專利名稱：巴西蘇木素類化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及巴西蘇木素類化合物的用途，尤其涉及巴西蘇木素類化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術：
蘇木(Lignum Sappan)是一味傳統中藥材，為豆科(Leguminosae)云實屬植物蘇木(Caesalpinia sappan L.)的干燥心材。蘇木生于高溫多濕、陽光充足的平壩或坡地，分布于廣西、廣東、云南、貴州、四川、臺灣。中醫認為蘇木味甘、咸、微辛，性平，有行血祛瘀，消腫止痛的功能，用于閉經痛經，產后瘀阻，胸腹刺痛，外傷腫痛。
現代藥理學研究表明，蘇木具有中樞抑制、抗炎、抗高血脂和調節血糖的作用，并有潛在的抗腫瘤作用。國內許多學者的實驗研究表明，蘇木水提物對HL-60(人早幼粒細胞白血病細胞株)有較強的細胞毒作用，其醇提物對人體腫瘤細胞HCT-8、KB、A2780有明顯的抑制作用，直接作用于腫瘤細胞，誘導細胞凋亡，抑制癌細胞的增殖，并呈現出一定的濃度依賴關系(蘇木的臨床藥理及化學成分研究進展.王棟，陳超，周玨.中醫藥信息，2003，2015-16)。
適量的蘇木水溶液能增強血管的收縮力，具有催眠作用，大量尚有麻醉作用，甚至死亡，能對抗士的寧與可卡因的中樞興奮作用，但不能對抗嗎啡的興奮作用。10％的蘇木煎液還有抗菌作用。
蘇木的主要化學成分之一是巴西蘇木素類化合物(如式I所示) 巴西蘇木素類化合物包括巴西蘇木素(brazilin)、3’-O-甲基巴西蘇木素(3’-O-methylbrazilin)、4’-O-甲基巴西蘇木素(4’-O-methylbrazilin)、4-羥基巴西蘇木素(4-hydroxylbrazilin)、8-羥基巴西蘇木素(8-hydroxylbrazilin)等。巴西蘇木素遇空氣即氧化為巴西蘇木紅素(Brazilein)，巴西蘇木紅素是一種常用色素。1993年，Davis等人用具有光學構象選擇性的方法首次合成了巴西蘇木素類化合物中的三甲基巴西蘇木素。2005年，巴西蘇木素的全合成路線也被報道出來(Synthesis of(+/-)-brazilin using IBX.Y Huang，J Zhang，TR Pettus.Org Lett.，2005，75841-5844.)。蘇木另含蘇木酚(Sappanin，即2，4，3’，4’-四羥基聯苯)，可做有機試劑，檢查鋁離子；又含揮發油，油的主要成分為水芹烯(d-α-Phellandrene)及羅勒烯(Ocimene)；還含鞣質。
國外的研究主要針對巴西蘇木素的藥理作用，主要集中在免疫調節、糖質代謝、抗凝血和殺菌等方面，特別是其殺菌和降血糖的作用。有研究發現巴西蘇木素對多種耐藥細菌有殺滅作用，最小抑菌濃度為4～32mg/mL(Theantibacterial principle of Caesalpina sappan.Hx Xu，SF Lee.Phytother Res.，2004，18647-651.)。還有研究表明，巴西蘇木素能夠降低糖尿病小鼠的肝實質細胞的糖質新生能力，并能夠通過降低絲氨酸的磷酸化作用增加胰島素受體的功能，從而發揮降低血糖的作用(Mechanism of action of Brazilin ongluconeogenesis in isolated rat hepatocytes.HS Won，J Lee，LY Khil，SH Chae，et al.Planta Med.，2004，70740-744.Brazilin inhibits activities of protein kinaseC and insulin receptor serine kinase in rat liver.SG Kim，YM Kim，LY Khil，et al.Arch Pharm Res.，1998，21140-146.)。
2001年，RL Tolman等人發現巴西蘇木素具有抑制DNA聚合酶活性的作用，并為此申請了國際發明專利WO 0,193,864。2003年，韓國學者在實驗室中發現蘇木乙酸乙酯提取物能夠在DNA鏈上產生剪切作用，從而在雙鏈上生成缺口。經過對粗提物的進一步細分，確定了巴西蘇木素是產生這一作用的主要活性成分(A DNA strand-nicking principle of a higher plant，Caesalpinia sappan.W Mar，HT Lee，KH Je，et al.Arch Pharm Res.，2003，26147-150.)。
綜上所述，作為一類單一成分的化合物，巴西蘇木素及其衍生物在細胞增殖方面的應用記載較少，尤其是到目前為止，國內外均沒有關于巴西蘇木素化合物在抗腫瘤方面的直接的藥理學研究結果的報道。

發明內容
本發明的目的是提供式I所示的巴西蘇木素類化合物，和/或巴西蘇木素類化合物藥學上可接受的鹽，和/或以巴西蘇木素類化合物為有效成分的植物提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途； 其中，
R1、R2、R3和R4各自獨立地為氫原子，C1-4直鏈或支鏈的烷基，或，C1-4直鏈或支鏈的酰基，優選氫原子；R5為氫原子或羥基，優選氫原子。
所述的腫瘤可以是各種腫瘤，例如人白血病、腎癌、肝癌、肺癌、直腸癌、胃癌、食道癌或乳腺癌等等。
在一較佳實施例中，所述的C1-4直鏈或支鏈的烷基是指甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基或仲丁基，優選甲基、乙基；所述的C1-4直鏈或支鏈的酰基是指甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基或異丁酰基，優選甲酰基。
在另一較佳實施例中，所述的巴西蘇木素類化合物是上述式I中的R1、R2、R3、R4和R5都為氫原子，即式II的巴西蘇木素 上述式I的巴西蘇木素類化合物可通過化學合成方式得到，也可以通過從豆科植物蘇木(Caesalpinia sappan L.)的干燥心材中提取得到；所述的以巴西蘇木素類化合物為有效成分的植物提取物也可以從豆科植物蘇木的干燥心材中提取得到。
一種優選的巴西蘇木素類化合物的提取方法包括如下步驟將干燥的蘇木藥材粉碎后用6倍量的95％乙醇熱回流提取3次，每次1小時，合并提取液，減壓濃縮，得到的浸膏進行乙酸乙酯和水的分配，取乙酸乙酯相蒸干，進行硅膠柱層析，用氯仿-甲醇系統進行梯度洗脫，共收集116個流份，根據TLC檢測結果，合并流份，其中Fr.91～93經過反復硅膠柱層析進行純化處理后，得到的橙色粉末即為巴西蘇木素化合物。
在上述提取物中，式II化合物的重量純度較佳地為40％～99.9％，更佳地為50～98％。
在又一較佳實施例中，本發明的化合物可以與藥學上可接受的酸或堿衍生的鹽形式使用。所述的巴西蘇木素類化合物藥學上可接受的鹽較佳地是指巴西蘇木素類化合物與下列物質所衍生形成的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羥乙磺酸、堿金屬(如鈉、鉀等)、堿土金屬(如鎂、鈣等)、酯、氨基甲酸酯或其他常規的“前體藥物”的形式(當以這種形式給藥時，在體內可轉化成活性部分)。
在又一較佳實施例中，本發明所述的用途還包括將巴西蘇木素類化合物和/或其鹽和/或以該化合物為有效成分的植物提取物應用于制備治療惡性腫瘤的藥物組合物，它含有(a)有效量的作為活性成分的式I巴西蘇木素類化合物和/或其鹽和/或含有該化合物的植物提取物，和(b)藥學上可接受的載體。
通常，在治療腫瘤時，以巴西蘇木素類化合物和/或其鹽和/或以該化合物為有效成分的植物提取物為活性成分，以常規的制劑工藝，單獨使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物，如散劑、丸劑、膠囊劑、片劑、微囊劑、軟膠囊劑、膜劑、栓劑、注射劑、膏劑、酊劑、沖劑氣霧劑或其它各種外用制劑等。
在一較佳實施例中，本發明的化合物可通過口服、靜脈內、肌內或皮下途徑給藥。
本發明的積極進步效果在于1.本發明發現了存在于豆科植物蘇木中的一類巴西蘇木素類化合物能被用于治療多種惡性腫瘤。細胞試驗顯示該化合物對細胞有絲分裂有顯著的阻遏作用，并能殺死多種腫瘤細胞；動物試驗也顯示其能顯著抑制腫瘤細胞生長，且對人體無毒副作用。
2.本發明化合物可將其單獨或與其它藥物共同作為活性成分制成治療惡性腫瘤的藥品。


圖1A為陰性對照組人胃癌HGC細胞周期示意圖；圖1B為巴西蘇木素組人胃癌HGC細胞周期示意圖；圖2為巴西蘇木素對雌性S180荷瘤小鼠體重的影響。
具體實施例方式
以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
從豆科植物蘇木(Caesalpinia sappan L.)的干燥心材中提取巴西蘇木素化合物將干燥的蘇木藥材粉碎后用6倍量的95％乙醇熱回流提取3次，每次1小時，合并提取液，減壓濃縮，得到的浸膏進行乙酸乙酯和水的分配，得到的乙酸乙酯相蒸干，進行硅膠柱層析，用氯仿-甲醇系統進行梯度洗脫，共收集116個流份，根據TLC檢測結果，合并流份，其中Fr.91～93經過反復硅膠柱層析進行純化處理后，得到橙色粉末化合物，經TLC和HPLC檢測(純度90％以上)，為一個單體化合物，其分子式、UV、1H-NMR和13C-NMR數據如下分子式C16H14O5UVλmax(MeOH，nm)200，286
1H-NMR(400MHZ，δppm，CD3OD)7.18(1H，d，J＝8.4HZ)，6.47(1H，dd，J＝8.4，2.4HZ)，6.29(1H，d，J＝2.8HZ)，6.70(1H，s)，6.60(1H，s)，3.68(1H，d，J＝11.6HZ)，3.92(1H，dd，J＝11.2，1.2HZ)，3.96(1H，s)，2.76(1H，d，J＝15.6HZ)，3.02(1H，d，J＝15.6HZ)13C-NMR(100MHZ，δppm，CD3OD)156.7(4a)，154.5(3)，144.5(9)，144.1(10)，136.2(11a)，131.1(1)，130.1(7a)，114.3(1a)，111.7(8)，111.2(11)，108.8(2)，103.1(4)，76.9(6a)，69.6(6)，49.8(12)，39.2(7)由上述數據可推得所得化合物為巴西蘇木素，即式II化合物。該提取得到的巴西蘇木素用于以下各實施例中。
實施例1體外試驗中巴西蘇木素對多種腫瘤細胞生長的抑制作用體外培養小鼠肉瘤S180細胞、人胚腎癌293細胞、人肝癌HepG2細胞、人肺癌A549和CRL-5895細胞、人胃癌HGC-27細胞。細胞生長至對數生長期后，用胰酶消化細胞，1000rpm離心5分鐘，棄上清，適量培養基懸浮，調整細胞濃度至8×104/mL。將細胞懸液接種到96孔細胞培養板中，每孔100μL，放置細胞培養箱(37℃，5％CO2)中培養24h后，用藥組每孔加入細胞培養基稀釋的巴西蘇木素(式II)100μL，終濃度為0.5ug/mL，空白對照組加入等量的細胞培養基，各組均設6個復孔。培養箱中培養66h后，每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，37℃放置4h。每孔加入三聯液(5％ SDS，10mM HCl，5％異丙醇)，37℃過夜。492nm/620nm測吸光度(OD)。對OD值進行t檢驗，并計算藥物對各腫瘤細胞生長的抑制率抑制率＝(對照組OD值-給藥組OD值)/對照組OD值×100％。
表1巴西蘇木素對多種腫瘤細胞生長的抑制作用


*表示p＜0.01，與對照組相比，差異有顯著性。
實驗結果如表1所示，在各種腫瘤細胞培養液中加入巴西蘇木素，終濃度為0.5μg/mL，共孵育66h后，用藥組的OD值均低于空白對照組，差異有顯著性(p＜0.01)，對小鼠S180細胞、人癌細胞293、HepG2、A549、CRL-5895、HGC-27的細胞生長抑制率分別為93.45％、98.52％、81.37％、81.15％、43.78％、75.01％。說明巴西蘇木素在0.5ug/ml劑量在體外對小鼠肉瘤、人胚腎癌、肝癌、肺癌、胃癌均有很強的抑制腫瘤細胞生長的作用，抗瘤譜廣。
實施例2巴西蘇木素對人胃癌HGC細胞周期的影響體外培養HGC細胞，生長狀態良好時，消化并接種1×105個細胞于6cm培養皿中，過夜貼壁。等細胞狀態良好后，吸去培養基，加入以培養基稀釋的巴西蘇木素(式II)，終濃度為2μg/mL，陰性對照孔加入培養基，37℃培養24h。鏡下觀察細胞形態變化。用胰酶消化細胞(0.25％胰酶/0.02％EDTA)，輕輕吹下，移入離心管，2000rpm離心5min，PBS洗滌2次，1000rpm離心5min。向細胞沉淀中緩緩加入75％乙醇(-20℃預冷)800μL，邊滴邊振蕩(Vortex)，盡量使之形成單細胞。4℃固定過夜后，1000rpm離心5min，PBS洗滌兩次，離心。重懸于300μL PBS，加預先煮沸過的RNase(終濃度為50μg/mL)，37℃孵育30min。300目尼龍網過濾，加入碘化丙啶(PI)(終濃度為25μg/mL)，4℃避光1h，流式細胞儀檢測細胞周期。
實驗結果巴西蘇木素作用于HGC細胞24h后，細胞全部變圓，部分漂浮，收集細胞進行流式細胞儀檢測。結果顯示，(如圖1A和圖1B)巴西蘇木素作用后，G1、S期細胞明顯減少，G2期細胞明顯增加，說明巴西蘇木素在2μg/mL劑量下，使人胃癌HGC細胞停滯于G2-M期，使其受阻斷，阻止腫瘤細胞進行正常的有絲分裂。
實施例3巴西蘇木素對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用實驗動物雌性、雄性SPF級KM小鼠，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供(許可證號SCXK(滬)2003-0003；質量合格證編號0011979)，體重為18～22g，SPF級動物房飼養，12h光照/12h黑暗，自由攝取飼料和水。
實驗方法取接種7天的S180腹水小鼠，無菌條件下抽取腹水，用生理鹽水調整細胞濃度至5×106/mL。將S180細胞懸液以0.2mL/只的量接種在小鼠右前肢腋部皮下。接種24h后，將雌雄小鼠分別隨機分為2組(每組10只)巴西蘇木素組，用蒸餾水溶解巴西蘇木素(式II)，給藥劑量是1mg/kg；對照組給予蒸餾水，給藥體積是0.1mL/10g，每天灌胃給藥1次，連續10天。停藥次日處死小鼠，剝取瘤塊稱重，計算每組平均值，進行t檢驗。計算抑瘤率，抑瘤率＝(對照組瘤重-給藥組瘤重)/對照組瘤重×100％。
表2巴西蘇木素對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

*表示p＜0.01，與對照組相比，差異有顯著性。
實驗結果表2的數據顯示，巴西蘇木素連續給藥10天后，給藥組雌、雄小鼠腫瘤的重量低于對照組，差異有顯著性(p＜0.01)，藥物的抑瘤率分別達到50.82％和39.38％，說明巴西蘇木素在1mg/kg劑量時能夠明顯抑制S180荷瘤小鼠腫瘤的生長。同時，巴西蘇木素組的體重沒有明顯下降(如圖2)，與對照組相比，差異沒有顯著性，說明藥物基本無毒。
實施例4片劑的制備利用常規技術，混合以下組分，然后壓片，包薄膜衣，制成薄膜包衣片劑形式的藥物組合物。其配方如下

實施例5注射劑的制備稱取5.0g純度為98％的巴西蘇木素(如式II所示)，加入適量生理鹽水，使其完全溶解；配制500g pH5.5的磷酸鹽緩沖液，稱取0.3g亞硫酸氫鈉加入到上述磷酸鹽緩沖液中；將緩沖液加入到巴西蘇木素溶液中，再加入1.0g苯甲醇，加注射用水至總體積1000mL，混合均勻，加入0.01％針用活性碳100℃保溫30分鐘，G3垂熔玻璃漏斗過濾、0.22μm微孔濾膜過濾，過濾后的藥液分裝成2mL/支的針劑500支，分裝好的注射劑壓塞、壓鋁蓋成針劑。
權利要求
1.式I所示的巴西蘇木素類化合物，和/或巴西蘇木素類化合物藥學上可接受的鹽，和/或以巴西蘇木素類化合物為有效成分的植物提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途； 其中，R1、R2、R3和R4各自獨立地為氫原子，C1-4直鏈或支鏈的烷基，或，C1-4直鏈或支鏈的酰基；R5為氫原子或羥基。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于所述的腫瘤是指人白血病、腎癌、肝癌、肺癌、直腸癌、胃癌、食道癌或乳腺癌。
3.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的C1-4直鏈或支鏈的烷基是指甲基、乙基；所述的C1-4直鏈或支鏈的酰基是指甲酰基。
4.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的巴西蘇木素類化合物是式II的巴西蘇木素
5.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的巴西蘇木素類化合物藥學上可接受的鹽是指巴西蘇木素類化合物與下列物質所衍生形成的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羥乙磺酸、堿金屬、堿土金屬、酯或氨基甲酸酯。
6.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的藥物是以下劑型散劑、丸劑、膠囊劑、片劑、微囊劑、軟膠囊劑、膜劑、栓劑、注射劑、膏劑、酊劑、沖劑或氣霧劑。
7.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的含有巴西蘇木素類化合物的植物提取物是從豆科植物蘇木的干燥心材中提取的。
全文摘要
式I所示的巴西蘇木素類化合物，和/或巴西蘇木素類化合物藥學上可接受的鹽，和/或以巴西蘇木素類化合物為有效成分的植物提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途；其中，R
文檔編號A61K36/185GK101045046SQ20061002540
公開日2007年10月3日 申請日期2006年3月31日 優先權日2006年3月31日
發明者俞強 申請人:上海安普生物科技有限公司