。選擇 570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。細胞生長抑制率=(1-A實驗/A對照)*100%。實驗結果表明順鉬注射劑的IC5tl值為0. 002iaiig/ml，順鉬長循環脂質體的 IC50 值為 0. 00214mg/mL·說明順鉬長循環脂質體有不低于順鉬注射劑的殺死腫瘤細胞的能力。
權利要求
1.一種順鉬長循環脂質體的制備方法，其特征在于先得到帶有負電荷的磷脂材料，再制備帶正電荷的水合順鉬溶液，最后在水相體系中，將帶正電的水合順鉬和帶負電荷的磷脂材料通過靜電作用，制得順鉬長循環脂質體。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于帶負電荷的磷脂材料中含有帶負電荷的磷脂酰甘油脂質衍生物。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于磷脂酰甘油脂質衍生物選自于以下一種或幾種的組合二棕櫚酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二癸酰基磷脂酰甘油(DCPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)和二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于磷脂酰甘油脂質衍生物用量為20% 50%。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于磷脂材料中還包含電中性組分膽固醇、大豆磷脂酰膽堿(SPC)、甲氧基聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于膽固醇用量為7% 15 %，SPC用量為30 % 60%, mPEG-DSPE 用量為 7% 15%。
7.如權利要求1所述的方法，帶正電荷的水合順鉬的制備，其特征在于將順鉬溶解于雙蒸水中，攪拌使其充分反應，得水合順鉬。
8.如權利要求1所述的方法，帶正電荷的水合順鉬的制備，其特征在于將順鉬與硝酸銀溶解于雙蒸水中，反應后棄去沉淀，得水合順鉬。
全文摘要
本發明涉及一種順鉑長循環脂質體及其制備方法，主要解決順鉑毒性大，順鉑脂質體載藥量低的問題。該脂質體的制備依賴于帶負電荷的磷脂酰甘油衍生物與帶正電荷的水合順鉑之間的靜電作用力。本發明的順鉑長循環脂質體粒徑可以控制在120nm左右，具有較高的包封率與載藥量以及較好的穩定性，且制備方法簡單易行。
文檔編號A61K33/24GK102525928SQ201210037920
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月20日 優先權日2012年2月20日
發明者尹莉芳, 張書卉, 張陸勇, 朱春莉, 王廣基 申請人:中國藥科大學