專利名稱：鐵皮石斛多糖在制備減害香煙中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及應用有機物質對煙草制品的處理，具體涉及采用鐵皮石斛多糖煙草制品的處理。
背景技術：
煙草危害已成為當今世界最嚴重的公共問題之一，也是人類健康所面臨的最大問題。目前，全球共有11億吸煙者，每年導致近500萬例本可避免的死亡。《中國吸煙危害健康報告》也指出，我國是世界上最大的煙草生產國和消費國，吸煙對人民群眾健康的影響尤為嚴重。我國吸煙人群逾3億，另有約7.4億不吸煙人群遭受二手煙的危害，每年因吸煙相關疾病所致死亡人數超過100萬。有關醫學研究表明，吸煙是心腦血管疾病、癌癥、慢性阻塞性肺病等多種疾患的行為危害因素，吸煙已成為繼高血壓之后的第二號全球殺手。有資料表明，長期吸煙者的肺癌 發病率比不吸煙者高10倍至20倍，流行病學調查表明，吸煙是肺癌的重要致病因素之一，肺癌死亡人數中約85%由吸煙造成，吸煙致癌已經公認。肺癌的發生有很多因素介導，一些研究者以Mus spretus種系的小鼠為研究對象，通過遺傳技術定位與炎癥、血管發生、細胞復制和腫瘤易感的基因聯系起來，結果表明有炎癥體質的小鼠更易發生癌癥，炎癥對促進腫瘤的發生發展起著主要的作用。暴露在香煙中會開啟Iki3激酶(IKK β )信號通路，促進肺部炎癥的發生。近來研究表明，IKK β /NF-kB信號通路在非小細胞肺癌(NSCLC)細胞中處于持續激活狀態，并調節基因轉錄參與NSCLC的發生、發展。IKK β/NF-kB途徑在急性炎癥和細胞存活中是已被證實的，除炎癥外，IKK β /NF-kB途徑的特續活化也促進了癌癥，可以說IKKβ/NF-kB途徑為炎癥與腫瘤之間一個重要的分子紐帶。基因靶向實驗已證明IKK β是激活NF-kB必須的IKK亞基。既往對炎癥與腫瘤的聯系的認識主要在于各種炎癥細胞于炎癥介質，而IKK β/NF-kB途徑從炎癥促進腫瘤發生與發展兩方面提供一分子線索，將兩者間錯綜復雜的關系集中到ΙΚΚβ這一信號轉導新靶點上。特異地抑制IKK β，為其預防治療炎癥相關性腫瘤提供新的策略和途徑。雖然香煙外包裝明示吸煙有害健康，政府也高額扣稅，但并不能限制吸煙人數的增加。究其原因，吸煙已成為一種社會化文化交流。煙和酒、茶一樣，均能協調人際關系。當今社會，尤其是男士，煙已成為其疏通人際關系的關鍵媒介。“茶交居士”、“酒結俠客”，茶、酒作為中國傳統交際之物，但香煙的交際也無處不在，“相逢見面開口笑，遞上一支煙”，增加了社交氛圍、談話樂趣，更放松了精神。吸煙不僅僅是吸食之事，更是一種社交化載體。吸煙有害健康已是一個不爭的事實。隨著國民生活水平的提高，人們保健意識的增強，如何降低煙草的危害，使煙民在享受吸煙樂趣的同時又能最大限度的減少對身體的危害，我國煙草行業已經把“國家利益和消費者利益至上”提到重要議事日程。為了減少吸煙身體健康產生的危害，開發一些功能性減害成分作為煙草添加劑成為研究熱點。公開號為CN10275650A的專利申請公開了鐵皮石斛多糖在卷煙中的應用，該應用的方法是將鐵皮石斛石斛多糖經水溶解，配制成0.08mg/ml-0.8mg/ml的溶液噴到卷煙煙絲上，制備卷煙。上述專利申請還公開了將鐵皮石斛多糖應用到卷煙中，可使燃吸卷煙時煙氣形態圓潤，細膩柔和度增加，干燥感下降，香氣量增加。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供鐵皮石斛多糖的新用途，即鐵皮石斛多糖在香煙中的減害用途。本發明人長期研究發現，含鐵皮石斛多糖的香煙經研究能顯著下調因吸煙引起的細胞炎癥因子IKKβ表達，降低肺部炎癥率。因此，上述鐵皮石斛多糖的新用途具體是，鐵皮石斛多糖在制備減害香煙中的應用，其特征在于，所述的減害為降低吸煙導致肺部炎癥的風險。本發明所述應用的具體方法是，用水將鐵皮石斛多糖溶解，并均勻噴灑在煙絲上，自然晾干，然后按照常規的卷煙技術將煙絲卷制成香煙；其中，所述鐵皮石斛多糖的用量為香煙中煙絲質量的0.1% 10%。本發明所述應用中的鐵皮石斛多糖的采用水提醇沉法、超聲波法或酶解法提取得到。上述的水提醇沉法由以下步驟組成:將鐵皮石斛干燥莖粉碎，過50目，得鐵皮石斛粉末；向鐵皮石斛粉末中加入為粉末質量50倍的水，煎煮提取兩次，每次2小時；合并兩次提取液，濃縮至原體積的十分之一，向濃縮液中加入4倍體積 的體積濃度為95%的乙醇，靜置過夜，離心，取下層沉淀物，冷凍干燥后用適量的水充分溶解，加入Sevage試劑除蛋白6次，每次加入溶解液一半體積量的Sevage試劑，搖勻，靜置30min分層，收集下層水相溶液，濃縮，得到鐵皮石斛總多糖。上述的超聲波法由以下步驟組成:將鐵皮石斛干燥莖粉碎，過50目，得鐵皮石斛粉末；按1: 30的固液比往鐵皮石斛粉末中加水，于50°C下超聲提取時間1.5h ；5000r/min離心去渣，得上清液，濃縮至原體積的十分之一，加4倍體積的體積濃度為95%乙醇，靜置過夜，離心，取下層沉淀物用適量的蒸懼水溶解，加入Sevage試劑除蛋白6次,每次加入蒸懼水溶解液一半體積量的Sevage試齊U，搖勻，靜置30min分層，收集下層水相溶液，濃縮，得到鐵皮石斛總多糖。上述水提醇沉法和超聲波法所涉及的Sevage試劑是由正丁醇和氯仿按正丁醇:氯仿=3:1的體積比混合制成。上述的酶解法由以下步驟組成:將鐵皮石斛干燥莖粉碎，過50目，得鐵皮石斛粉末；將鐵皮石斛粉末混懸于10倍的石油醚中，加熱回流脫脂，過濾，收集濾渣；向濾渣中加入溫水，再緩緩加入鐵皮石斛質量0.6%的已活化的纖維素酶液，輕輕攪拌，50°C恒溫酶解1.5h后立即升溫至90°C滅酶，迅速冷卻過濾，收集濾渣；往滅酶的濾渣中加入50倍水，在50°C溫度下浸提2h，過濾，再往所得濾洛中加入25倍水于50°C溫度下浸提2h，過濾；合并加50倍水浸提和加25倍水浸提的二次濾液，濃縮，加入無水乙醇，使體系中乙醇的體積濃度達到80%，在冰箱中靜置過夜，過濾，濾渣經真空干燥得石斛多糖。本發明所述減害香煙能降低吸煙誘導的肺部炎癥的發生率，下調因吸煙引起的肺組織核因子Kappa B (NF_kB)抑制劑的激酶β (IKKβ )的表達，因此對于降低因吸煙誘導肺癌的發生率具有積極意義。


圖1為吸含水提醇沉法提取的鐵皮石斛多糖的香煙組小鼠體重變化柱形圖。圖2為吸含超聲波法提取的鐵皮石斛多糖的香煙組小鼠體重變化柱形圖。圖3為吸含酶解法提取的鐵皮石斛多糖的香煙組小鼠體重變化柱形圖。圖4 9為小鼠肺組織切片的顯微照片，其中，圖4為空白組，圖5為吸普通香煙組，圖6為吸含0.1%鐵皮石斛多糖的香煙組，圖7為吸含1%鐵皮石斛多糖的香煙組，圖8為吸含5%鐵皮石斛多糖的香煙組，圖9為吸含10%鐵皮石斛多糖的香煙組。圖10為小鼠肺組織中IKK^mRNA的表達的電泳圖，圖中，標記a為正常組小鼠，標記b為吸普通香煙組小鼠，標記c為吸添加鐵皮石斛多糖香煙組小鼠。
具體實施例方式例I (鐵皮石斛總多糖的提取)方法一:將鐵皮石斛干燥莖粉碎，過50目，得鐵皮石斛粉末；向鐵皮石斛粉末中加入為粉末質量50倍的水，煎煮提取兩次，每次2小時；合并兩次提取液，濃縮至原體積的十分之一，向濃縮液中加入4倍體積的體積濃度為95%的乙醇，靜置過夜，離心，取下層沉淀物，冷凍干燥后用適量的水充分溶解，加入Sevage試劑除蛋白6次，每次加入溶解液一半體積量的Sevage試劑，搖勻，靜置30min分層，收集下層水相溶液，濃縮，得到鐵皮石斛總多糖。方法二:
將鐵皮石斛干燥莖粉碎，過50目，得鐵皮石斛粉末；按1: 30的固液比往鐵皮石斛粉末中加水，于50°C下超聲提取時間1.5h ；5000r/min離心去渣，得上清液，濃縮至十分之一，加4倍體積的體積濃度為95%乙醇，靜置過夜，離心，取下層沉淀物用適量的蒸餾水溶解,加入Sevage試劑除蛋白6次,每次加入蒸懼水溶解液一半體積量的Sevage試劑,搖勻，靜置30min分層，收集下層水相溶液，濃縮，得到鐵皮石斛總多糖。方法三:將鐵皮石斛干燥莖粉碎，過50目，得鐵皮石斛粉末；將鐵皮石斛粉末混懸于10倍的石油醚中，加熱回流脫脂，過濾，收集濾渣；向濾渣中加入溫水，再緩緩加入鐵皮石斛質量0.6%的已活化的纖維素酶液，輕輕攪拌，50°C恒溫酶解1.5h后立即升溫至90°C滅酶，迅速冷卻過濾，收集濾渣；往滅酶的濾渣中加入50倍水，在50°C溫度下浸提2h，過濾，再往所得濾洛中加入25倍水于50°C溫度下浸提2h，過濾；合并加50倍水浸提和加25倍水浸提的二次濾液，濃縮，加入無水乙醇，使體系中乙醇的體積濃度達到80%，在冰箱中靜置過夜，過濾，濾渣經真空干燥得石斛多糖。例2一、實驗樣品制作樣品I的制作取上述實施例1中方法一所得到的鐵皮石斛多糖加水溶解，得鐵皮石斛多糖水溶液；然后，分別按鐵皮石斛多糖的用量為香煙中煙絲質量的0.1%、1%、5%和10%將所制的鐵皮石斛多糖水溶液均勻噴灑在市購的云南玉溪牌香煙煙絲上，自然晾干；最后，按照常規的卷煙技術將煙絲卷制成香煙，得到鐵皮石斛多糖的含量分別為0.1%、1%、5%和10%的香煙。
樣品2的制作取上述實施例1中方法二所得到的鐵皮石斛多糖加水溶解，得鐵皮石斛多糖水溶液；然后，分別按鐵皮石斛多糖的用量為香煙中煙絲質量的0.1%、1%、5%和10%將所制的鐵皮石斛多糖水溶液均勻噴灑在市購的云南玉溪牌香煙煙絲上，自然晾干；最后，按照常規的卷煙技術將煙絲卷制成香煙，得到鐵皮石斛多糖的含量分別為0.1%、1%、5%和10%的香煙。樣品3的制作取上述實施例1中方法三所得到的鐵皮石斛多糖加水溶解，得鐵皮石斛多糖水溶液；然后，分別按鐵皮石斛多糖的用量為香煙中煙絲質量的0.1%、1%、5%和10%將所制的鐵皮石斛多糖水溶液均勻噴灑在市購的云南玉溪牌香煙煙絲上，自然晾干；最后，按照常規的卷煙技術將煙絲卷制成香煙，得到鐵皮石斛多糖的含量分別為0.1%、1%、5%和10%的香煙。二、藥理、藥效實驗實驗一含鐵皮石斛多糖香煙降低吸煙誘導小鼠肺部炎癥發生率的作用

1、實驗材料1.1實驗動物420只體重為18 22g健康雄性昆明小鼠，由廣州中醫藥大學動物中心提供，合格證號:SCXK (粵)2008-0020。1.2實驗試劑和儀器試劑:液氮，甲醛，重鉻酸鉀、濃硫酸、多聚-L-賴氨酸、蘇木精染液、伊紅染液。儀器:顯微鏡數字圖像分析處理系統(OLYMPUS);動物熏煙系統為自行研制，包括吸煙機、煙氣輸送機稀釋裝置、動物熏煙裝置。2、方法2.1受試動物及其分組將420只體重為18 22g健康雄性昆明小鼠，隨機分為14組，每組30只。2.2受試動物的組別及其所吸受試樣品A組為空白對照組(不煙熏組)。B組為吸普通香煙煙熏實驗組(香煙為市購的云南玉溪牌香煙)。Cl、C2和C3組分別吸含0.1%鐵皮石斛多糖的香煙樣品1、樣品2和樣品3。Dl、D2和D3組分別吸含1%鐵皮石斛多糖的香煙樣品1、樣品2和樣品3。El、E2和E3組分別吸含5%鐵皮石斛多糖的香煙樣品1、樣品2和樣品3。F1、F2和F3組分別吸含10%鐵皮石斛多糖的香煙樣品1、樣品2和樣品3。2.3實驗方法本方法采用僅鼻吸煙的暴露模式，S卩，把小鼠分置于各限制管中，僅鼻子呼吸煙氣，避免煙氣部分沉積在皮毛上被動物吸收。通過設定煙支數量、空氣流量來控制小鼠鼻部的煙氣濃度和流量。小鼠以僅鼻暴露方式，在煙氣粒相物濃度為400mg/m3，氣流速度IOOml/min條件下吸煙。每天早上清理鼠籠(每隔2天用酒精擦洗一次)，清除糞便、墊干木屑，檢查小鼠健康狀況，同時稱量前一天每組小鼠的攝食量及飲水量，并記錄，換上新的鼠糧和飲用水，每天的飼喂定時定量的，由小白鼠在實驗過程中自由攝取。每5天觀察并記錄小鼠的體重。上午10:00 11:00和下午15:00 16:00為吸煙時間，每次三支煙。持續5周后，采用快速脫頸椎法處死小白鼠，解剖，取肺組織放入10%中性甲醛中固定，用于制作組織切片，行H-E染色，最后利用顯微數字圖像分析處理系統觀察各器官的組織結構變化，進行常規組織病理學檢查，統計各組小鼠肺部炎癥發生率。3、結果3.1體重變化將各 組小鼠35天體重變化量繪制出柱形圖如圖1、2和3所示。分組的時候因為是隨機分組，所以各組小鼠平均體重沒有出現顯著性差異。由圖1、2、3可以看出:1、隨著時間的延長，吸煙組小鼠體重增長趨勢均慢于正常不吸煙組，試驗結束后體重均輕于正常不吸煙組，說明吸煙對小鼠體重增長是有影響的；2、吸含鐵皮石斛多糖香煙的小鼠體重的增長均快于吸普通香煙組的小鼠，35天后增長的體重更接近于正常組，說明吸含鐵皮石斛多糖的香煙對小鼠體重增長影響較普通香煙小；3、吸香煙樣品1、2和3的小鼠之間體重增長相近似，沒有顯著性差異。3.2小鼠肺部炎癥率各組小鼠肺組織病理切片統計炎癥發生率的結果見表I。數據統計方法為X2檢驗。表I不同組別小鼠肺部炎癥發生率
權利要求
1.鐵皮石斛多糖在制備減害香煙中的應用，其特征在于，所述的減害為降低吸煙導致肺部炎癥的風險。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的減害香煙的制備方法由以下步驟組成:用水將鐵皮石斛多糖溶解，并均勻噴灑在煙絲上，自然晾干，然后按照常規的卷煙技術將煙絲卷制成香煙；其中，所述鐵皮石斛多糖的用量為香煙中煙絲質量的0.1% 10%。
全文摘要
本發明涉及鐵皮石斛多糖在制備減害香煙中的應用，其特征在于，所述的減害為降低吸煙導致肺部炎癥的風險。本應用中所述減害香煙是用水將鐵皮石斛多糖溶解，并均勻噴灑在煙絲上，自然晾干，然后按照常規的卷煙技術卷制成的。本發明所述減害香煙能降低吸煙誘導的肺部炎癥的發生率，下調因吸煙引起的肺組織核因子Kappa B(NF-kB)抑制劑的激酶β(IKKβ)的表達。
文檔編號A24B15/30GK103211298SQ20131014325
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月23日 優先權日2013年4月23日
發明者魏小勇, 陳丹 申請人:廣州中醫藥大學