專利名稱：保肝抗肝纖維化活性石斛多糖及其抗體親和層析制備方法
保肝抗肝纖維化活性石斛多糖及其抗體親和層析制備方法技術領域
本發明屬于植物提取物以及植物提取物的制備方法領域，具體涉及一種抗肝纖維化活性石斛多糖提取物及其抗體親和層析制備方法。
背景技術：
肝臟是人體內最重要的解毒器官，病毒因子、酒精、藥物等毒害物質與肝臟的頻繁接觸會導致肝損傷。肝損傷會造成細胞壞死、凋亡、炎癥、纖維化等病理變化，最終導致肝纖維化等各種肝臟疾病。肝纖維化是各種肝病惡化發展為肝硬化和肝癌的共同病理基礎，是導致肝病患者死亡的主要原因，對人類健康和生活質量有著極大的危害性。目前對肝損傷的治療主要依賴于藥物，但它們的療效有限，而且這些藥物的長期服用會產生新的肝損傷； 而當前臨床上尚缺乏療效確切、無明顯毒副作用的抗肝纖維化藥物。因此，對肝損傷、肝纖維化進行早期預防顯得尤為必要。研究表明，許多可食動植物原料中含有預防肝損傷、抑制肝纖維化的活性化學成分，如果以這些活性化學成分為保健因子研制出保肝保健食品，對肝損傷、肝纖維化的有效預防將具有重要意義。
石斛是衛生部規定的可用于保健食品的物品之一，作為傳統飲品在我國已有2000 多年的食用歷史。據報道，鐵皮石斛多糖對環孢素A致大鼠肝損傷有保護作用，霍山石斛多糖對亞硒酸鈉致大鼠肝損傷、肝纖維化有保護作用。當前，石斛多糖主要通過水提醇沉法獲得，如，公開號分別為CN 101015649A、CN 101407558A、CN 101407557A的發明專利公開了鐵皮石斛和金叉石斛多糖的水提醇沉制備方法。霍山石斛多糖是其發揮生理活性的物質基礎。目前，霍山石斛多糖的獲得是通過水提醇沉或水提醇沉后再通過離子交換柱進一步精制。水提醇沉法獲得的霍山石斛多糖產品純度低，純度不到30% 雖然通過離子交換柱進一步精制后提高了純度，但需要反復操作，產品得率低，一般只有40%左右。發明內容
為了解決現有霍山石斛多糖制備方法得率低、純度低等不足，本發明的目的在于提供一種產品純度高、質量可控、純化效率高的具有保肝抗肝纖維化霍山石斛多糖的抗體親和層析制備方法。
本發明保肝抗肝纖維化活性石斛多糖的化學結構式如下
權利要求
1. 一種保肝抗肝纖維化活性石斛多糖，其特征是該活性石斛多糖的化學結構式如下該活性石斛多糖的分子量為2. 2X IO4道爾頓，它是以葡萄糖和甘露糖為主鏈、半乳糖為分支的半乳葡甘聚糖，其中，葡萄糖、甘露糖和半乳糖的摩爾比為31 10 8。
2.保肝抗肝纖維化活性石斛多糖的提取、分離純化方法，其特征在于具體操作步驟如下(1)原料預處理取粉碎的石斛，用石油醚于溫度50°C回流5h，脫脂、脫色，放置于溫度 25°C環境，以揮發除去有機溶劑，得到石斛藥渣；(2)熱水浸提取石斛藥渣，按料液質量體積比1g 30ml加入蒸餾水，于溫度80°C 浸提60 min，得到浸提液；將浸提液在轉速15000 r/min條件下離心分離15 min，得到的離心沉淀物用80°C熱水再浸提兩次；合并三次收集的離心上清液，得到石斛浸提液；將石斛浸提液于溫度60°C條件下，減壓濃縮到濃縮液體積與石斛藥渣質量的比例為1 ml 3g，得到石斛濃縮液；石斛濃縮液用截留分子量為3000道爾頓的透析袋透析3天以除去小分子物質，得石斛透析截留液；(3)醇沉在石斛透析截留液中加入體積分數為95%的乙醇，使石斛透析截留液中乙醇終體積分數達到80%，于溫度4°C靜置72小時；在溫度4°C、轉速12000 r/min條件下，離心分離15分鐘，取沉淀，得到石斛沉淀物；(4)脫蛋白取石斛沉淀物，加入蒸餾水，配制成100mg/ml的石斛多糖水提液A，取石斛多糖水提液A，將氯仿按石斛多糖水提液A 1/5體積加入，隨之再加入氯仿體積1/5的丁醇，混合，劇烈振搖20 min,然后在溫度10°C、轉速12000 r/min條件下，離心分離15分鐘， 分去水層和溶液層交界處的變性蛋白質，得石斛多糖水提液B ；取石斛多糖水提液B，將氯仿按石斛多糖水提液B 1/5體積加入，隨之再加入氯仿體積 1/5的丁醇，混合，劇烈振搖20 min，然后在溫度10°C、轉速12000 r/min條件下，離心分離 15分鐘，分去水層和溶液層交界處的變性蛋白質，得石斛多糖水提液C;取石斛多糖水提液C，將氯仿按石斛多糖水提液C 1/5體積加入，隨之再加入氯仿體積 1/5的丁醇，混合，劇烈振搖20 min，然后在溫度10°C、轉速12000 r/min條件下，離心分離 15分鐘，分去水層和溶液層交界處的變性蛋白質，得石斛多糖水提液；(5 )純化①DEAE-52離子交換樹脂柱分級取石斛多糖水提液，通過DEAE-52高效陰離子交換樹脂柱，用苯酚硫酸法跟蹤檢測流出液，收集蒸餾水洗脫部分的主峰流出液A ；主峰流出液A用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析3天，收集透析濃縮液A ； kphacryl S-200凝膠樹脂柱分級取透析濃縮液A，通過kphacryl S-200凝膠樹脂柱，用苯酚硫酸法跟蹤檢測流出液，收集蒸餾水洗脫部分的主峰流出液B;主峰流出液B用截留分子量為2000道爾頓的透析袋透析3天，收集透析濃縮液B ；取透析濃縮液B，依次通過DEAE-52離子交換樹脂柱分級和kphacryl S-200凝膠樹脂柱分級，重復DEAE-52離子交換樹脂柱分級和kphacryl S-200凝膠樹脂柱分級操作步驟 8次，收集最后一次的透析濃縮液經冷凍干燥，得到活性石斛多糖；(6)活性石斛多糖的化學結構表征通過全水解分析、Smith降解反應、甲基化分析、紅外光譜分析，以及核磁共振波譜分析方法確定了活性石斛多糖的化學結構式如下
3.根據權利要求2所述的保肝抗肝纖維化活性石斛多糖的提取、分離純化方法，其特征在于所述石斛為新鮮的霍山石斛或干燥的霍山石斛。
4.抗體親和層析制備保肝抗肝纖維化活性石斛多糖的方法，其特征在于具體操作步驟如下(1)制備免疫原取活性石斛多糖溶解于PH值9.2的碳酸鹽緩沖液中，配制成質量分數為10 mg/ml的活性石斛多糖溶液，然后加入牛血清白蛋白，使活性石斛多糖溶液中的牛血清白蛋白的質量分數為10 mg/ml，攪拌混勻，置于溫度37°C的恒溫箱中反應3d，得到反應體系；加入乙醇胺，使反應體系中乙醇胺質量分數達到1%時終止反應，得反應液；反應液通過kphadex G-150凝膠柱分離，分部收集；分別采用苯酚-硫酸法和Bradford法測定每一管中活性石斛多糖和牛血清白蛋白含量，計算每摩爾活性石斛多糖分子連接的牛血清白蛋白摩爾分子數；取每摩爾活性石斛多糖分子連接有5摩爾牛血清白蛋白分子的偶聯物為活性石斛多糖-牛血清白蛋白免疫原，得到多糖復合物免疫原；(2)免疫小鼠將5mg多糖復合物免疫原溶于5 mL生理鹽水中，與等體積的弗氏完全佐劑雙推法混勻，得到免疫原溶液；采用腹腔注射免疫8周齡的雌性小鼠，每只小鼠注射免疫原溶液0.2 ml ;1周后的第七天，取5 mg多糖復合物免疫原溶于5 mL生理鹽水中，與等體積弗氏不完全佐劑混勻，得免疫原混合液；每只雌性小鼠腹腔注射0. 2 ml免疫原混合液進行加強免疫，加強免疫重復3次，每周1次；最后1次免疫后的第七天，剪尾取血，用酶聯免疫分析法(ELISA)測定小鼠血清中活性石斛多糖特異性抗體的效價；選擇血清中活性石斛多糖特異性抗體效價高于1 10000的小鼠用于細胞融合，并在細胞融合前4-5天，腹腔接種0.2 ml不含佐劑的質量分數為1.0 mg/mL的多糖復合物免疫原水溶液進行沖擊免疫， 獲得免疫小鼠；(3)細胞融合在無菌條件下取免疫小鼠的脾淋巴細胞制成每毫升含IXlO3 IXlO4 個細胞的細胞懸液，將細胞懸液于溫度4 °C、轉速1000 r/min的條件下離心10分鐘，取離心沉淀，得到免疫小鼠的脾淋巴細胞；取IXlO8個免疫小鼠的脾淋巴細胞與2X107個Balb/c小鼠SP2/0腫瘤細胞混合，預熱至37°C，緩慢加入Iml預熱至37°C的質量分數為50% 的聚乙二醇溶液，再慢慢加入10 ml預熱至37 ！的含質量分數為20%胎牛血清的DMEM完全培養基，細胞懸浮，于溫度4°C、轉速1000 r/min條件下離心10分鐘，棄上清，向沉淀中加入DMEM完全培養基5ml，細胞重新懸浮，分裝于96孔細胞培養板中，于溫度37 °C、體積分數為5%的二氧化碳(CO2)氣體、95%濕度的條件下培養1天，然后加入4XHAT培養液50 μ 1， 第6天用HAT培養液置換出96孔細胞培養板的培養孔中的1/2DMEM完全培養基，第11天用HT培養液置換出HAT培養液，獲得融合細胞；(4)制備活性石斛多糖單抗雜交瘤細胞株將融合細胞接種于HAT選擇培養基上，以多糖復合物免疫原為抗原，采用間接酶聯免疫分析法檢測融合細胞分泌的活性石斛多糖特異性抗體的效價，選擇抗體效價高于1 1000的融合細胞，得到能分泌活性石斛多糖特異性抗體的雜交細胞；采用有限稀釋法對所述雜交細胞在96孔細胞培養板中進行克隆化，采用間接酶聯免疫分析法檢測96孔細胞培養板上的克隆分泌在培養上清液中的活性石斛多糖特異性抗體的效價，選擇抗體效價高于1 100的單細胞克隆，得到陽性克隆；取陽性克隆采用有限稀釋法在96孔細胞培養板中進行三次克隆化，選擇能分泌活性石斛多糖特異性抗體的陽性克隆，得到雜交瘤細胞克隆；選擇抗體反應強、生長良好的雜交瘤細胞克隆接種于HAT培養基上，于溫度37 °C、體積分數為5%的二氧化碳(CO2)氣體、95%濕度的條件下培養三天，得到活性石斛多糖單抗雜交瘤細胞株；(5)制備活性石斛多糖單克隆抗體取10周齡的雌性小鼠，腹腔注射0.5 ml降植烷； 第七天每只雌性小鼠接種處于對數生長期的活性石斛多糖單抗雜交瘤細胞株5 X IO6個；第十四天采集雌性小鼠的腹水，將腹水于溫度4 °C、轉速5000 r/min的條件下，離心15分鐘， 收集上清液；采用辛酸一硫酸銨沉淀法沉淀上清液中的抗體A，抗體A通過kphadex G-150 凝膠柱層析，獲得抗體B ；分別采用PAGE和SDS-PAGE法鑒定抗體B的純度，同時用間接酶聯免疫分析法測定抗體B對活性石斛多糖的特異性；收集條帶均一、清晰可見的抗體B，冷凍干燥，得到活性石斛多糖單克隆抗體；(6)制備活性石斛多糖單抗免疫親和層析柱(A)瓊脂糖(SepharoseMB載體與抗體的偶聯取IOg活性石斛多糖單克隆抗體溶解于偶聯緩沖液中，然后置于截留分子量為2000 道爾頓的透析袋中透析M小時，取透析截留液配制成質量分數為0. 5 mg/ml的活性石斛多糖單克隆抗體水溶液，所述偶聯緩沖液的PH值為8. 2，偶聯緩沖液是含有0.5 Mol/L氯化鈉(NaCl)和0. 1 Mol/L碳酸氫鈉(NaHCO3)的水溶液；取經溴化氰活化的瓊脂糖4B15g， 用所述偶聯緩沖液快速抽洗5次，迅速倒入活性石斛多糖單克隆抗體溶液中進行偶聯，紫外掃描以監控偶聯過程；用偶聯緩沖液洗除未偶聯的活性石斛多糖單克隆抗體，得到瓊脂糖-抗體偶聯復合物；(B)封閉活化基團將瓊脂糖-抗體偶聯復合物加入到6倍體積的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液中，保持3小時以封閉瓊脂糖4B中未反應的基團；所述三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的PH值為8.0，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液為含有0.5 Mol/L氯化鈉和0.1 Mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸的水溶液；(C)裝柱將空柱用10倍柱體積的pH值7. 2、濃度0. 01 Mol/L的磷酸緩沖液洗滌，然后在底部放置一疏水篩板，并放入空柱1/8體積的pH值7. 2、濃度0. 1 Mol/L的磷酸緩沖液，得到預處理空柱；將步驟(A)得到的瓊脂糖-抗體偶聯復合物先用10倍瓊脂糖-抗體偶聯復合物體積的、pH值 4. 5的含有0. 5Mol/L氯化鈉的0. 1 Mol/L磷酸緩沖液洗滌三次，然后用10倍瓊脂糖-抗體偶聯復合物體積的、PH值8.0的含有0.5 Mol/L氯化鈉的0. 1 Mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液洗滌三次，再用5倍瓊脂糖-抗體偶聯復合物體積的、pH值7. 2、濃度0. 1 Mol/L的磷酸緩沖液洗滌三次，得到瓊脂糖-抗體偶聯復合物膠體；將瓊脂糖-抗體偶聯復合物膠體倒入預處理空柱中；待下沉，在瓊脂糖-抗體偶聯復合物膠體頂部加一濾紙片，并用10倍柱體積的pH值7. 2、濃度0. 1 Mol/L的磷酸緩沖液沖洗，以排除柱床中的氣泡，最后用pH值7. 2的含有質量分數為0. 01%疊氮化鈉的0. 1 Mol/L磷酸緩沖液保存，得到活性石斛多糖單抗免疫親和層析預裝柱；(7)抗體親和層析制備活性石斛多糖(a)平衡用平衡緩沖液以2 ml/min的流速平衡活性石斛多糖單抗免疫親和層析預裝柱，通過紫外檢測觀0 nm處吸光值監控預裝柱已平衡至基線，得到平衡層析柱；所述平衡緩沖液為PH值8. 0的含有0. 5 Mol/L氯化鈉的0. 1 Mol/L Tris-HCl水溶液；(b)上樣取石斛粗多糖配制成質量濃度為0. 2 mg/ml的上樣液， 將50 ml上樣液以2 ml/min的流速通過平衡層析柱，得到層析載樣柱；(c)洗脫用平衡緩沖液以2 ml/min的流速清洗層析載樣柱，通過紫外檢測洲0 nm處吸光值監控載樣柱已清洗至基線；用PH值4. 5的含有0. 5 Mol/L氯化鈉的0. 1 Mol/L磷酸洗脫液以1 ml/min的流速將石斛多糖從層析載樣柱洗脫下來，洗脫液體積為層析載樣柱體積的5倍；用苯酚硫酸法跟蹤檢測收集各管中石斛多糖含量，收集石斛多糖主峰流出液；石斛多糖主峰流出液冷凍干燥或噴霧干燥，得到活性石斛多糖；活性石斛多糖的化學結構式如下
5. 一種保肝抗肝纖維化活性石斛多糖的用途，其特征在于，該活性石斛多糖具有保肝、 抗肝纖維化活性，可用于制備保肝保健品以及治療肝纖維化的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種具有保肝抗肝纖維化活性的石斛多糖的化學結構式(見圖)，它是以葡萄糖和甘露糖為主鏈、半乳糖為分支的半乳葡甘聚糖，它的分子量約為2.2×104道爾頓，分子組成中的葡萄糖、甘露糖和半乳糖的摩爾比為31︰10︰8。本發明還分別公開了活性石斛多糖的提取、分離純化方法、活性石斛多糖的抗體親和層析制備方法。本發明制備的石斛多糖具有明顯的保肝、抗肝纖維化生理活性，可用于制備保肝的保健品和治療肝纖維化的藥物。
文檔編號A61P1/16GK102504043SQ20111036902
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者查學強, 潘利華, 羅建平 申請人:合肥工業大學