一種鐵皮石斛多糖的純化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種多糖的純化方法。
【背景技術】
[0002]石斛屬，于1799被Olaf Swartz發現，為蘭科最大屬之一，共有1100余種，廣泛分布于亞洲、歐洲及大洋洲等熱帶及亞熱帶地區。我國約有74余種石斛，主要分布于西南、華東及華南地區。在中國的所有石斛藥材中，鐵皮石斛被傳統的中醫認為有最好的藥用價值，自古以來便是我國的名貴藥材。現代中醫理論認為，鐵皮石斛(Dendrobium officinale)具有健脾養胃、滋陰補腎、潤肺生津等功效，用于治療慢性萎縮性胃炎、高血壓、糖尿病等，具備增強免疫力、抗腫瘤、抗衰老等功效。
[0003]石斛的化學成分多種多樣，其主要有效成分為石斛類多糖、生物堿等。從草本植物中分離得到的天然多糖被證明有著積極的生物活性，并且應用于免疫相關疾病的治療。20世紀80年代后期，中國研宄人員致力于石斛多糖的提取，目的是開發以多糖為基礎的有著增強機體健康功能的產品。然而，傳統的多糖純化方法步驟繁瑣、耗時長、損失大、且一次操作可以純化的樣品量少，無法實現純多糖的工業化制備，這也是困擾多糖發展的一大難題。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種鐵皮石斛多糖的高效純化方法，該方法操作簡便、耗能低、無淀粉污染、得率高，極大地提高了石斛多糖的純化效率。
[0005]經過大量研宄，本發明人發現由于淀粉在熱水中可以明膠化化并溶解，因此用熱水法提取的粗多糖會含有淀粉。組織化學研宄和冷場掃描電鏡證明石斛植物的薄壁細胞中存在淀粉顆粒，并且這些淀粉即為混雜于石斛多糖中的主要雜質成分。因此，高效率、低成本地去除淀粉，是制備鐵皮石斛多糖純品的關鍵步驟。發明人通過甲基化分析發現鐵皮石斛多糖中不存在首尾相連的α-1，4-葡萄糖苷鍵，所以工藝過程中采用α-淀粉酶處理非常有效地除去了石斛多糖中的淀粉。
[0006]本發明具體技術方案如下:
[0007]一種鐵皮石斛多糖的純化方法，步驟如下:
[0008]1、原料:以鐵皮石斛干品為原料；
[0009]2、粉碎:用粉碎機將鐵皮石斛干品進行粉碎；
[0010]3、過篩:粉碎后的原料進行分級過篩60-80目；
[0011]4、脫脂:將石斛粗粉用10-20倍有機溶劑回流2-4次進行脫脂，之后離心分離，去除有機溶劑，收集藥渣；
[0012]5、水提:向藥渣中加入20-40倍蒸餾水，在70°C溫度下進行水提，將上述水提液進行抽濾，獲得濾液，并重復水提3-4次，合并濾液；
[0013]6、真空濃縮:將所得濾液進行真空濃縮(真空度-0.1MPa)，濃縮至原有體積的1/6 ；
[0014]7、醇沉:向濃縮液中緩緩加入無水乙醇，邊攪拌，邊加入，當乙醇濃度達到80%時停止加入，20 °C靜置12-24h ；
[0015]8、離心分離:醇沉過夜后，將溶液進行離心，棄去上層有機試劑，收集沉淀；
[0016]9、多糖粗品:將沉淀置于通風處，使其中的乙醇揮發殆盡，冷凍干燥得到多糖粗品;
[0017]10、復溶:將粗多糖按質量比1:100復溶于水，邊溶解邊攪拌，直至完全溶解；
[0018]11、向溶液中加入耐熱型α-淀粉酶，水浴溫度為70°C，反應l_3h，期間不斷進行攪拌；
[0019]12、凍融離心:反應結束后，待溶液冷卻即放入-80°C冰箱中速凍，然后取出在25°C環境中融化，融化后離心，收集上清液，重復這一步驟3-4次；
[0020]13、透析:將所得溶液置于透析袋中進行透析，相對截留分子量為3500D，透析48h ；
[0021]14、醇沉:透析結束后，向溶液中加入3倍溶液體積的無水乙醇，邊加入邊攪拌，20 °C靜置沉淀12-24h ；
[0022]15、離心分離:醇沉過夜后進行離心分離，去除乙醇，收集沉淀；
[0023]19、冷凍干燥:將沉淀進行真空冷凍干燥，即制得鐵皮石斛多糖純品。
[0024]為了達到更好的技術效果，步驟(4)加入了耐熱型α -淀粉酶，并設定酶的活力濃度至 6000U/L，70°C反應 l_3h。
[0025]步驟(4)所述有機溶劑為95 %乙醇溶液。
[0026]為了更好地進行產品質量控制，制備方法步驟19后面還包括質控步驟，包括鐵皮石斛多糖純品的得率測定(以粗多糖質量計)，純多糖成分分析，以及純多糖均一性分析:
[0027](I)鐵皮石斛多糖純品的得率測定:將凍干后的純多糖稱重，以粗多糖質量計算純品得率，純品得率=(純多糖質量/粗多糖質量)X100% ；
[0028](2)鐵皮石斛多糖純品成分分析:采用苯酚硫酸法測定純品中中性糖含量，硫酸咔唑法測定純品中糖醛酸含量，考馬斯亮藍法測定純品中蛋白含量，國標法測定純品中淀粉、灰分和水分含量；
[0029](3)鐵皮石斛多糖純品分子量分布和均一性檢測:采用高效分子排阻色譜(HPSEC)系統對多糖純品進行分子量分布和均一性檢測。本方法的特色在于在鐵皮石斛多糖的特有性質，制定了一種新型、快速的多糖純化方式，解決了以往多糖純化過程中不可避免的“步驟多、高損失、低效率、雜質多”的問題，解決了純多糖難以產業化的難題。所獲得的多糖得率高、操作簡便、耗能低、無淀粉污染。
【具體實施方式】
[0030]實施例1:
[0031]用粉碎機將干燥的石斛樣品進行粉碎，過篩，取80目石斛粉100g。用15倍的95%乙醇回流2次脫脂，之后除去有機試劑并收集藥渣。藥渣用30倍的蒸餾水水提4次，每次2h，之后抽濾，合并濾液。將濾液真空(真空度-0.1MPa)濃縮至原有體積的1/6，加入無水乙醇，至乙醇濃度達到80%。低溫過夜醇沉24h，將乙醇沉淀液離心分離，冷凍干燥得粗品。取上述粗品，按質量比1:100復溶于蒸飽水中。向溶液中加入耐熱型α -淀粉酶(購自丹麥諾維信公司，型號BAN480L)至6000U/L，70°C水浴2h，期間不停攪拌。反應結束后放入-80°C冰箱中速凍，然后取出于室溫融化，再離心，取上清液，重復這一步驟4次。將所得溶液置于透析袋中進行透析，相對截留分子量為3500D，透析48h。之后，加入3倍溶液體積的無水乙醇，20°C靜置沉淀24h。離心，收集沉淀，冷凍干燥，即制得鐵皮石斛多糖純品。得率彡58.8%，純多糖中中性糖含量多88.4%，無淀粉。
[0032]實施例2:
[0033]用粉碎機將干燥的石斛樣品進行粉碎，過篩，取80目石斛粉100g。用15倍的95%乙醇回流2次脫脂，之后除去有機試劑并收集藥渣。藥渣用30倍的蒸餾水水提3次，每次2h，之后抽濾，合并濾液。將濾液真空(真空度-0.1MPa)濃縮至原有體積的1/6，加入無水乙醇，至乙醇濃度達到80%。低溫過夜醇沉12h，將乙醇沉淀液離心分離，冷凍干燥得粗品。取上述粗品，按質量比1:100復溶于蒸餾水中。向溶液中加入耐熱型α -淀粉酶購自丹麥諾維信公司，型號BAN480L)至6000U/L，70°C水浴3h，期間不停攪拌。反應結束后放入_80°C冰箱中速凍，然后取出于室溫融化，再離心，取上清液，重復這一步驟3次。將所得溶液置于透析袋中進行透析，相對截留分子量為3500D，透析48h。之后，加入3倍溶液體積的無水乙醇，20°C靜置沉淀24h。離心，收集沉淀，冷凍干燥，即制得鐵皮石斛多糖純品。得率多58%,純多糖中中性糖含量多85%，無淀粉。
[0034]實施例3:
[0035]用粉碎機將干燥的石斛樣品進行粉碎，過篩，取80目石斛粉100g。用10倍的95%乙醇回流3次脫脂，之后除去有機試劑并收集藥渣。藥渣用20倍的蒸餾水水提4次，每次2h，之后抽濾，合并濾液。將濾液真空(真空度-0.1MPa)濃縮至原有體積的1/6，加入無水乙醇，至乙醇濃度達到80%。低溫過夜醇沉12h，將乙醇沉淀液離心分離，冷凍干燥得粗品。取上述粗品，按質量比1:100復溶于蒸飽水中。向溶液中加入耐熱型α -淀粉酶(購自丹麥諾維信公司，型號BAN480L)至6000U/L，70°C水浴lh，期間不停攪拌。反應結束后放入-80°C冰箱中速凍，然后取出于室溫融化，再離心，取上清液，重復這一步驟3次。將所得溶液置于透析袋中進行透析，相對截留分子量為3500D，透析48h。之后，加入3倍溶液體積的無水乙醇，20°C靜置沉淀24h。離心，收集沉淀，冷凍干燥，即制得鐵皮石斛多糖純品。得率彡55%，純多糖中中性糖含量彡82%，淀粉含量< 0.01%。
【主權項】
1.一種鐵皮石斛多糖的純化方法，其特征在于步驟如下: (1)原料:以鐵皮石斛干品為原料； (2)粉碎:用粉碎機將鐵皮石斛干品進行粉碎； (3)過篩:粉碎后的原料進行分級過篩60-80目； (4)脫脂:將石斛粗粉用10-20倍有機溶劑回流2-4次進行脫脂，之后離心分離，去除有機溶劑，收集藥渣； (5)水提:向藥渣中加入20-40倍蒸餾水，在70°C溫度下進行水提，將上述水提液進行抽濾，獲得濾液，并重復水提3-4次，合并濾液； (6)真空濃縮:將所得濾液進行真空濃縮，濃縮至原有體積的1/6; (7)醇沉:向濃縮液中緩緩加入無水乙醇，邊攪拌，邊加入，當乙醇濃度達到80%時停止加入，20 °C靜置12-24h ； (8)離心分離:醇沉過夜后，將溶液進行離心，棄去上層有機試劑，收集沉淀； (9)多糖粗品:將沉淀置于通風處，使其中的乙醇揮發殆盡，冷凍干燥得到多糖粗品； (10)復溶:將粗多糖按質量比1:100復溶于水，邊溶解邊攪拌，直至完全溶解； (11)向溶液中加入耐熱型α-淀粉酶反應； (12)凍融離心:反應結束后，待溶液冷卻即放入_80°C冰箱中速凍，然后取出在25°C環境中融化，融化后離心，收集上清液，重復這一步驟3-4次；(13)透析:將所得溶液置于透析袋中進行透析，相對截留分子量為3500D，透析48h; (14)醇沉:透析結束后，向溶液中加入3倍溶液體積的無水乙醇，邊加入邊攪拌，20°C靜置沉淀12-24h ; (15)離心分離:醇沉過夜后進行離心分離，去除乙醇，收集沉淀； (19)冷凍干燥:將沉淀進行真空冷凍干燥，即制得鐵皮石斛多糖純品。2.如權利要求1所述的純化方法，其特征是:步驟(11)加入了耐熱型α-淀粉酶，并設定酶的活力濃度至6000U/L，70°C反應l_3h。3.如權利要求1所述的純化方法，其特征是:步驟(4)所述有機溶劑為95%乙醇溶液。
【專利摘要】本發明屬于藥物成分提取領域，涉及鐵皮石斛多糖的純化方法，其工藝步驟是：原料，粉碎，過篩，脫脂，水提，抽濾，真空濃縮，醇沉，離心分離，粗品，復溶，除淀粉，反復超低溫速凍、融化、離心，透析，醇沉，離心分離，冷凍干燥，得石斛多糖。本發明的技術效果是：除去了淀粉，極大地提高了石斛多糖純化效率和成本，且步驟簡便有效保存石斛多糖生物活性。
【IPC分類】C08B37/00
【公開號】CN104892783
【申請號】CN201510237026
【發明人】聶少平, 黃曉君, 張冠亞, 崔武衛, 田芳
【申請人】南昌大學
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月11日