專利名稱：與淀粉樣物質結合的金屬螯合劑的制作方法
政府利益本文所述工作得到National Institutes of Health/National Institute ofMental Health(國家衛生研究院/國家精神衛生研究院)的資助(資助號5K01 MH002001-02)。美國政府可在本發明中具有某些權利。
相關申請本申請要求2003年1月22日提交的臨時專利申請60/441,719的優先權，該申請被全文并入本文作為參考。
背景技術：
淀粉樣病變(amyloidosis)為一類疾病和病癥，其特征在于被稱為淀粉樣物質的類蛋白物質(protein-like substance)在身體的一個和多個器官和組織中積聚。可系統發生或局部發生的淀粉樣物質積聚可損害正常的生命機能并引起器官衰竭。已經識別了至少15種淀粉樣病變(每一種都與不同類型的淀粉樣沉積物有關)。積聚后的蛋白質的性質以及聚集的位置決定癥狀，其可為從輕度到危急生命的程度。淀粉樣沉積物為臨床狀況病理學的重要部分，如阿爾茨海默氏病、成人發病型糖尿病、慢性炎性疾病、透析相關性關節病、腫瘤、和家族性神經病。
在淀粉樣病變中，通常可溶性功能蛋白質的異常折疊和聚合為不溶性的富含β折疊的(β-sheet-rich)四級結構引起聚集的蛋白質從細胞分泌出來并形成細胞外淀粉樣沉積物(即小纖維、纖絲、蛋白斑、和纏結)。在可以經歷這種轉變的20種蛋白質中，一些優先地在腦中積聚，并且其與神經退行性疾病狀況有關。這些蛋白質包括例如朊病毒蛋白，其與朊病毒疾病有關；和β淀粉樣肽(Aβ)，其沉積在患有阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、路易體癡呆、淀粉樣病變(荷蘭型)遺傳性腦出血、關島帕金森癡呆、和腦外傷患者的腦中有發現。
雖然淀粉樣病變通常是罕見的病理生理學狀況，但阿爾茨海默氏病(AD)在美國是最常見的癡呆形式。流行病學研究估計有40％到50％的人在他們接近90歲時患有AD(D.A.Evans等人，JAMA，1989，2622551-2556；R.Katzman，Neurology，1993，4313-20)。該疾病的第一個癥狀通常為記憶缺失，隨后是語言、認知、和活動性損傷，并最終導致精神功能喪失，衰弱到使患者變得完全依賴他人照顧他們的日常生活。這種不可逆的退化最終導致死亡。除了其對個人和家庭的巨大影響之外，AD還造成了重大的公共衛生難題。根據the NationalInstitute on Aging(國家衰老研究院)，估計目前有4百萬美國人患有該疾病，并且每年新診斷出約360,000例新病例(R.Brookmeyer等人，Am.J.Public.Health.，1998，881337-1342)。估計每年國家照顧AD患者的直接或間接費用有1000億美元(R.L.Ernst等人，Arch.Neurol.，1997，54687-693)，AD還對社會造成沉重的經濟負荷。
在阿爾茨海默氏病患者中，β淀粉樣肽的聚集導致在腦血管系統中形成淀粉樣沉積物和在新皮層中形成老年斑(C.L.Masters等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，824245-4249)。因為沒有侵入性活組織檢查很難進行診斷，只能通過腦組織的死后驗尸檢查實現明確的診斷(G.McKhann等人，Neurology，1984，34939-944；D.M.Mann，Mech.AgeingDev.，1985，31213-255)，研究AD仍然是一項使人畏縮的工作，迄今為止，處置和治療的進展還難以捉摸。FDA批準的多個作為“認知增強劑”的治療劑(如Aricept_、Cognex_、Exelon_、和Mentane_)在一些AD患者中提供了輕微的緩解。然而，這些治療劑不改變疾病的潛在進程，目前還沒有對阿爾茨海默氏病在其發展的任何階段提供治愈或有效的治療。
一直以來，淀粉樣物質積聚被認為在神經元細胞高死亡的區域濃度最高。這種關系得到了其中β淀粉樣肽當以特定的β折疊構造聚集時產生高神經元毒性的事實的支持(J.Y.Koh等人，Brain Res.，1990，533315-320；B.A.Yankner等人，Science，1990，250279-282)。雖然越來越多的證據暗示淀粉樣沉積物與AD患者中觀察到的神經元功能障礙密切相關(J.W.Kelly，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95930-932)，但仍不清楚毒性機理和引起Aβ沉積的神經化學事件的機理。
最近提出假說，認為過渡金屬在阿爾茨海默氏病的發病機理中起到了決定性的作用(C.S.Atwood等人，Met.Ions Biol.Syst.，1999，36309-364；A.I.Bush，Curr.Opin.Chem.Biol.，2000，4184-191)。在小鼠和人中，已經表明隨著自然老化在幾個組織中包括腦中鐵和銅水平增加(H.R.Massie等人，Ageing Dev.1979，1093-99；B.Drayer等人，Am.J.Roentgenol.，1986，147103-110；G.Bartzokis等人，Magn.Reson.Imaging，1997，1529-35；L.Del Corso等人，Panminerva Med.，2000，42273-277)。在AD患者的腦中也觀察到了過渡金屬失衡(J.R.Connor等人，J.Neurosci.Res.，1992，31327-335；D.A.Loeffler等人，Brain Res.，1996，738265-274；M.A.Deibel等人，J.Neurol.Sci.，1996，143137-142；R.Cornett等人，Neurotox.，1998，19339-345)，其中發現鋅、銅、和鐵的濃度在淀粉樣蛋白斑內和周圍變大(M.A.Lovell等人，J.Neurol.Sci.，1998，15847-52)。此外，β淀粉樣肽表現出高的對過渡金屬離子的親合性；并且Zn2+對Aβ的結合和Cu2+和Fe3+對Aβ的較小程度的結合顯著地增加蛋白質聚集和形成淀粉樣沉積物(A.I.Bush等人，Science，1994，2651464-1467)。在金屬螯合劑的存在下可使這兩個過程(聚集和沉積)反轉(X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1997，27226464-26470；C.S.Atwood等人，J.Biol.Chem.1998，27312817-12826；R.A.Cherny等人，J.Biol.Chem.，1999，27423223-23228)。
除了促進蛋白質聚集和淀粉樣物質積聚之外，氧化還原活性過渡金屬(即Cu2+和Fe3+)對Aβ的結合也導致活性氧物質的產生(X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1999，27437111-37116；X.Huang等人，Biochem.1999，387609-7616；L.M.Sayre等人，J.Neurochem.，2000，74270-279)，已知其對多種生物分子產生有害作用。生物金屬介導的和淀粉樣物質介導的活性氧物質的產生被認為至少部分地與AD患者腦中觀察到的氧化應激有關(M.A.Pappolla等人，Am.J.Pathol.，1992，40621-628；W.R.Markesbery，Free Radic.Biol.Med.，1997，23134-147；P.Gabbita等人，J.Neurochem.，1998，712034-2040；M.A.Smith等人，Antioxid.Redox Signal，2000，2413-420；M.P.Cuajungco等人，J.Biol.Chem.，2000，27519439-19422)。
過渡金屬離子可在阿爾茨海默氏病的一些病理效果中起作用這一發現為診斷方法和治療處置的開發提供了新的途徑。例如，在美國專利6,323,218中，金屬螯合劑或金屬復合化合物(如EDTA、4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、和青霉胺)被描述為是用于治療與淀粉樣病變有關的病理生理學狀況的治療劑。最近，氯碘羥喹，一種口服可生物利用的金屬螯合劑，已經在阿爾茨海默氏病的Tg2576轉基因小鼠模型中表現出顯著抑制皮層淀粉樣物質積聚(R.A.Cherny等人，Neuron.，2001，30665-676)。雖然這些研究結果令人充滿希望，并且暗示金屬螯合劑可能具有用于治療與淀粉樣物質積聚有關的狀況的治療價值，但可以證明許多非特異性金屬螯合劑的潛在的副作用對于臨床應用來說太大，因為它們可以擾亂其它需要金屬的生物分子的正常的生理功能。
因此，仍然非常期望開發用于早期診斷、預防、和治療通常是淀粉樣病變、特別是阿爾茨海默氏病的有效的藥物和方法。
發明概述本發明涉及與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的診斷、預防、和治療。具體地，本發明包括用于檢測淀粉樣沉積物的存在、和用于預防或治療與淀粉樣物質有關的狀況的試劑和對策。在某些優選實施方案中，本發明可用于與腦中淀粉樣蛋白和類淀粉樣蛋白的聚集和積聚有關的病理生理學狀況的診斷、預防、和治療。
一方面，本發明提供充當金屬螯合劑并表現出對淀粉樣沉積物具有某種程度的吸引力的靶向治療劑。更具體地，本發明提供包括與至少一個淀粉樣物質結合部分結合的至少一個金屬螯合部分的雙官能分子。優選地，淀粉樣物質結合部分表現出對Aβ淀粉樣沉積物的高親合性和特異性。在某些優選實施方案中，淀粉樣物質結合部分可透過血腦屏障。例如，在某些這種實施方案中，淀粉樣物質結合部分可以是苯并噻唑衍生物。在其它優選實施方案中，金屬螯合部分與生物學相關的高親合性過渡金屬離子結合，所述過渡金屬如鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)。例如，在這種實施方案中，金屬螯合部分可為DTPA或α-硫辛酸衍生物。
本發明優選的雙官能分子包括化合物XH1及其類似物，其化學結構示于圖4中。其它優選的本發明的雙官能分子包括化合物XH2及其類似物，其化學結構示于圖6中。
另一方面，本發明提供表現出對淀粉樣沉積物有某種程度的吸引力并且可通過成像技術檢測到的靶向治療劑。更具體地，本發明提供對比成像劑，其包括與至少一個淀粉樣物質結合部分結合的至少一個成像部分。在某些優選實施方案中，淀粉樣物質結合部分可透過血腦屏障。優選地，淀粉樣物質結合部分表現出對Aβ淀粉樣沉積物的高的親合性和特異性。例如，優選的淀粉樣物質結合部分可以是苯并噻唑衍生物。成像部分可以是本領域中已知的可被成像技術檢測到的任何適當的實體。在某些優選實施方案中，成像部分包括與可檢測金屬實體復合的至少一個金屬螯合部分。優選地，金屬螯合部分與生理學可接受的金屬實體復合。在優選實施方案中，金屬實體是順磁性金屬離子，對比成像劑可通過磁共振成像(MRI)檢測到。優選地，順磁性金屬離子為釓III(Gd3+)。在其它優選實施方案中，金屬實體是放射性核素，對比顯影劑可通過單光子發射計算機斷層成像(SPECT)檢測到。優選地，放射性核素為锝99m(99mTc)。
本發明還提供對比成像劑，其包括與至少一個淀粉樣物質結合部分結合的至少一個金屬螯合部分，所述淀粉樣物質結合部分由可通過核磁共振(NMR)檢測到的穩定的順磁性同位素標記。在優選實施方案中，穩定的順磁性同位素是碳-13(13C)或氟-19(19F)；并且對比成像劑可通過磁共振光譜分析(MRS)檢測到。
優選的本發明的對比成像劑是本文中所述的雙官能分子的釓III(Gd3+)復合體。
另一方面，本發明提供藥學組合物。本發明的藥學組合物包括至少一種本發明的試劑或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。在這些藥學組合物中，試劑的存在量足夠滿足其預定目的。更具體地，本發明提供藥學組合物，其包括有效量的至少一種雙官能分子或其生理學可耐受的鹽、和至少一種藥學可接受的載體。本發明還提供藥學組合物，其包括成像有效量的至少一種對比成像劑或其生理學可耐受的鹽、和至少一種藥學可接受的載體。在優選實施方案中，對比成像劑中的成像部分包括與釓III(Gd3+)或锝-99m(99mTc)復合的至少一個金屬螯合部分。在其它優選實施方案中，對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分由碳-13(13C)或氟-19(19F)標記。
在另一方面中，本發明提供在體外或體內降低或抑制淀粉樣物質毒性的方法。在某些優選實施方案中，本發明可通過預防、減慢、或停止淀粉樣物質積聚和/或通過促進、誘導、或幫助淀粉樣沉積物溶解而降低或抑制淀粉樣物質毒性。在其它優選實施方案中，本發明可通過減少、抑制、或干擾淀粉樣物質介導的活性氧物質的產生而降低或抑制淀粉樣物質的毒性。
更具體地，本發明提供了降低或抑制系統中淀粉樣物質毒性的方法，其包括使系統與本發明的雙官能分子或其藥學組合物接觸。該系統可為已知能夠產生和/或包含淀粉樣沉積物的任何生物實體。例如系統可為細胞、生物流體、生物組織或動物。該系統可來源于活著的患者(如其可通過活組織檢查得到)或死亡的患者(如其可通過尸體解剖得到)。患者可以是人或其它哺乳動物。在優選實施方案中，細胞、生物流體、或生物組織來源于懷疑患有與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的患者。
本文還提供治療患有與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的患者的方法，其包括對患者給予有效量的本發明的雙官能分子或其藥學組合物。在某些優選實施方案中，病理生理學狀況與β淀粉樣肽的積聚有關。
另一方面，本發明提供了用于檢測系統中或患者體內淀粉樣沉積物存在的方法。在優選實施方案中，本發明的方法基于靶向對比成像劑和成像技術的使用。
更具體地，本發明提供了用于檢測系統中淀粉樣沉積物存在的方法，其包括使系統與成像有效量的對比成像劑或其藥學組合物接觸。優選接觸在可使對比成像劑與系統中存在的淀粉樣沉積物相互作用、相互作用進而導致對比成像劑與淀粉樣沉積物結合的條件下進行。然后使用成像技術檢測系統中存在的與淀粉樣沉積物結合的對比成像劑，并且產生系統的至少一部分的一個或多個圖像。在某些優選實施方案中，本發明的方法可用于鑒別用于治療與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的潛在治療劑。本發明包括通過該方法鑒別的藥物。
本發明還提供了用于檢測患者體內淀粉樣沉積物存在的方法。這些方法包括對患者給予成像有效量的靶向對比成像劑或其藥學組合物。優選給藥在可使對比成像劑與患者體內存在的淀粉樣沉積物相互作用、相互作用進而導致對比成像劑與淀粉樣沉積物結合的條件下進行。在給藥之后，使用成像技術檢測患者體內存在的與淀粉樣沉積物結合的對比成像劑，并且產生患者身體的至少一部分的一個或多個圖像。
在某些優選實施方案中，通過使用對比成像劑進行本發明的檢測系統或患者體內淀粉樣沉積物存在的方法，其中成像部分包括與順磁性金屬離子復合的至少一個金屬螯合部分；通過磁共振成像(MRI)進行檢測；產生MR圖像。優選地，順磁性金屬離子是釓III(Gd3+)。在其它優選實施方案中，通過使用對比成像劑進行本發明的方法，其中成像部分包括與放射性核素復合的至少一個金屬螯合部分；通過單光子發射計算機斷層成像(SPECT)進行檢測；和產生SPECT圖像。優選地，放射性核素是锝-99m(99mTc)。在其它優選實施方案中，通過使用對比成像劑進行本發明的方法，其中淀粉樣物質結合部分由穩定的順磁性同位素標記；通過磁共振光譜分析(MRS)進行檢測；和產生MR圖像。優選地，穩定的順磁性同位素是碳-13(13C)或氟-19(19F)。
在某些實施方案中，本發明的方法用于定位患者體內的淀粉樣沉積物。在其它實施方案中，本發明的方法用于診斷與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況。在其它實施方案中，上述方法用于跟蹤與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的進展。在其它實施方案中，上述方法用于監測患者對與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的治療的應答。
本文中所述的雙官能治療分子、靶向對比成像劑、藥學組合物和方法也可用于診斷、預防或治療受到淀粉樣物質相關狀況影響的不同于人的哺乳動物。例如，它們可用于人淀粉樣病變的動物模型的情況中，以及動物朊病毒疾病中，如牛的牛海綿狀腦病、綿羊的癢病；貂的傳染性腦病、和黑尾鹿和麇鹿的慢性消耗性疾病。
通過以下詳細說明可使本發明的其它方面、特征和優點變得顯而易見。然而，應該理解，表明本發明的優選實施方案的詳細說明和具體的實施例只是以示例的方式給出。


圖1表示在本領域中已經表現出高的對淀粉樣蛋白的親合性的剛果紅(圖1A)、柯胺-G(圖1B)、(反，反)-1-溴-2，5-雙-(3-羥基羰基-4-羥基)-苯乙烯基苯(圖1C)、4′-碘-4′-脫氧多柔比星(圖1D)、和硫代黃素T(圖1E)的化學結構。
圖2表示已知的金屬鰲合劑4，7-二苯基-1，10-菲繞啉(圖2A)、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉(圖2B)、去鐵草酰胺(圖2C、青霉胺(圖2D)、EDTA(圖2E)、EGTA(圖2F)、DTPA(圖2G)、TETA(圖2H)、TPEN(圖2I)、和α-硫辛酸(圖2J)的化學結構。
圖3表示本領域中已知的可與由成像技術檢測到的金屬實體復合的DOTA(圖3A)、TTHA(圖3B)、ECD(圖3C)、EDTMP(圖3D)、和HMPAO(圖3E)的化學結構。
圖4表示一類新的雙官能分子的化學結構，該化學結構包括DTPA，DTPA擔當金屬螯合部分并以共價鍵結合于兩個相同的淀粉樣物質結合部分(硫代黃素衍生物)。該類化合物的母體分子(化合物XH1)和各種類似物分別出現在圖4A和圖4B中。
圖5表示化合物XH1的化學表征結果。XH1的質譜和1H-NMR光譜分別表示在圖5A和圖5B中。
圖6表示一類新的雙官能分子的化學結構，該化學結構包括α-硫辛酸，α-硫辛酸擔當金屬螯合部分并以共價鍵結合于一個淀粉樣物質結合部分(硫代黃素衍生物)。該類化合物的母體分子(化合物XH2)和各種類似物分別表示在圖6A和圖6B中。
圖7表示化合物XH2的化學表征結果。XH2的質譜和1H-NMR光譜分別表示在圖7A和圖7中。
圖8為表示雙官能分子XH1、金屬螯合化合物DTPA的存在對Aβ1-40聚集的效果。通過在400nm測量混濁度評價聚集。
圖9表示XH1對E17大鼠皮層原代神經元存活率的影響(圖9A)和對人SH-SY5Y成神經細胞瘤細胞的影響。在用XH1處理后48小時通過MTT試驗和/或LDH釋放試驗評價細胞存活率。數據報告為平均細胞存活率(相對于未處理培養物的百分比％)±標準偏差。分別對每個濃度的XH1進行至少三次實驗。
圖10表示SDS-PAGE凝膠表現出增加XH1濃度對APP表達的影響(圖10A)、和對用作對照的不同蛋白質(β-微管蛋白(圖10A)、APLP1和APLP2(圖10B))表達的影響。在用XH1處理SH-SY5Y人成神經細胞瘤細胞后48小時測量蛋白質合成。使用A8717作為APP的檢測抗體。
圖11表示在有或沒有Aβ1-40或HSA的存在下從使用對比成像劑(Gd-XH1或Gd-DTPA)培養的球形圖測量的T1-加權MRI信號。在A1-5中，Gd-XH1的濃度為0mM(A1)到0.5mM(A5)。在B1-5中，Gd-DTPA的濃度為0mM(B1)到1mM(B5)。C道中所有的球形圖都包含0.025mM的HSA，和濃度為0mM(C1)到0.25mM(C5)的Gd-XH1。D道中的球形圖包含0.5mM的HSA，和濃度為0mM(D1)到0.025mM(D5)的Aβ1-40。而E道中所有球形圖都包含1mM的Gd-XH1，和濃度為0mM(E1)到0.025mM(E5)的Aβ1-40。對比成像劑濃度增加產生更短的T1，從而產生更亮的信號。在這些實驗中沒有觀察到信號飽和。
圖12所示為表示球形圖的MRI信號變量作為對比成像劑(Gd-XH1或Gd-DTPA)和蛋白質(HSA或Aβ1-40)的函數的兩個圖。在圖12A中，報告了兩種對比成像劑Gd-XH1和Gd-DTPA的R1(即1/T1)的百分增長作為Aβ1-40濃度的函數。在圖12B中，報告了在有或沒有HSA(0.025mM)存在下，不同濃度的Gd-XH1的R1。
圖13為表示作為從包含Gd-DTPA(0.25mM)或Gd-XH1(0.25mM)和不同濃度的Aβ1-42的球形圖計算的R1(即1/T1)的MRI信號變化的圖。
圖14表示MRI信號，其在當AD小鼠和人腦組織提取物與Gd-XH1(0.025mM)混合時增強。
圖15表示MRI成像。第一組圖像(在圖15A中)為表示解剖特性的大鼠腦的基線圖像，第二組圖像(在圖15B中)表示在i.p.注射Gd-XH1之后約1小時測量的MRI信號的增加百分數。
定義在整個說明書中，使用若干術語，其在下文中定義。
術語“淀粉樣病變”和“淀粉樣物質相關狀況”在本文中可互換地使用。它們是指影響人或其它哺乳動物的任何病理生理學狀況，其特征在于淀粉樣物質在身體的任何器官或組織中的細胞外積聚。淀粉樣病變與多種醫學病癥有關，但也可作為原發性疾病發生。
如本文中使用的，術語“淀粉樣物質”是指淀粉樣蛋白的聚集(如聚合)形式，所述積聚產生細胞外的淀粉樣沉積物。無論淀粉樣蛋白的組成性質如何，所有的淀粉樣物質共有某些性質它們形成對剛果紅具有高親合性的不溶性β-褶狀折疊結構，其偏振光產生雙折射，給出特征X射線衍射圖形，并且對蛋白酶不敏感。
如本文中使用的，術語“淀粉樣沉積物”是指由細胞外的淀粉樣物質積聚產生的任何不溶性的四級結構。淀粉樣沉積物可為小纖維、纖絲、蛋白斑、或纏結的形式。
術語“淀粉樣蛋白”和“淀粉樣蛋白肽”在本文中可可互換地使用。它們是指單體(即未聚集)形式的淀粉樣蛋白氨基酸序列。淀粉樣蛋白(和類淀粉樣蛋白)的例子包括但不限于淀粉樣蛋白免疫球蛋白輕鏈(AL，涉及漿細胞惡液質，并在例如骨髓性白血病即骨髓癌患者中有發現)；血清淀粉樣蛋白相關蛋白質(AA或SAP，涉及慢性炎性狀況，如類風濕性關節炎和骨髓炎)；β淀粉樣肽(Aβ，其涉及神經退行性病癥如阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、路易體癡呆、具有淀粉樣物質的(荷蘭型)遺傳性腦出血、關島帕金森癡呆；和有可能在患有腦外傷的個體的腦中積聚)；改變型甲狀腺素運載蛋白(ATTR，涉及家族性淀粉樣病變)；小島淀粉樣物質多肽(islet amyloid-polypeptide，IAPP或Amylin，其在患有II型糖尿病的患者的胰腺中積聚)；和朊病毒蛋白(PrP，其涉及朊病毒疾病)。
術語“β淀粉樣肽”、“Aβ肽”、和“Aβ”在本文可互換地使用。它們在本領域還已知為β-蛋白、β-A4和A4。Aβ為小的、可溶性的、4.3kDa、39-43個氨基酸長度的肽，其序列以前被公開過(參見C.Hilbich等人，J.Mol.Biol.，1992，228460-473)。在本發明中，術語β淀粉樣肽包括Aβ1-43、以及Aβ1-42、Aβ1-41、Aβ1-40和Aβ1-39。術語“Aβ淀粉樣物質”是指聚集狀態的β淀粉樣肽。在例如阿爾茨海默氏病患者的腦中、唐氏綜合癥的成人患者的腦中發現Aβ淀粉樣沉積物，并且在患有腦外傷的個人中偶有發現。
術語“結合親合性”和“親合性”在本文中可互換地使用，是指分子實體之間的吸引力水平。親合性可定量地表示為離解常數(Kd)、或其倒數，即締合常數(Ka)。在本發明的情況中，考慮兩種類型的親合性(1)淀粉樣物質結合部分對淀粉樣沉積物的親合性、和(2)金屬螯合部分對過渡金屬離子或其它金屬實體的親合性。
術語“淀粉樣物質結合部分”是指表現出對淀粉樣沉積物具有高親合性和特異性的任何實體。當淀粉樣物質結合部分為分子的一部分時。其將自身的性質賦予分子，使分子變為“靶向的”(即其特異性地和有效地與淀粉樣沉積物相互作用并結合)。淀粉樣物質和淀粉樣物質結合部分的結合可為共價的或非共價的(如疏水性相互作用、靜電相互作用、偶極相互作用、范德華相互作用、氫鍵合等等)。最常見的結合為非共價形式。
在本文中用于化學部分、試劑、化合物、或分子的術語“金屬螯合”和“螯合”是指實體的特征為存在參與與過渡金屬離子或其它金屬實體形成復合體(包含超過一個配價鍵)的兩個或多個極性基團的能力。金屬螯合劑在本領域中已知。金屬螯合劑的例子包括但不限于2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、乙二胺四乙酸、4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、去鐵草酰胺、和氯碘羥喹。
在本發明的情況中，術語“雙官能分子”是指包括與至少一個淀粉樣物質結合部分連接的至少一個金屬螯合部分并且因此表現出雙重選擇性的分子。更具體地，本發明的雙官能分子(1)以高的親合性與過渡金屬離子結合、并且(2)對淀粉樣沉積物表現出高的親合性和特異性。金屬螯合部分和淀粉樣物質結合部分可通過共價或非共價鍵連接。優選地，連接為共價連接。
如本文中使用的，術語“過渡金屬離子”是指本領域中已知作為過渡金屬的元素的離子形式。更具體地，在本發明的情況中，考慮三種生物學相關的過渡金屬離子，即“鋅II”、“銅II”、和“鐵III”，除非另作說明，其分別指Zn2+、Cu2+、和Fe3+。
如本文中使用的，術語“對比成像劑”是指可用于使用成像技術檢測特定的生物元素的任何實體。本發明的對比成像劑是包括與至少一個淀粉樣物質結合部分連接的至少一個成像部分的靶向分子。在本發明的優選實施方案中，對比成像劑的成像部分包括至少一個與金屬實體復合的金屬螯合劑。本發明的其它對比成像劑包括與至少一個淀粉樣物質結合部分結合的至少一個金屬螯合部分，所述淀粉樣物質結合部分由可通過NMR檢測到的穩定的順磁性同位素標記。本發明的對比成像劑可用于檢測體外、體內、和回體(ex vivo)系統以及存活患者體內的淀粉樣沉積物。
如本文中使用的，術語“金屬實體”是指可通過成像技術如磁共振成像(MRI)檢測到的順磁性金屬離子、或可通過成像技術如單光子發射計算機斷層成像(SPECT)和正電子發射層析成像(PET)檢測到的放射性核素。
如本文中使用的，術語“順磁性金屬離子”是指可復合于金屬螯合劑并可通過MRI檢測到的生理學可耐受的實體。優選地，順磁性金屬離子選自釓III(Gd3+)、鉻III(Cr3+)、鏑III(Dy3+)、鐵III(Fe3+)、錳II(Mn2+)、和鐿III(Yb3+)。
如本文中使用的，術語“放射性核素”是指可復合于金屬螯合劑并用于放射性藥物技術中的金屬元素的放射性同位素。優選的放射性核素為锝-99m(99mTc)、鎵-67(67Ga)、釔-91(91Y)、銦-111(111In)、錸-186(186Re)和鉈-201(201Tl)。
如本文中使用的，術語“穩定的順磁性同位素”是指可通過核磁共振光譜法(MRS)檢測到的順磁性核。用于本發明的優選的穩定順磁性同位素是碳-13(13C)和氟-19(19F)。
在本發明的情況中，術語“氧化還原活性過渡金屬離子”是指可通過參與一系列涉及淀粉樣物質和/或淀粉樣沉積物和氧(O2)的反應被還原、并從而形成活性氧物質的過渡金屬離子(例如Cu2+和Fe3+，可分別被還原為Cu+和Fe2+)。不能經歷這種反應的鋅II(Zn2+)，被稱為“氧化還原非活性過渡金屬離子”。
如本文中使用的，術語“活性氧物質”是指衍生自氧并通常具有生物系統毒性或容易參加毒性副產物生成反應的分子。活性氧物質包括超氧化物自由基陰離子(O2·-)、羥基自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)、和單線態氧(1O2，1Δg)。
術語“淀粉樣物質介導的”，當用于活性氧物質的產生時，是指涉及單體或聚合形式的淀粉樣蛋白、氧化還原活性過渡金屬離子、和氧并形成活性氧物質的一系列過程。
“氧化應激”在本文中是描述系統直接或間接由淀粉樣物質介導的活性氧物質的產生引起的損傷狀態的通用術語。當系統的抗氧化防衛機制不再能抑制產生的活性氧物質的有害作用時發生氧化應激。氧化應激首先可影響特定的生物分子(如蛋白質、脂質、和核酸)，最終誘導可以產生細胞突變、細胞死亡、和組織破壞的大量細胞損壞。
在本發明的情況中，術語“淀粉樣物質毒性”是指當以β-折疊構造聚集時淀粉樣蛋白具有毒性的能力、和/或淀粉樣蛋白和/或淀粉樣沉積物產生對多種生物分子具有有害作用并可最終誘導氧化應激的活性氧物質的能力。
術語“預防”在本文中是表征目的在于延遲或預防與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況發病的方法。術語“治療”在本文中是表征目的在于(1)延遲或預防與淀粉樣病變有關的狀況的發病；或(2)減慢或終止狀況癥狀的進展、惡化、或退化；或(3)改善狀況癥狀；或(4)治愈該狀況的方法。治療可在疾病發病之前進行，作為預防處置或預防性措施。其也可在疾病開始之后進行，用于治療作用。
術語“個體”或“患者”在本文中可互換地使用。它們是指可能受到與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況影響但可能患有或未患有這種疾病的人或其它哺乳動物。
如本文中使用的，術語“系統”是指本領域中已知能夠產生和/或包含淀粉樣沉積物的生物實體。在本發明的情況中，考慮了體外、體內、和回體系統；并且系統可為細胞、生物流體、生物組織、或動物。系統可來源于例如活著的患者(如其可通過活組織檢查得到)、或得自死亡的患者(如其可通過尸體解剖得到)。患者可以是人或其它哺乳動物。
如本文中使用的，術語“生物流體”是指由患者產生并得自患者的流體。生物流體的例子包括但不限于腦脊髓液(CSF)、血清、尿液、和血漿。在本發明中，生物流體包括通過例如超濾作用或色譜分離法純化分離的這種流體的全部級分或任何級分。
如本文中使用的，術語“生物組織”是指得自患者的組織。生物組織可為體內的任何器官或系統的全部或其一部分(如腦、胰腺、心臟、腎、胃腸道、甲狀腺、神經系統、皮膚等)。
如本文中使用的，術語“有效量”是指足夠滿足其預定目的(如所述目的可為減慢或預防與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的發病；減慢或終止該狀況癥狀的進展、惡化、或退化；引起狀況癥狀改善；或治愈該狀況。上述目的還可為預防、減慢、或終止系統或患者體內淀粉樣物質積聚；促進、誘導、或幫助溶解系統或患者體內存在的淀粉樣沉積物；或減少、抑制或干擾淀粉樣物質介導的活性氧物質的產生)的任何量的本發明的雙官能分子、或其藥學組合物。
如本文中使用的，術語“成像有效量”是指足夠允許使用成像技術檢測系統或患者體內存在的淀粉樣沉積物的任何量的本發明的對比成像劑或其藥學組合物。
如本文中使用的，“藥學組合物”定義為包括至少一種本發明的試劑(雙官能治療分子或靶向對比成像劑)或其生理學可耐受的鹽、和至少一種藥學可接受的載體。
術語“生理學可耐受的鹽”是指分別保留游離堿或游離酸的生物活性和性質的任何酸加成鹽或堿加成鹽，并且其不是生物學不合需要的或其它方面不合需要的。酸加成鹽是與無機酸(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)；和有機酸(如乙酸、丙酸、丙酮酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、安息香酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等等)形成的鹽。堿加成鹽是與無機堿形成的鹽(如鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鋅、鋁鹽等)和與有機堿形成的鹽(如伯、仲、叔胺、包括天然存在的取代胺的取代胺、環胺和堿離子交換樹脂的鹽，如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、三甲胺、二環己基胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、hydrabamine、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等)形成的。
如本文中使用的，術語“藥學可接受的載體”是指不干擾活性成分的生物活性的有效性并在其給藥濃度下不對宿主產生過多毒性的載體介質。該術語包括溶劑、分散介質、包衣、抗菌藥和抗真菌藥、等滲劑、吸收延遲劑等等。這種介質和試劑在藥學活性物質中的使用在本領域中是公知的(參見例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin，第十八版，1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA)。
另外的定義在整個詳細說明中提供。
某些優選實施方案的詳細描述本發明涉及與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的診斷、預防、和治療。具體地，本發明包括用于檢測淀粉樣沉積物的存在和用于預防或治療淀粉樣物質相關狀況的試劑和對策。在某些優選實施方案中，本發明可用于腦中與淀粉樣蛋白和類淀粉樣蛋白的聚集和積聚有關的病理生理學狀況的診斷、預防、和治療。
I.雙官能治療分子本發明的一個方面涉及一類新的靶向治療劑。
對正常衰老個體和阿爾茨海默患者腦中生物金屬作用的研究為開發更有效的治療設定了新的方向。使用金屬螯合分子調節過渡金屬離子的水平已經在體外表現出能夠溶解淀粉樣沉積物和預防氧化性損傷。還發現金屬螯合劑顯著地降低轉基因小鼠腦中的淀粉樣蛋白負荷(R.A.Cherny等人，Neuron.，2001，30665-676)。這些結果非常有希望并顯示了這種方法用于治療淀粉樣物質相關狀況的潛力。然而，大多數已知的金屬螯合劑為非特異性的并且可干擾其它需要金屬的生物分子的正常生理功能，從而產生對于臨床應用來說太大的副作用。
本發明包括對靶向金屬螯合劑的以下鑒別能夠防止金屬離子干擾淀粉樣蛋白和淀粉樣沉積物而不干擾其它重要生物分子的作用；應該表現出較少的不希望的副作用；并且比目前使用的、試驗的、或建議作為用于治療淀粉樣物質相關的病理生理學狀況的治療劑的大多數非特異性金屬螯合劑更有效。因此，本發明提供治療劑，其設計為用于(1)對淀粉樣物質有某種程度的吸引力、和(2)作為金屬鰲合劑。更具體地，本發明提供雙官能分子，其包括與至少一個淀粉樣物質結合部分結合的至少一個金屬螯合部分。
淀粉樣物質結合部分淀粉樣物質結合部分是對淀粉樣沉積物具有某種程度的吸引力并且可以在當其被包含在雙官能分子中時起到靶向作用的實體。在優選實施方案中，淀粉樣物質結合部分表現出對淀粉樣沉積物高的親合性和特異性，即它們特異性地和/或有效地與淀粉樣物質相互作用、結合、或對淀粉樣物質標記。優選地，淀粉樣物質結合部分是在體外和體內條件下保留其結合性質的穩定的無毒性實體。在某些優選實施方案中，淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣物質具有高的親合性和特異性。更具體地，當使用合成的Aβ肽或阿爾茨海默氏病腦組織(如實施例部分中所述)測定時，這些淀粉樣蛋白結合實體以0.1nM到10μM的離解常數(Kd)與Aβ結合。在其它優選實施方案中，淀粉樣物質結合部分能夠透過血腦屏障。這種性質對于當雙官能分子用作用于治療以腦中聚集的淀粉樣蛋白和類淀粉樣物質積聚為特征的神經退行性病癥的治療劑時特別重要。
淀粉樣物質結合部分與淀粉樣沉積物之間的相互作用可為共價的或非共價的。最經常是，淀粉樣物質結合部分與淀粉樣沉積物之間的相互作用為非共價的(見下文)。非共價相互作用的例子包括但不限于疏水性相互作用、靜電相互作用、偶極相互作用、范德華相互作用、和氫鍵。不管相互作用的性質如何，淀粉樣沉積物與本發明雙官能分子內的淀粉樣物質結合部分之間的結合應該為選擇性的、特異性的、并且足夠強以使得金屬螯合部分發揮其作用(即預防、抑制、或反轉過渡金屬離子與淀粉樣蛋白和/或淀粉樣沉積物之間的相互作用)。
用于本發明中的適當的淀粉樣物質結合部分包括滿足要求上列條件的任何淀粉樣蛋白結合實體。實際上，淀粉樣沉積物的生物標志物的開發作為研究目標已經多年了(W.E.Klunk，Neurobiol.Aging，1998，19145-147)，并且現有多個這種化合物。剛果紅(其化學結構在圖1A中示出)用于體外對淀粉樣沉積物染色已經有數十年了(M.Tubis等人，J.Am.Pharm.Assoc.，1960，49422-425；M.Tubis等人，Nukl.Med.，1962，325-38)。
已經提出了幾種模型用于說明剛果紅對以β折疊構造聚集的淀粉樣蛋白的特異性親合性(W.E.Klung等人，J.Histochem.Cytochem.，1989，371273-1281；W.E.Klunk等人，Neurol.Aging，1994，15691-698；D.B.Carter和K.-C.Chou，Neurol.Aging，1998，1937-40)。在所有提出的模型中，認為剛果紅的陰離子型磺酸鹽基團和淀粉樣蛋白肽上的堿性氨基酸如精氨酸和賴氨酸之間的化學計量的和飽和的靜電相互作用在優先結合中起到重要作用。在一些提出的模型中，還假設所述相互作用中涉及剛果紅的聯苯部分與淀粉樣蛋白肽的苯丙氨酸部分之間的芳香族相互作用。
基于這些模型，推斷特異性結合于淀粉樣沉積物的分子傾向于是長的、共軛系統，該系統具有在每個末端帶負電荷的基團的多個苯環。使用這些標準，已經設計、合成(N.A.Dezutter等人，Eur.J.Nucl.Med.，1999，261392-1399；D.M.Skovronsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，977609-7614))涉及剛果紅的雙偶氮聯苯胺(bisdiazobenzidine)化合物(參見例如美國專利4,933,156、5,008,099、和5,039,511)；柯胺-G(圖1B)及衍生物(參見例如美國專利6,114,175、6,133,259、和6,168,776)；(反，反)-1-溴-2，5-雙(3-羥基羰基-4-羥基)-苯乙烯基苯(BSB)(圖1C)和多種類似物，并放射性標記和評價其在體外和體內作為潛在的淀粉樣沉積物的探針(W.E.Klunk等人，Neurobiol.Aging，1994，15691-698，W.Zhen等人，J.Med.Chem.，1999，422805-2815N.A.Dezutter等人，J.Nucl.Med.，1999，261392-1399；D.M.Skovronsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，977609-7614)。發現所有的這些分子都對Aβ表現出高的親合性和特異性并因此適用于本發明中。然而，在這些生物標志物的一些上的高極性官能團的存在顯示出限制其進入大腦，只有沒有極性官能團的衍生物表現出高的大腦攝入。本發明的雙官能分子的設計將受其預定目的的限定，并且根據淀粉樣物質結合部分的已知的、觀察到的或期望的性質(例如，它們的血腦屏障透過性)選擇淀粉樣物質結合部分。
當選擇淀粉樣物質結合部分設計雙官能治療分子時，還應該將毒性作為一個因素考慮。例如，本領域中已知偶氮染料可能是致癌的(D.L.Morgan等人，Environ.Health Perspec.，1994，10263-78)。偶氮染料的潛在致癌性被認為是由于其被大腸菌大量代謝降解為游離的(毒性的)母體胺產生的(C.E.Cerniglia等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1982，1071224-1229；C.E.Cerniglia等人，Carcinogen.，1982，31255-1260)。為了避免毒性的問題，期望避免偶氮染料如剛果紅、柯胺-G及其衍生物作為淀粉樣物質結合部分、或選擇給藥途徑以使雙官能治療分子避開大腸菌。
還評價了較小分子與淀粉樣沉積物特異性結合的能力。這些包括但不限于anthracycline，即4′-碘代-4′-脫氧多柔比星(圖1D)，已經發現其強烈地結合于多種不同類型的淀粉樣蛋白和淀粉樣沉積物(G.Merlini等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，922959-2963)；噻唑染料如櫻草素、硫代黃素S、和硫代黃素T(其化學結構在圖1E中)。已知這些噻唑染料使組織切片中的淀粉樣物質染色并在體外有效地結合于合成的Aβ(G.Kelenyi，Histochem.Cytochem.，1967，15172-180；J.Burns等人，J.Pathol.Bacteriol.，1967，94337-344；R.Guntern等人，Experientia，1992，488-10；H.LeVine，Meth.Enzymol.，1999，309274-284)。有趣地是，最近表明，從硫代黃素T的雜環除去甲基，這樣去掉了正電荷，產生與Aβ具有高親合性以及在嚙齒類中具有良好的腦攝入的一系列親脂性染料(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，691471-1484；Z.P.Zhuang等人，J.Med.Chem.，2001，441905-1914)。
在某些優選實施方案中，淀粉樣物質結合部分是已經報導表現出對淀粉樣沉積物具有高親合性和能夠跨越血腦屏障的小分子的衍生物(D.M.Skovronsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，977609-7614)。實施例1和實施例9描述了兩類新的包括這種淀粉樣蛋白結合小分子中的至少一個的雙官能分子的合成。
優選地，淀粉樣物質結合部分包含可用于(或容易地化學轉化成可用的不同官能團)使淀粉樣物質結合部分共價連接于金屬螯合部分的至少一個官能團。適當的官能團包括但不限于胺(優選伯胺)、硫醇、羧基等等。
金屬螯合部分金屬螯合部分是可以以高親合性與過渡金屬離子結合的實體。優選地，可通過金屬螯合部分復合的過渡金屬離子為生物金屬(即它們是生物學相關的過渡金屬離子)。最優選地，金屬螯合部分以高親合性與在淀粉樣沉積物內和周圍發現的高濃度的過渡金屬離子結合。在某些優選實施方案中，金屬螯合部分以高親合性與選自鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)中的至少一種過渡金屬離子結合。優選地，金屬螯合部分是在體外和體內條件下保留其結合性質的穩定的無毒性實體。
在淀粉樣蛋白相關臨床狀況病理學的至少兩個方面涉及到過渡金屬離子的實驗證據越來越多。研究表明(1)過渡金屬與淀粉樣蛋白之間的相互作用可通過加速淀粉樣蛋白肽聚集和積聚成為毒性的β折疊構造而增強淀粉樣物質毒性，和(2)氧化還原活性過渡金屬離子可以通過有利于產生活性氧物質而增加淀粉樣物質的毒性。
具體地，已經表明β淀粉樣肽具有選擇性的高親合性和低親合性的Cu2+和Zn2+結合部位(A.I.Bush等人，J.Biol.Chem.，1994，26912152-12158)，并且Aβ與Cu2+、Zn2+、和Fe3+的相互作用已經顯示了促進肽的聚集和積聚(A.I.Bush等人，J.Biol.Chem.1994，2651464-1467)。在申請人的實驗室中，金屬螯合劑在死亡后尸檢的人腦樣品中反轉合成Aβ肽的聚集、溶解淀粉樣物質(C.S Atwood等人，J.Biol.Chem.，1998，27312817-12826；X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1997，27226464-26470；R.A.Cherny等人，J.Biol.chem.1999，27423223-23228)和誘導對用于阿爾茨海默氏病的Tg2576轉基因小鼠模型腦中淀粉樣物質負荷的顯著抑制(R.A.Cherny等人，Neuron.，2001，30665-676)導致了金屬螯合劑和金屬復合分子作為用于治療與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的潛在治療劑的提議(參見美國專利6,323,218)。
通過干擾過渡金屬離子與淀粉樣蛋白和/或淀粉樣沉積物之間的相互作用，金屬螯合劑可影響淀粉樣物質毒性。根據本發明的這個方面，適當的金屬螯合部分是可以通過預防、減慢、或終止淀粉樣蛋白的聚集和積聚、和/或通過促進、誘導、或幫助淀粉樣沉積物溶解而降低或抑制淀粉樣物質毒性的實體。這可以在當金屬螯合部分以高親合性結合于至少一個選自鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)的過渡金屬離子時實現。
有確鑿的證據表明，引起細胞損傷的氧化應激對于在阿爾茨海墨氏病中觀察到的神經退行性疾病是至關重要的(R.N.Martins等人，J.Neurochem.，1986，461042-1045)。在AD患者腦中持續觀察到蛋白質以及核DNA和線粒體DNA的氧化增加(P.Gabbita等人，J.Neurochem.，1998，712034-2040；W.R.Markesbery，Free Radic.Biol.Med.，1997，23134-147；M.P.Cuajungco等人，J.Biol.Chem.，2000，27519439-19442)。此外，β淀粉樣肽已經顯示能夠增強神經來源的細胞以及無細胞培養基中活性氧物質的產生(C.Behl等人，Cell，1994，77817-827；X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1999，27437111-37116；X.Huang等人，Biochem.，1999，387609-7616)。當Aβ結合Cu2+和/或Fe3+時觀察到發生大規模的氧化還原化學反應，以催化的方式使兩種金屬的氧化態降低并從O2產生H2O2(X.Huang等人，Biochem.，1999，387609-7616)。因為在受AD-影響的腦中的淀粉樣沉積物中發現銅(400μM)、鋅(1mM)和鐵(1mM)水平升高(M.A.Lovell等人，J.Neurol.Sci.，1998，15847-52；M.A.Smith等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，949866-9868)，在阿爾茨海默氏病中觀察到的氧化應激被認為與通過Aβ的金屬結合形式產生活性氧物質有關。這一假設得到了從AD腦分離的老年斑和神經元纖維纏結能夠產生活性氧物質、并且發現銅和鐵的存在是反應發生所必需的(L.M.Sayre等人，J.Neurochem.，2000，74270-279)的觀察結果的支持。
氧化還原活性金屬如Cu2+和Fe3+可以參與導致活性氧物質產生的反應(W.R.Markesbery，Free Rad.Biol.Med.，1997，23134-147)。這種反應的一個系列如下所示。β淀粉樣肽以及Aβ淀粉樣物質具有還原Cu2+(或Fe3+)的能力并同時從分子氧的表觀還原生成超氧化物自由基陰離子(O2·-)而形成過氧化氫(H2O2)。隨后發生類似Fenton的反應，該反應產生羥基自由基。
(a)如，或
(b)(c)如或除了上述的活性氧物質之外，可以形成其它自由基，并且其它自由基也促進淀粉樣病變的病理。這些包括但不限于淀粉樣蛋白肽和淀粉樣沉積物的自由基形式，和氧化氮陰離子，氧化氮陰離子可通過例如超氧化物自由基陰離子與一氧化氮的反應產生。
根據本發明的這一方面，適當的金屬螯合部分是可以通過減少、抑制、或干擾生物金屬介導的和淀粉樣物質介導的活性氧物質的產生而降低或抑制淀粉樣物質毒性的實體，所述活性氧物質包括超氧化物自由基陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)和單線態氧(1O2)。這可以在當雙官能分子中的金屬螯合部分以高親合性結合于氧化還原活性過渡金屬離子中的至少一種時實現，所述氧化還原活性過渡金屬離子選自銅II(Cu2+)和鐵III(Fe3+)。
用于本發明中的適當的金屬螯合部分可以是已知以高親合性與過渡金屬離子結合的多種金屬螯合劑和金屬復合分子中的任何一種。其包括但不限于芳香族胺如紅菲繞啉(4，7-二苯基-1，10-菲繞啉，其結構在圖2A中)、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉(圖2B)、和TPEN(四(2-吡啶甲基)乙二胺，圖2I)；和脂肪族胺如去鐵草酰胺(圖2C)、青霉胺(2-氨基-3-巰基-3-甲基丁酸，圖2D)、EDTA(乙二胺四乙酸，圖2E)、EGTA(O，O′-雙(2-氨乙基)乙二醇-N，N′，N″，N_-四乙酸，圖2F)、DTPA(二亞乙基三胺五乙酸，圖2G)、和TETA(三亞乙基四胺，圖2H)；及其官能衍生物、同系物和類似物。
α-硫辛酸衍生物構成了可用于本發明實踐中的金屬螯合劑的另一個種類。除了表現出金屬螯合性質之外，α-硫辛酸衍生物還具有強大的抗氧化活性(綜述，參見例如H.Moini等人，Toxicol.Appl.Pharmacol.，2002，18284-90；或G.Biewenga等人，Gen.Pharmac.，1997，29315-331)。α-硫辛酸的抗氧化作用已經在神經元和非神經元組織中表現出來(M.A.Lynch，Nutr.Neurosci.，2001，4419-438)。體外、動物、和初步的對人的研究結果表明硫辛酸可在多種神經退行性病癥中有效(L.Packer等人，Free Radic.Biol.Med.，1997，22359-378)。具體地，α-硫辛酸已經被證明在AD患者死后尸檢的人腦中有效降低神經元淀粉樣物質負荷(J.Fonte等人，J.Alzheimer Dis.，2001，3209-219)，和反轉老年小鼠中的記憶損傷和腦氧化應激(S.A.Farr等人，J.Neurochem.，2003，831173-1183)。
預計α-硫辛酸衍生物(與其它金屬螯合劑相比)表現出的另外的性質(如抗氧化)可以擴大雙官能分子的作用范圍，因為α-硫辛酸可以通過不同機制發揮其抗氧化作用，包括螯合金屬離子、清除活性氧物質(ROS)或其它自由基、再生內原性抗氧化劑(如維生素C、維生素E和谷胱甘肽)、和/或修復氧化性損傷。
本發明的雙官能分子的精確設計將受其預定目的影響并且根據金屬螯合部分的已知的、觀察到的或期望的性質選擇金屬螯合部分。用于干擾淀粉樣蛋白聚集和促進淀粉樣沉積物溶解的優選的金屬螯合部分包括DTPA、2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、青霉胺，及其衍生物、同系物和類似物，或其任何的組合。用于干擾生物金屬介導的和淀粉樣物質介導的活性氧物質產生的優選的金屬螯合部分包括2，9-二甲基-4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、4，7-二苯基-1，10-菲繞啉、α-硫辛酸，及其衍生物、同系物和類似物，或其任何的組合。
已經開發了包括與兩個相同的淀粉樣物質結合部分(苯并噻唑衍生物)共價結合的DTPA作為金屬螯合部分的第一類新的雙官能分子，其合成、性質和應用在實施例部分中描述(參見實施例1、4到6)。包括與一個淀粉樣物質結合部分(選自與第一類中使用的那些相同的苯并噻唑衍生物)共價結合的α-硫辛酸作為金屬螯合部分的第二類雙官能分子的合成在實施例9中描述。
優選地，金屬螯合部分含有至少一個可用于使金屬螯合部分共價連接于淀粉樣物質結合部分的官能團(或可以容易地化學轉化為可使用的不同官能團)。適當的官能團包括但不限于胺(優選伯胺)、硫醇、羧基等等。
雙官能分子的合成可通過本領域中已知的任何合成方法制備本發明的雙官能分子，唯一的必要條件是在反應之后，淀粉樣物質結合部分和金屬螯合部分分別保持其結合和螯合性質。淀粉樣物質結合部分可以以多種方式與金屬螯合部分結合。優選地，淀粉樣物質結合部分共價連接于金屬螯合部分。本領域技術人員可以理解，淀粉樣物質結合部分和金屬螯合部分可直接彼此連接或通過連接基團彼此連接。
在某些優選實施方案中，金屬螯合部分和淀粉樣物質結合部分直接地彼此共價連接。直接的共價結合可以通過酰胺鍵、酯鍵、碳-碳鍵、二硫鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、硫醚鍵、脲鍵、胺鍵、或碳酸酯鍵進行。可通過利用淀粉樣物質結合部分和金屬螯合部分上的官能團實現共價結合。可用于將兩個部分連接在一起的適當的官能團包括但不限于胺(優選伯胺)、酸酐、羥基、羧基、和硫醇。例如如實施例1中所述，可通過淀粉樣物質結合部分上的伯胺和金屬螯合部分上的酸酐官能團之間的反應形成酰胺鍵。也可通過使用活性劑如碳二亞胺使一個部分中的伯胺與另一個部分上的羧基結合。有多種活性劑在本領域中已知并適合于用于本發明中。
在其它優選實施方案中，金屬螯合部分和淀粉樣物質結合部分可通過連接基團彼此間接地共價連接。這可以通過使用本領域中公知的多種穩定的雙功能試劑完成，包括同官能的和雜官能的連接基團(參見例如Pierce Catalog and Handbook，1994)。使用雙官能連接基團與使用活性劑的不同之處在于雙官能連接基團在反應之后在本發明的雙官能分子中得到連接部分，而活性劑使反應中的兩個部分之間得到直接連接。雙官能連接基團的主要作用是允許兩個否則為化學惰性的部分之間反應。然而，還可以選擇變成反應產物的一部分的雙官能連接基團，使其賦予雙官能分子某種程度的構型靈活性(如雙官能連接基團包括含幾個原子的直鏈烷基鏈，例如含有2到10個碳原子的直鏈烷基鏈)。
在本發明的情況中可以使用多種本領域中已知的適當的同官能的和雜官能的連接基團。優選的連接基團包括但不限于烷基和芳基，包括具有如氨基、酸酐、羥基、羧基、羰基等活性化學官能度的直鏈和支鏈烷基、取代烷基和芳基、雜烷基和雜芳基。
本領域技術人員可以容易地理解，本發明的雙官能分子可以包括通過多種不同的方式彼此連接的多種淀粉樣物質結合部分的和多種金屬螯合部分。本發明的雙官能分子內的淀粉樣物質結合部分可以完全相同或不同。類似地，本發明的雙官能分子內的金屬螯合部分可完全相同或不同。雙官能治療分子的精確設計將受其預定目的和其使用的具體情況中期望的性質的影響。
II.靶向對比成像劑本發明的另一個方面涉及一類新的靶向對比成像劑。
以上已經提及，目前淀粉樣病變的診斷包括活組織檢查或組織樣品的組織病理學。淀粉樣物質的存在典型地通過在使用剛果紅染色之后在正交偏振光下檢測的蘋果綠雙折射測定。然而，受影響器官的活組織檢查不排除并發癥，并且不能令人滿意地顯示淀粉樣沉積物的程度或分布(C.Friman和T.Pettersson，Curr.Opin.Rheumatol.，1996，86-71)。在阿爾茨海默氏病的情況中，淀粉樣沉積物只能在死后評價。這構成了對疾病進行研究和開發更有效的治療方法的主要障礙。
用于診斷淀粉樣病變的理想探針應為對淀粉樣物質具有高的親合性和特異性；表現出低的毒性；并允許檢測、定位、和定量患者體內存在的淀粉樣沉積物。對于與腦中淀粉樣蛋白(或類淀粉樣蛋白)的聚集和積聚有關的阿爾茨海默氏病和其它神經退行性病癥的診斷，理想的探針還應該可透過血腦屏障，并且允許非侵入性檢測、定位、和定量活著的患者腦中的淀粉樣沉積物。
本發明涉及滿足一些上列標準的靶向、可檢試驗劑。因此，本發明提供了靶向對比成像劑，其設計為用于(1)對淀粉樣物質具有某種程度的吸引力、和(2)可通過成像技術檢測到。更具體地，本發明提供了包括與至少一個淀粉樣物質結合部分連接的至少一個成像部分的對比成像劑。
淀粉樣物質結合部分本發明的對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分起到與在上述雙官能治療分子中的作用相同的作用；它們是對淀粉樣物質表現出某種程度的吸引力的靶向實體，即，它們特異性地和/或有效地與淀粉樣沉積物相互作用、結合、或對其標記。因此用于設計和開發對比成像劑的適當的淀粉樣物質結合部分與以上列舉的用于雙官能治療分子中的那些淀粉樣物質結合部分相同。
在某些優選的實施方案中，本發明的對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分表現出對淀粉樣沉積物的高的親合性和特異性。在其它優選實施方案中，淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣物質具有高的親合性和特異性。在其它優選實施方案中，淀粉樣物質結合部分能夠跨越血腦屏障，如上所述，這在當對比成像劑預定用作在腦中定位淀粉樣沉積物的體內生物標志物時是一個重要的性質。
上述的某些偶氮染料的潛在致癌性在淀粉樣蛋白成像研究中意義不大，因為在任何時候只有非常微量的、微不足道量的高特異性淀粉樣物質結合部分接觸大腸菌。
成像部分在本發明的情況中，成像部分是可通過成像技術如磁共振成像(MRI)、磁共振光譜分析(MRS)、單光子發射計算機斷層成像(SPECT)和正電子發射層析成像(PET)檢測到的實體。優選地，成像部分是在體外和體內條件下保持其性質的穩定的無毒性實體。
MRI成像部分在某些優選實施方案中，本發明的對比成像劑設計為可通過磁共振成像檢測到。
MRI已經發展為診斷臨床醫學和生物醫學研究中最強大的非侵入性技術(P.Caravan等人，Chem.Rev.，1999，992293-2352；W.Khun，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1990，291-19；M.M.Huber等人，Bioconjug.Chem.，1998，9242-249；R.A.Moats等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1997，36726-728；X.Yu等人，Mag.Res.Med.，2000，44867-872)。MRI是用于化學、物理學和分子結構生物學中最著名的分析方法-核磁共振(NMR)-的應用。MRI可以在相對短的時間跨度內產生三維結構信息，并廣泛用作非侵入性診斷工具以識別可能有害的生理學異常、觀察血液流動、或測定心血管系統的一般狀態(P.Caravan等人，Chem.Rev.，1999，992293-2352)。
MRI的優點(優于其它高質量成像方法)在于不依靠可能有害的電離輻射(A.R.Johnson等人，Inorg.Chem.，2000，392652-2660)。在MRI中，通過檢測水濃度中的局部變化、和NMR信號與水質子(1H)的T1(自旋點陣)和T2(自旋-自旋)張弛時間提供生物樣品或患者身體的對比成像。通常可通過使用對比成像劑改善MRI的清晰度。由于其順磁性性質，這些成像劑通過利用其不成對電子促進自旋移而縮短T1和T2張弛時間。這使得濃度依賴性對比度增加并因此增強了不同解剖結構之間的差異。
因為實體的順磁磁化率(由此其能夠縮短水分子附近的質子核的T1和T2張弛時間的能力)隨不成對電子數的增加而增加(F.A.Cotton等人，“Basic Inorganic Chemistry”，John Wiley&Sons，New York，1995，第68頁)，用于MRI的理想的順磁性金屬離子原則上應具有盡可能多的不成對電子。然而，這種順磁性金屬離子與水分子的復合體為高毒性的，因此不能用于體內成像(W.Kuhn，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1990，291-19)。通過將順磁性金屬離子復合于配體或金屬螯合部分并只留下一個配位點對水分子開放，認為已經有力地降低了毒性。因此，大多數的MRI對比成像劑典型地包括螯合形式的順磁性金屬離子。
因此，在本發明的某些實施方案中，優選將MRI對比成像劑設計為使得成像部分包括與順磁性金屬離子復合的至少一個金屬螯合部分。
用于本發明的適當的順磁性金屬離子包括已知為生理學可接受的、在MRI中是良好的對比增強劑、并容易地結合到金屬螯合部分中的任何順磁性金屬離子。優選地，順磁性金屬離子選擇釓III(Gd3+)、鉻III(Cr3+)、鏑III(Dy3+)、鐵III(Fe3+)、錳II(Mn2+)、和鐿III(Yb3+)。更優選地，順磁性金屬離子為釓III(Gd3+)。釓為FDA批準用于MRI的對比劑，其在異常組織中積聚，使這些異常區域在MRI上變得非常明亮(得到增強)。已知釓在身體不同區域特別是在腦中正常組織和異常組織之間提供大的對比度。
用于本發明的適當的金屬螯合部分包括在本領域中已知與可由MRI檢測到的順磁性金屬離子復合的任何實體。優選地，金屬螯合部分是穩定的、無毒性實體，其以高親合性結合順磁性金屬離子，留下一個配位點對水分子開放，并且一旦復合，這種高的親合性使得順磁性金屬離子不能被水置換。
已經使用多種這種金屬螯合部分用于Gd3+的復合。這些包括DTPA(圖2G)；1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N，N′，N″，N_-四乙酸(DOTA，其化學結構在圖3A中)；及其衍生物(參見例如美國專利4,885,363、5,087,440、5,155,215、5,188,816、5,219,553、5,262,532、和5,358,704、和D.Meyer等人的Invest.Radiol.，1990，25S53-55)。然而，這些配體的釓復合體在生理條件下是鹽，并且對非順磁性陽離子抗衡離子的需要增加了溶液的重量克分子滲透壓濃度。已經使用DTPA-雙(酰胺)衍生物制備了保持高水溶性和松弛性(relaxativity)的中性的釓復合體(美國專利4,687,659)。
復合順磁性金屬離子的其它金屬螯合部分包括非環形的實體，如氨基多羧酸及其磷含氧酸類似物(如三亞乙基四胺六乙酸或TTHA，其化學結構在圖3B中；和二磷酸二吡哆醛，DPDP在圖3C中)；和大環的實體(如1，4，7，10-四氮雜環十二烷-N，N′，N″-三乙酸或DO3A，其化學結構在圖3D中)。金屬螯合部分也可是美國專利5,410,043、5,277,895、和6,150,376、或F.H.Arnold的Biotechnol.，1991，9151-156中所述的任何實體。
在實施例2中描述了通過在本發明的治療雙官能分子中嵌入Gd3+開發的一類新的MRI對比成像劑的合成。本發明的MRI成像劑的性質和應用分別在實施例7和8中報導。
MRS成像部分在某些實施方案中，本發明的對比成像劑設計為用于磁共振光譜分析(MRS)中。更具體地，本發明還提供了對比成像劑，其包括與至少一個由穩定的順磁性同位素標記的淀粉樣物質結合部分連接的至少一個金屬螯合部分。優選的穩定的順磁性同位素是碳-13(13C)和氟-19(19F)。
放射性成像部分在其它優選實施方案中，本發明的對比成像劑設計為用于可通過單光子發射計算機斷層成像(SPECT)或正電子發射層析成像(PET)檢測到。
SPECT和PET為已經用于檢測腫瘤、動脈瘤(血管壁中的淺色斑)、不規則的或不充分的到各種組織的血液流動、血細胞病癥、和器官如甲狀腺功能不足和肺機能不足的核醫學成像技術。兩種技術都獲得被引入生物樣品或患者身體中的放射性核素的濃度的信息。PET通過檢測短壽命的放射性物質射出的輻射產生圖像，所述短壽命的放射性物質通過用中子轟擊非放射性化學品以造成放射性同位素而形成。PET檢測其中放射性物質與組織中的電子碰撞射出正電子的位置處放出的γ射線。PET分析產生在感興趣部位的身體的一系列薄片圖像(如腦、胸、肝)。這些薄片圖像可裝配成體現被檢組織的三維圖像。然而，只有少數的PET中心，因為它們必須位于產生用于該技術的短壽命放射性同位素所需的粒子加速器裝置附近。SPECT類似于PET，但是用于SPECT的放射性物質(如99mTC、123I、133Xe)具有比用于PET的那些更長的衰變時間，并且其發射的不是雙γ射線而是單γ射線。雖然SPECT圖像表現出比PET圖像更差的靈敏度和較少的細節，但SPECT技術表比PET具有幾個優點其不需要位于粒子加速器附近，并且比PET便宜得多。
因此，在某些優選實施方案中，本發明的對比成像劑設計為可通過單光子發射計算機斷層成像(SPECT)檢測到。優選地，對比成像劑中的成像部分包括至少一個復合于可通過SPECT檢測到的金屬實體的金屬螯合部分。
用于本發明的適當的金屬實體是本領域中已知為生理學可接受的、可通過SPECT檢測到的、并且容易被結合到金屬螯合部分中的放射性核素。優選地，放射性核素選自锝-99m(99mTc)、鎵-67(67Ga)、釔-91(91Y)、銦-111(111In)、錸-186(186Re)、和鉈-201(201Tl)。最優選地，放射性核素為锝-99m(99mTc)。在目前進行的常規核醫學過程中，超過85％使用基于99mTc的方法。
用于本發明的適當的金屬螯合部分包括已知復合于可通過SPECT檢測到的短壽命放射性核素的任何實體。優選地，金屬螯合部分是以高親合性結合可由SPECT檢測到的放射性核素的穩定的、無毒性實體。
復合放射性核素如99mTc的金屬螯合部分在本領域中是公知的(參見例如“Technetium and Rhenium in Chemistry and Nuclear Medicine”，M.Nicolini等人，編著，1995，SGEditorialiPadova，Italy)。適當的金屬螯合部分包括例如N2S2和N3S螯合劑(A.R.Fritzberg等人，J.Nucl.Med.，1982，23592-598，其可以分別通過兩個氮原子和兩個硫原子、或通過三個氮原子和一個硫原子復合于放射性核素。半胱氨酸乙酯二聚物(ECD，其化學結構在圖3C中)為本領域中公知的N2S2螯合劑。N2S2和N3S螯合劑在例如美國專利4,444,690、4,670,545、4,673,562、4,897,255、4,965,392、4,980,147、4,988,496、5,021,556和5,075,099中描述。
其它適當的金屬螯合部分可選自多磷酸鹽(如亞乙基二氨基四亞甲基四亞磷酸，EDTMP，其化學結構在圖3D中)；氨基羧酸(如EDTA、N-(2-羥基)乙二胺-三乙酸、次氮基三乙酸、N，N-二(2-羥乙基)甘氨酸、亞乙基雙(羥基苯基甘氨酸)和二亞乙基三胺五乙酸；1，3-二酮(如乙酰丙酮、三氟乙酰丙酮、和噻吩甲酰三氟丙酮)；羥基羧酸(如酒石酸、檸檬酸、葡糖酸、和5-磺酰基水楊酸；多胺(如乙二胺、二亞乙基三胺、三亞乙基四胺、和三氨乙基胺)；氨基醇(如三乙醇胺、和N-(2-羥乙基)乙二胺)；芳香族雜環堿(如2，2′-二咪唑、甲基吡啶胺、二甲基吡啶胺和1，10-菲咯啉)；酚(如水楊醛、二磺酰基鄰苯二酚、和變色酸)；氨基酚(如8-羥基喹啉和肟磺酸(oximesulfonic acid))；肟(如六甲基亞丙基胺肟，HMPAO，在圖3E中)；席夫堿(如二水楊醛-1，2-亞丙基二亞胺)；四吡咯(如四苯基卟吩和酞菁)；硫化合物(如甲苯二硫醇、內消旋-2，3-二巰基丁二酸、二巰基丙醇、巰基乙酸、乙基黃原酸鉀、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、雙硫腙、二硫代磷酸二乙酯、和硫脲)；合成的大環化合物(如二苯并[18]冠醚-6)，或兩種或多種上述試劑的組合。
優選的金屬螯合部分選自多羧酸如EDTA、DTPA、DOTA、DO3A；及其衍生物、同系物、和類似物；或其組合。
其它適當的金屬螯合部分在美國專利5,559,214和WO 95/26754、WO 94/09056、WO 94/29333、WO 94/08624、WO 94/08629、WO94/13327、和WO 94/12216中描述。
優選地，金屬螯合部分含有至少一個可用于(或容易地化學轉化成可用的不同官能團)使金屬螯合部分共價連接于淀粉樣物質結合部分的官能團。適當的官能團包括但不限于胺(優選伯胺)、硫醇、羧基等等。
對比成像劑的合成上述制備本發明的雙官能分子分的方法可用于合成對比成像劑。
可通過本領域中已知的任何方法制備包括至少一個與金屬實體復合的金屬螯合部分的成像部分。可在金屬螯合部分和淀粉樣物質結合部分之間形成直接或間接的共價結合之前、過程中、或之后進行復合。優選地，使用本發明的雙官能分子作為初始物質進行復合(參見實施例2和3)。當金屬實體是短壽命放射性核素時，優選復合在使用對比成像劑之前不久進行。
適當的復合方法包括例如將金屬實體直接結合到金屬螯合部分中和金屬轉移作用。當可能時，優選直接結合。在該方法中，通常將金屬螯合部分的水溶液與金屬鹽接觸或混合。反應混合物的pH可為約4到約11。優選地，pH為5到9。更優選地，反應在pH為6到8下進行。直接結合的方法在本領域中是公知的，并且已經描述了不同的過程(參見例如WO 87/06229)。當需要在結合之前將金屬實體還原為不同的氧化狀態時使用金屬轉移作用。金屬轉移作用的方法在本領域是公知的。實施例3說明了這種反應，其中通過使用SnCl2將金屬離子還原為Tc(V)將99mTc結合到雙官能分子中。
本領域技術人員可以理解，對比成像劑可包括通過多種不同方式彼此連接的多個淀粉樣物質結合部分和多個成像部分。對比成像劑內的淀粉樣物質結合部分可完全相同或不同。類似地，對比成像劑內的成像部分可完全相同或不同。對比成像劑的設計將受其預定目的和在其所用的具體情況中所需的性質影響。
III.雙官能治療分子的應用本發明的另一方面涉及用于降低或抑制淀粉樣物質毒性的系統。因此，本發明提供了用于降低或抑制淀粉樣蛋白(和類淀粉樣蛋白)當以β-折疊構型聚集時對其環境產生的毒性能力的試劑和對策。本發明還提供了用于降低或抑制淀粉樣物質介導的對多種生物分子具有有害影響并可以誘導氧化應激的活性氧物質產生的試劑和對策。
更具體地，本發明提供了起到金屬螯合劑作用的靶向試劑和使用它們用于降低或抑制體外、體內和回體系統以及活著的患者中的淀粉樣物質毒性的方法。本文提供的方法包括使用本發明的雙官能分子，其通過有效地螯合過渡金屬離子并表現出對淀粉樣沉積物的高的親合性和特異性而顯示出雙重選擇性。
在某些優選實施方案中，本發明使得可通過預防、減慢、或終止淀粉樣物質在系統或患者中積聚，和/或通過促進、誘導、或幫助已經存在于系統或患者中的淀粉樣沉積物溶解而降低淀粉樣物質毒性。這可以在當雙官能分子中的金屬螯合部分以高親合性結合于至少一種過渡金屬離子時實現，所述過渡金屬離子選自鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)。
在其它優選實施方案中，本發明使得可通過減少、抑制、或干擾淀粉樣物質介導的活性氧物質的產生而降低或抑制淀粉樣物質毒性。這可以在當雙官能分子中的金屬螯合部分以高親合性結合于至少一個選自銅II(Cu2+)和鐵III(Fe3+)的氧化還原活性過渡金屬離子時實現。
本領域技術人員可以理解，涉及使用具有金屬螯合部分(其結合高親合性的Cu2+和/或Fe3+)的雙官能分子的方法可降低或抑制由聚集的淀粉樣蛋白產生的毒性和由活性氧物質生成(因為Cu2+和Fe3+是可以促進淀粉樣蛋白聚集的過渡金屬離子和可以在活性氧物質生成過程中涉及到的氧化還原活性生物金屬)所引起的毒性。
更具體地，本發明提供了降低或抑制系統中淀粉樣物質毒性的方法，其包括使系統與有效量的本發明的雙官能分子或其藥物組合物接觸。
接觸可以體外、體內、或回體方式進行。例如，可通過培養進行接觸。
系統可為任何已知能夠產生和/或含有淀粉樣沉積物的任何生物實體。例如，系統可為細胞、生物流體、生物組織、或動物。當系統為細胞、生物流體或生物組織時，其可來源于活著的患者(如其可以通過活組織檢查得到)或死亡的患者(如，其可以通過尸體解剖得到)。患者可以是人或其它哺乳動物。在優選實施方案中，細胞、生物流體、或生物組織來源于懷疑患有與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的患者。在其它優選實施方案中，細胞、生物流體、或生物組織來源于懷疑患有與β淀粉樣肽的積聚有關的病理生理學狀況的患者。在這種具體情況中，優選雙官能分子中的淀粉樣物質結合部分表現出對Aβ淀粉樣物質的高的親合性和特異性。
本發明還提供了用于預防或治療患者中與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的方法。本文所述的方法可用于(1)延遲或預防疾病的發作；或(2)減慢或終止疾病的進展、加重、或惡化；或(3)反轉或改善疾病的癥狀和癥候；或(4)治愈疾病。該治療可在疾病發作之前給予，用于預防或預防性作用；或在疾病開始之后給予，用于治療作用。
更具體地，本發明提供了治療患有與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的患者的方法，其包括對患者給予有效量的本發明的雙官能分子或其藥學組合物。
雙官能分子或其藥學組合物的給藥可通過本領域中已知的任何方法進行，例如通過口服和腸胃外給藥，包括靜脈內給藥、肌內和皮下注射給藥、和透皮給藥和腸給藥。
影響患者的病理生理學狀況可與任何淀粉樣蛋白或類淀粉樣蛋白的積聚有關，所述蛋白例如淀粉樣蛋白免疫球蛋白輕鏈(AL)；血清淀粉樣蛋白相關蛋白質(AA或SAP)；β淀粉樣肽(Aβ)；改變型運甲狀腺素蛋白(ATTR)；小島淀粉樣物質多肽(IAPP或Amylin)；朊病毒蛋白質(PrP)等等。聚集的淀粉樣蛋白或類淀粉樣蛋白的積聚可在身體的任何器官或組織中發生并在心、腦、胃腸系統、肝、脾、腎、胰腺、肺、關節、肌肉等中形成小纖維、纖絲、蛋白斑、和/或纏結。
病理生理學狀況可以是已知與淀粉樣病變有關的任何疾病和病癥。這些疾病和病癥包括但不限于II型糖尿病、進行性核上麻痹、某種類型的內分泌系統癌癥如甲狀腺骨髓癌、家族性淀粉樣病變(Finnish型)、家族性淀粉樣蛋白多發性神經病(Portuguese型)、家族性淀粉樣蛋白多發性神經病(Iowa型)、家族性淀粉樣蛋白心肌病(Danish型)、有蕁麻疹和耳聾的家族性淀粉樣蛋白腎病(Muckle-Wells′綜合癥)、遺傳性非神經性系統性淀粉樣變(Ostertag型)、遺傳性腎淀粉樣病變、與淀粉樣蛋白有關的骨髓癌或macroglobulinernia相關的原發癥、系統性老年性淀粉樣病變、何杰金氏病、郎格罕氏島、孤立型心房淀粉樣蛋白(isolated atrial amyloid)、和家族性地中海熱。
在某些優選實施方案中，本發明的方法涉及對優選在腦中與聚集和積聚的淀粉樣蛋白和類淀粉樣蛋白有關的病理生理學狀況的預防和治療。這些病理生理學狀況包括例如朊病毒疾病，其可以影響人(如Creutzfeld-Jakob病、Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合癥、FatalFamilial Insomnia、和庫魯病)以及其它哺乳動物(如牛的牛海綿狀腦病、羊的癢病、貂的可傳染的腦病、和黑尾鹿和麇鹿的慢性消耗性疾病)；有時在患有腦外傷的個體的腦中觀察到的淀粉樣病變；和神經退行性疾病如阿爾茨海默氏病、路易體癡呆、具有淀粉樣病變(荷蘭型和冰島型)的遺傳性腦出血、關島帕金森癡呆、和影響成年唐氏綜合癥患者的阿爾茨海默氏病形式。在這些情況中，選擇本發明的雙官能分子中的淀粉樣物質結合部分，以使其能夠跨越血腦屏障。
IV.檢測方法另一方面，本發明可進行與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的診斷。具體地，本發明可進行神經退行性疾病的非侵入性診斷的特征在于淀粉樣物質在患者腦中的聚集和積聚。因此，本發明提供了檢測淀粉樣沉積物存在的試劑和對策。更具體地，本發明提供了可通過成像技術檢測到的靶向試劑和可在體外、體內、和回體系統以及活著的患者中檢測、定位和定量淀粉樣沉積物的方法。本文提供的方法基于本發明的對比成像劑的使用，該對比成像劑包括與至少一個可通過成像技術檢測到的成像部分連接的至少一個對淀粉樣沉積物有高親合性和特異性的淀粉樣物質結合部分。或，本文提供的方法可涉及本發明的對比成像劑的使用，所述對比成像劑包括至少一個與至少一個由穩定的順磁性同位素標記的淀粉樣物質結合部分連接的金屬螯合部分。
更具體地，本發明提供了用于檢測系統中存在淀粉樣沉積物的方法，其包括使系統與成像有效量的本發明的對比成像劑或其藥學組合物接觸的步驟。優選在可使對比成像劑與系統中存在的淀粉樣沉積物相互作用、使得相互作用導致對比成像劑與淀粉樣沉積物結合的條件下進行接觸。然后使用成像技術檢測與系統中存在的淀粉樣沉積物相結合的對比成像劑，產生系統的至少一部分的一個或多個圖像。
接觸可以通過本領域中已知的任何適當的方法進行。例如，可以通過培養進行接觸。
系統可以是已知能夠產生和/或含有淀粉樣沉積物的任何生物實體，例如，系統可為細胞、生物流體、生物組織、或動物。當系統是細胞、生物流體、或生物組織時，其可來源于活著的患者(如，其可通過活組織檢查得到)或死亡的患者(如，其可通過尸體解剖得到)。患者可以是人或其它哺乳動物。
在優選實施方案中，細胞、生物流體或生物組織來源于懷疑患有與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的患者。例如，細胞、生物流體或生物組織可來源于懷疑患有與β淀粉樣肽的積聚有關的病理生理學狀況的患者。在這種具體情況中，根據對Aβ淀粉樣物質的高親合性和特異性選擇對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分。在其它優選實施方案中，細胞、生物流體、或生物組織與用于治療與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的潛在治療劑接觸(體外或回體)。
在本發明的一個方面中，上述方法用于識別潛在治療劑。例如，可在使細胞、生物流體或生物組織與用于治療與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的潛在治療劑接觸之前或之后形成細胞、生物流體或生物組織的至少一部分的圖像。對“之前”和“之后”的圖像的比較可測定試劑對系統中存在的淀粉樣沉積物的作用。本發明還包括通過這種方法鑒別的治療劑。
本發明還提供了用于檢測患者體內存在的淀粉樣沉積物的方法。該方法包括對患者給予成像有效量的本發明的靶向對比成像劑或其藥學組合物。優選給藥在可使對比成像劑(1)達到患者身體可能含有淀粉樣沉積物的區域和(2)與任何淀粉樣沉積物相互作用以使相互作用導致對比成像劑與淀粉樣沉積物結合的條件下進行。在給予對比成像劑之后并且在逝去的足夠時間內用于發生相互作用(例如在30分鐘到48小時之后)，使用成像技術檢測存在于患者中的結合于淀粉樣沉積物的對比成像劑，并且形成患者身體的至少一部分的一個或多個圖像。
在一個實施方案中，該方法用于定位患者中的淀粉樣沉積物。通過比較從懷疑患有與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的患者得到的結果與對得自臨床上健康個體的圖像，可以測定淀粉樣沉積物的存在和分布并且確診淀粉樣病變。例如，該方法可用于定位患者腦中的淀粉樣蛋白斑。在這種情況中，選擇對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分，使其能夠跨越血腦屏障。具體地。該方法可用于檢測和定位懷疑患有阿爾茨海默氏病的患者腦中的淀粉樣蛋白斑。在這種情況中，對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣物質具有高的親合性和特異性并且可透過血腦屏障。對于腦成像，測量結合的對比成像劑的量并與結合于患者小腦的對比成像劑的量相比(作為比值)。然后將該比值與年齡相當的臨床健康的患者腦中的同一比值比較。
對比成像劑或其藥學組合物的給藥可以通過本領域中已知的任何適當的方法進行，例如通過口服和腸胃外的方法給藥，包括靜脈內給藥、動脈內給藥、鞘內給藥、皮內給藥和腔內給藥、和腸方法。
在優選實施方案中，本文提供的用于檢測系統或患者中的淀粉樣沉積物存在的方法通過使用本發明的對比成像劑進行，其中使金屬螯合部分復合于上述的順磁性金屬離子。然后通過磁共振成像(MRI)和產生MR圖像進行淀粉樣沉積物的檢測。優選地，順磁性金屬離子為釓III(Gd3+)。
在其它優選實施方案中，檢測方法通過使用本發明的對比成像劑進行，其中使金屬螯合部分復合于上述放射性核素。然后通過單光子發射計算機斷層成像(SPECT)和產生SPECT圖像進行淀粉樣沉積物的檢測。優選地，放射性核素為锝-99m(99mTc)。
在其它優選實施方案中，檢測方法通過使用本發明的對比成像劑進行，其中用上述的穩定的順磁性同位素標記淀粉樣物質結合部分。然后通過磁共振光譜分析(MRS)和產生MR圖像進行淀粉樣沉積物的檢測。優選地，穩定的順磁性同位素是碳-13(13C)或氟-19(19F)。
提供用于檢測在患者或系統中淀粉樣沉積物存在的本發明的方法可用于診斷與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況。可通過對患者身體的部分或全身進行檢查和成像、或通過對得自患者的生物系統(如一個或多個生物流體或生物組織樣品)進行檢查和成像實現診斷。這種方法或其它方法、或兩種方法的組合可根據懷疑影響患者的臨床狀況的性質進行選擇。得自患者的結果與得自臨床健康個體研究的數據的比較將決定和證實診斷。
這些方法也可用于跟蹤與淀粉樣病變有關的病理生理學狀況的進展。例如，這可以通過在一段時間內重復該方法以建立患者中淀粉樣沉積物的存在、定位、分布、和定量的時間曲線而實現。
這些方法也可用于監測患者對與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的治療的應答。例如，在對患者進行治療之前或之后，產生包含淀粉樣沉積物的身體的一部分的圖像(或來源于患者并包含淀粉樣沉積物的細胞、生物流體、或生物組織的一部分的圖像)。“之前”和“之后”的成像的比較用于測定治療對淀粉樣沉積物的效果并從而監測患者對具體治療的應答。
可通過本文的方法診斷或跟蹤其進展的病理生理學狀況可以與上述列舉的任何淀粉樣蛋白或類淀粉樣蛋白的積聚有關。聚集的淀粉樣蛋白或類淀粉樣蛋白可以在身體的任何器官或組織中積聚并形成小纖維、纖絲、蛋白斑、和/或纏結。可通過本文提供的方法為器官如心、腦、胃腸系統、肝、脾、腎、胰腺、肺、關節、肌肉等進行檢查和成像。
可通過本文中提供的本發明的方法診斷或跟蹤其進展的病理生理學狀況可以是已知與淀粉樣病變有關的任何疾病和病癥。例如，本發明的方法可用于診斷的狀況如II型糖尿病、進行性核上麻痹、某種類型的內分泌系統癌癥如甲狀腺骨髓癌、家族性淀粉樣病變(Finnish型)、家族性淀粉樣蛋白多發性神經病(Portuguese型)、家族性淀粉樣蛋白多發性神經病(Iowa型)、家族性淀粉樣蛋白心肌病(Danish型)、有蕁麻疹和耳聾的家族性淀粉樣蛋白腎病(Muckle-Wells′綜合癥)、遺傳性非神經性系統性淀粉樣變(Ostertag型)、遺傳性腎淀粉樣病變、與淀粉樣蛋白有關的骨髓癌或macroglobulinernia相關的原發癥、系統性老年性淀粉樣病變、何杰金氏病、郎格罕氏島、孤立心房淀粉樣蛋白、和家族性地中海熱。
在某些優選實施方案中，本發明的方法涉及與特別在腦中聚集和積聚的淀粉樣蛋白和類淀粉樣蛋白有關的病理生理學狀況的診斷。這些病理生理學狀況包括例如朊病毒疾病，其可以影響人(如Creutzfeld-Jakob病、Gerstmann-Straussler-Scheinker綜合癥、Fatal FamilialInsomnia、和庫魯病)以及其它哺乳動物(如牛的牛海綿狀腦病、羊的癢病、貂的可傳染的腦病、和黑尾鹿和麋鹿的慢性消耗性疾病)；有時在患有腦外傷的個體腦中觀察到的淀粉樣病變；和神經退行性疾病如阿爾茨海默氏病、路易體癡呆、具有淀粉樣病變(荷蘭型和冰島型)的遺傳性腦出血、關島帕金森癡呆、和影響成年唐氏綜合癥患者的阿爾茨海默氏病形式。在這些情況中，選擇本發明的雙官能分子中的淀粉樣物質結合部分，以使其能夠跨越血腦屏障。
制劑、劑量和給藥雙官能治療分子本文描述的雙官能治療分子可本身直接給藥或以藥學組合物的形式給藥。因此，本發明提供包括有效量的至少一種雙官能分子或其生理學可耐受的鹽、和至少一種藥學可接受的載體的藥學組合物。具體的制劑取決于選擇的給藥途徑。雙官能治療分子或其藥學組合物可通過本領域中已知的任何適當的方法給藥。適當的途徑的例子包括口服和腸胃外給藥，包括靜脈內給藥、肌內給藥、腹膜內給藥、和皮下注射、經皮給藥和腸給藥、等等。
可通過將本發明的雙官能分子與一種或多種藥學可接受的載體或稀釋劑合并得到用于口服用藥學組合物。這種載體的應用可使本發明的雙官能分子配制成例如片劑、膠囊劑、丸劑、糖衣劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、淤漿劑(slurries)、和懸浮劑。用于口服用藥學可接受的載體和稀釋劑是本領域已知的(參見例如Remington′s PharmaceuticalSciences，1990)，期望包括任何和所有的溶劑、分散介質、抗菌藥和抗真菌藥、等滲劑和吸收延遲劑等等。這種藥學組合物應包含至少1重量％的活性化合物。可改變組合物的百分比，其可方便地為每單位約5重量％到約80重量％。可用于治療應用的組合物中的活性化合物的量是將獲得適當劑量的量。本發明的優選組合物制備為包含約0.5μg到2000mg活性化合物的口服劑量單元形式。
口服制劑可選擇性地包含其它常規的、無毒的組分，如填料和粘合劑(例如，糖，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇、和山梨糖醇；和纖維素制劑如淀粉、凝膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、和聚乙烯吡咯烷酮)；賦形劑(例如磷酸二鈣)；崩解劑(如交聯的聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂、藻酸、和海藻酸鈉)；潤滑劑(如硬脂酸鎂)；和調味劑(如胡椒薄荷、冬青油、和櫻桃香料)。當制劑形成膠囊時，其可包含除上述之外的液體或半液體介質(如脂肪油、液體石蠟、和液體聚乙二醇)。可存在多種其它物質作為包衣或用于改變劑量單元的外形。例如，片劑、丸劑、或膠囊劑可由蟲膠、糖、或兩者一起包衣。糖漿或酏劑可包含活性化合物、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料、和香料如櫻桃或橙口味的香料。用于制備口服用藥學組合物的任何物質都應是藥學純的并在使用量下是基本上無毒的。
也可將本發明的雙官能分子配制為用于注射的腸胃外給藥(如通過彈丸注射或連續輸注)，并且作為單位劑型存在(如在安瓿中或多劑量容器中存在)。用于注射的劑量單元形式對于容易給藥和劑量的均勻性特別有利。本文中使用的術語“劑量單元形式”是指適合作為待治療患者使用的單一劑量的物理離散形式單元。每個單元包含計劃產生期望的治療效果的預定量的活性物質。劑量單元形式直接取決于活性化合物和期望的治療效果的特征。例如，單位劑型包含0.5μg到約2000mg的主要活性化合物。或可以給藥200ng/kg體重到超過10mg/kg體重的量。所述量可以是單個活性化合物的量或合并的活性化合物的總量。
腸胃外組合物可為活性雙官能分子的懸浮液、乳液、或水性和非水溶液，并且可選擇性地包含其它助劑，如助懸劑、穩定劑、和/或分散劑。親脂性的溶劑或媒介物(如脂肪油、合成脂肪酸酯、和脂質體)可用于制備懸浮液和乳液。可通過加入另外的物質如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、和右旋糖酐增加水性腸胃外制劑的粘度。
或者，可將本發明的雙官能分子配制為可控制釋放活性成分。控制釋放組合物在本領域中是已知的(參見例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，1990)，并且其可以是微膠囊、栓劑、或depot劑型。可通過將活性分子結合或截留在聚合物材料(諸如例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯基吡咯烷酮、水凝膠、聚乳酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羥甲基纖維素、和羧甲基纖維素)的粒子中、或膠質的藥物遞送系統(諸如例如脂質體、微球、微或大乳液、納米粒子、和納米膠囊)中得到這些藥學組合物。Depot制劑可通過植入或經皮遞送、肌肉注射、或通過使用經皮貼膏給藥(參見例如美國專利4,708,716和5,372,579中所述的裝置)。
本發明的雙官能治療分子或其藥學組合物可單獨給藥或與本發明的其它試劑組合、和/或與其它治療劑組合，其性質部分地取決于要治療的疾病狀況。例如，在阿爾茨海默氏病的情況中，本發明的雙官能分子可與FDA批準的治療劑如多奈哌齊(Aricept_)、他克林(Cognex_)、rivastigmine(Exelone_)、和velnacrine(Mentane_)組合給藥，所述治療劑是起到認知增強劑作用并且已知為一些AD患者提供輕微緩解的乙酰膽堿酯酶抑制劑。確定適合于治療具體病癥的化合物的組合的能力在從業醫生的能力范圍內。
可治療性地給予本發明的雙官能分子或其藥學組合物以治療與淀粉樣物質積聚有關的多種病理生理學狀況，(即在疾病發病之后)或事先預防這些病理生理學狀況。
本發明的雙官能分子或其藥學組合物的給藥應劑量應是遞送對于其預定目的有效的劑量。給藥途徑、制劑和劑量取決于患者的年齡、性別、體重和健康狀況；要治療的具體的病理生理學狀況(系統的或局部的、原發性或繼發性淀粉樣病變)；疾病程度；雙官能治療分子的效力、生物利用度、體內半衰期和副作用的嚴重程度。這些因素可在治療過程中容易地測定。選擇性地或另外地，給藥劑量可以由使用用于治療的具體狀況的動物模型研究測定，和/或從已知表現出類似藥理學活性的化合物的動物或人的數據決定。對于每種治療需要的總劑量可通過多次劑量或單次劑量給藥。基于這些或其它方法調節劑量以實現最大效力是本領域已知的，并且在從業醫生的能力范圍內。
患有與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的適當的患者可通過實驗室試驗和病史鑒別。具體地，可通過本文所述的涉及應用靶向對比成像劑和成像技術的本發明的方法測定淀粉樣沉積物的存在、定位、分布、和定量。
靶向對比成像劑本發明還提供包括靶向對比成像劑的藥學組合物。更具體地，本發明的藥學組合物包括成像有效量的至少一種上述對比成像劑或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。在某些優選的藥學組合物中，對比成像劑的成像部分包括至少一個與順磁性金屬離子或放射性核素復合的金屬螯合部分。優選地，順磁性金屬離子為釓III(Gd3+)；放射性核素為锝-99m(99mTc)。在其它優選實施方案中，對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分被穩定的順磁性同位素標記。優選地，穩定的順磁性同位素是碳-13(13C)或氟-19(19F)。
可通過本領域中已知的任何適當方法進行對比成像劑或其藥學組合物的給藥，如在Remington′s Pharmaceutical Sciences中所述的那些。根據懷疑影響患者的淀粉樣病變的具體類型和待檢身體位置，可將對比成像劑局部地或系統地給藥，口服遞送(作為固體、溶液、或懸浮液)或通過注射(例如靜脈內、動脈內、鞘內(即通過脊髓液)、皮內、或腔內)遞送。
對于口服，可在上述雙官能治療分子的情況中所述配制本發明的對比成像劑。
對于注射給藥，可將對比成像劑的藥學組合物配制為無菌水溶液或非水溶液、或作為用于臨時制備無菌的可注射溶液的無菌粉末。這種藥學組合物在生產和儲存條件下應是穩定的，并且必須在避免微生物如細菌和真菌的污染作用下保存。
藥學可接受的載體是溶劑或分散介質，如水溶液(如Hank′s溶液、醇/水溶液、或鹽水溶液)、和非水載體(如丙二醇、聚乙二醇、植物油、和可注射的有機酯如油酸乙酯)。可注射的藥學組合物也可包含腸胃外介質(如氯化鈉和Ringer′s葡萄糖)、和/或靜脈內介質(如流體和營養補充劑)；以及其它常規的、藥學可接受的、無毒的賦形劑和添加劑，包括鹽、緩沖劑、和防腐劑如抗菌藥和抗真菌藥(如parabens、氯代丁醇、酚、山梨酸、thirmerosal等等)。可通過加入可以延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和凝膠)引起可注射組合物的吸收延長。不同組分的pH和濃度可由本領域技術人員容易地測定。
無菌的可注射溶液通過將活性化合物引入到具有上列多種其它組分的需要量的適當溶劑中，然后通過例如過濾或輻照滅菌制備。在用于制備無菌的可注射溶液的無菌粉末的情況中，優選的制備方法為真空干燥和凍干技術。
通常，可檢測到的對比成像劑的劑量根據以下考慮因素的改變而改變，如患者的年齡、性別、和體重，以及懷疑影響患者的具體病理生理學狀況、疾病程度和待檢身體區域。還要考慮的因素如禁忌癥、伴隨治療和其它變量，以調整待給藥的可檢測對比成像劑的劑量。然而，這可以通過從業醫生容易地實現。
通常，本發明的藥學組合物的適當的日劑量相當于足夠檢測患者體內存在的所有淀粉樣沉積物的對比成像劑的最低量。為了使該劑量最小化，優選給藥為靜脈內、肌內、腹膜內、或皮下，并且優選鄰近待檢部位。例如，靜脈內給藥適合于尿路成像、脊柱內給藥更適合于腦和中樞神經系統的成像；而未進食患者的口服適合于胃腸道成像。
優選本發明的放射性對比成像劑以0.1到約10m居里/kg體重每天的范圍給藥。優選本發明的順磁性對比成像劑以每天0.02到1.3毫摩爾/kg體重的范圍給藥。
實施例以下實施例描述完成和實踐本發明的某些優選方式。然而，應該理解，這些實施例只是用于說明性的目的，并不限制本發明的范圍。
實施例1一類與淀粉樣物質結合的金屬螯合劑的合成已經設計了一類新的雙官能分子并正在開發。新的雙官能分子包括直接共價連接于兩個相同的淀粉樣物質結合部分的一個金屬螯合部分。該類所有的雙官能分子共有的金屬螯合部分是本領域中公知的金屬螯合劑二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)。如圖4A所示，該類的母體分子的淀粉樣物質結合部分為硫代黃素衍生物，其屬于經報導為在嚙齒動物中可透過血腦屏障并表現出對Aβ淀粉樣物質具有高親合性(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，691471-1484)的硫代黃素類似物類。
該類的其它成員為其中苯并噻唑部分的芳環被一個或多個官能團取代的母體雙官能分子的類似物，所述官能團包括例如4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰氧基(sulfonoxyl)、5-溴、4-，5-或6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-，5-或6-甲磺酰基、和4-，5-或6-羥基(參見圖4B)。
用于以下報告的合成中的所有試劑和溶劑得自AldrichChemical(St.Louis，MO)、Acros Organics(Pittsburg，PA)、或LancasterSynthesis Inc.(Windham，NH)，為可能得到的最高純度級別，其不經純化直接使用。
在本文中描述了該類母體雙官能分子(化合物XH1)的合成。如以下圖解所示，XH1的制備涉及在金屬螯合部分與淀粉樣物質結合部分之間形成酰胺鍵。該反應根據以前發表的合成方法而改編的方法進行(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，691471-1484；D.Shi等人，J.Med.Chem.，1996，393375-3384‘和M.S.Konings等人，Inorg.Chem.，1990，291488-1491)。
步驟(a)的合成得到硫代黃素類似物，2-(4′-氨基苯基)苯并噻唑(化合物III)，其通過4-硝基苯甲酰氯(化合物II)和2-氨基苯硫酚(化合物I)之間直接偶聯的產物的還原制備。在步驟(b)的合成中，DTPA-雙(酸酐)(化合物IV)與過量的硫代黃素類似物反應形成所需的化合物XH1。
更具體地，在室溫下攪拌無水苯(200mL)中的化合物I(10g，80mmol)和化合物II(15g，80mmol)16小時。然后用乙酸乙酯萃取，蒸發溶劑并通過急驟層析純化殘余物(己烷∶乙酸乙酯85∶15，v∶v)，得到15g(73％)的2-(4′-硝基苯基)-苯并噻唑，為淺黃色固體。然后在氮氣下將乙醇中該中間體(10g，40mmol)和氯化錫(II)二水合物(20g，90mmol)的混合物回流4小時。通過蒸發除去乙醇，并將殘余物溶解于乙酸乙酯(200mL)中。用1M NaOH(3×200mL)和水(3×200mL)洗得到的溶液。蒸發溶劑，得到10g(97％)的2-(4′-氨基苯基)-苯并噻唑。
然后在30分鐘內將DTPA-雙(酸酐)(2.5g，7.0mmol)分批加入到冰冷卻的化合物III(8.85g，7.8mmol)的乙醇溶液中。加入水(150mL)之后，再在環境溫度下攪拌得到的反應混合物12小時。通過減壓濃縮反應混合物并加入水(500mL)，得到的溶液用HCl調節到pH 2.5，以誘導形成晶體。在收集之后，晶體從乙醇重結晶，得到純的XH1(收率71％)。
通過LC/MS和1H-NMR表征得到的母體雙官能分子。使用在250MHz下操作的Bruker AVANT儀器記錄質子-NMR光譜。化學位移單位為ppm，使用DMSO作為參考。通過M-Scan Inc.(West Chester，PA)通過FAB-MS進行反相LC/MS分析。在SymmetryTMC18，3.5μM，2.1×50mm的柱(Waters Corporation，Milord，MA)上進行LC-MS色譜法，流速為1mL/min，以10分鐘、梯度為15-85％乙腈/水，并且具有0.1％恒定濃度的甲酸。XH1的質譜和1H-NMR光譜在圖5中。
上述合成路線可用于和適合于制備該類的其它雙官能分子。
實施例2一類MRI對比成像劑的合成可從實施例1中描述的雙官能分子制備可通過磁共振成像(MRI)檢測到的對比成像劑。如在以下母體化合物的情況中所示，MRI對比成像劑Gd-XH1的合成涉及將釓III(Gd3+)嵌入到XH1中。該反應根據以前報導的方法進行(M.S.Konings等人，Inorg.Chem.，1990，291488-1491)。
更具體地，將水(30mL)中的XH1(12.1g，25.0mmol)和氧化釓Gd2O3(4.53g，12.4mmol)的混合物回流5小時。通過用1M NaOH調節溶液的pH到6.5，定量形成釓復合體的無色晶體。
實施例3一類SPECT對比成像劑的合成類似地，可從實施例1中描述的雙官能分子制備可通過單光子發射計算機斷層成像(SPECT)檢測到的對比成像劑。在以下所示母體雙官能分子的情況中，通過使用美國專利4,434,151中所述的在pH 6.5條件下的亞錫還原方法嵌入锝-99m進行反應。反應定量地得到锝復合體，即化合物99mTc-XH1。
更具體地，將XH1(8.25g，0.17mmol)溶解于1.0mL的乙醇和pH為5.5的1.0M乙酸鈉中，并向反應混合物中加入99mTcO4-(5-50mCi)在鹽水中的1.0mL發生劑洗提液。通過使每毫升乙醇溶解2.0mgSnCl2·H2O得到的0.2mL的亞錫溶液的加入產生锝復合體、15-30分鐘之后，可通過電泳測定標記效率。
實施例4用于試驗雙官能分子生物活性的無細胞試驗在下文中，描述可用于檢測本發明的雙官能分子的生物活性的多種無細胞試驗。更具體地，第一系列的試驗用于評價感興趣的雙官能分子降低、抑制、或干擾氧化還原活性過渡金屬離子與β淀粉樣肽結合從而導致Aβ聚集的能力。第二系列的試驗用于評價感興趣的雙官能分子抑制淀粉樣物質介導的氧化還原活性過渡金屬離子的還原的能力。第三系列的試驗用于評價本發明的雙官能分子對金屬介導的和淀粉樣物質介導的活性氧物質的產生的抑制作用，活性氧物質如H2O2、O2·-、和·OH。本節中描述的最后的試驗用于評價雙官能分子溶解金屬誘導的Aβ聚集物的能力。
對金屬-β淀粉樣肽結合的抑制已知氧化還原活性過渡金屬離子與淀粉樣蛋白的結合(1)促進蛋白質的聚集和積聚、(2)還原過渡金屬離子、和(3)產生活性氧物質如過氧化氫(H2O2)、超氧化物自由基陰離子(O2·-)和羥基自由基(·OH)。在本發明的雙官能分子的存在下，這三個過程的效率應至少被降低，最好被完全抑制。以下的無細胞試驗可通過評價它們對這三種次發過程的作用來評價本發明的雙官能分子對氧化還原活性過渡金屬離子與淀粉樣蛋白β肽結合的效果。
(a)Aβ肽的合成通過固相Fmoc化學在W.M.Keck Foundation BiotechnologyResource Laboratory(Yale University，New Haven，CT)；Glabe Laboratory(University of California，Irvine，CA)；或Multhaup Laboratory(Universityof Heidelberg，Germany)合成人Aβ肽(Aβ1-40和Aβ1-42)，或直接購自U.S.Peptide，Inc.(Rancho Cucamonga，CA)；或Aldrich-Sigma(St.Louis，MO)。合成物通過反相HPLC純化、氨基酸排序、和質譜學證實。將合成的Aβ肽溶解于三氟乙醇(30％的Milli-Q水(MilliporeCorporation，Milord，MA)溶液)或20mM HEPES(pH 8.5)中，為0.5-1.0g/mL的濃度，在10,000xg下離心20分鐘，并將上層清液(Aβ備用液)用于實驗當天的隨后分析。
通過214nm的紫外光譜學或通過Micro BCA蛋白質分析(Pierce，Rockford，IL)測定Aβ備用液的濃度。通過向140μL的蒸餾水加入10μL的Aβ備用液(或牛血清清蛋白(BSA)標準液)、然后向96孔板中加入等量的Micro BCA Protein Assay Reagent(150μL)并測量562nm的吸光度進行Micro BCA分析。使用BSA標準曲線測定Aβ的濃度。在使用之前，所有的緩沖液和金屬離子(如氯化物鹽)的備用液通過0.22μm過濾器(Gelan Sciences，Ann Arbor，MI)過濾，以除去任何粒狀物質。
可使用兩種不同的方法研究XH1對Zn2+誘導的Aβ聚集的反轉性濁度和免疫過濾。
(b)通過濁度測量的對金屬誘導的聚集的抑制如前所述(X.Huang等人，J.Biol.Chem.，1997，27226464-26470)進行濁度測定。在有或沒有25μM化合物XH1(母體雙官能分子)的存在下將Aβ1-40(10μM)與Zn2+(25μM)在67mM磷酸鹽緩沖液、150mM NaCI(pH7.4)中共同培養1小時，并以1分鐘為間隔進行濁度測定。隨后，將20μL等分試樣量的10mM待測雙官能分子或10mMZn2+加入到混合物中，在2分鐘之后，以1分鐘間隔再取得4個讀數。在最終加入雙官能分子并讀取濁度之后，再在讀取最后一個讀數之前將混合物培養30分鐘。為了對照，使用二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)代替化合物XH1進行同樣的實驗(DTPA是公知的金屬螯合劑也是包含在XH1中的金屬螯合部分)。
圖8中所示的這些試驗的結果表明，DTPA和本發明的母體雙官能分子都顯著地降低溶液中Zn2+誘導的Aβ1-40的聚集，觀察到DTPA有最強的效果。
(c)通過免疫過濾測量的對金屬誘導的Aβ聚集的抑制在用于評價本發明的雙官能分子對金屬誘導的Aβ聚集的效果的第二種方法中，將生理學濃度的Aβ(8nM)加入到包含150mM NaCI、20mM HEPES(pH7.4)、100nM BSA、并具有ZnCl2(0、0.1、0.2、0.5和2M)的混合物中，并在有或沒有待測雙官能分子(1-5μM)的存在下培養(30分鐘，37℃)，然后將反應混合物(200μL)置于96孔Easy-TiterELISA系統(Pierce，Rockford，IL)中并通過0.22μm醋酸纖維素過濾器(MSI，Westboro，MA)過濾。將聚集的粒子固定在膜上(0.1％戊二醛，15分鐘)，充分洗滌，然后用抗-Aβ單克隆抗體6E10(Senetek，MarylandLeights，MI)探測。洗滌印跡并在ECL化學發光試劑(AmershamBiosciences Corp.，Piscataway，NJ)的存在下暴露于膜。然后通過從免疫印跡的ECL膜的透光度定量分析免疫反應性。
對淀粉樣物質介導的氧化還原活性過渡金屬離子的還原的抑制可根據對已有方案(J.W.Landers等人，Amer.Clin.Path.，1958，29590-592)的改進使用96孔微量滴定板(Corning Costar，Acton，MA)進行金屬還原試驗。在有或沒有本發明的待測待測雙官能分子(200μM)的存在下在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，pH為7.4，中將Aβ肽(10μM)或維生素C(100μM)、金屬離子(10μM，Fe(NO3)3或Cu(NO3)2))和被還原的金屬離子指示劑(紅菲繞啉二磺酸，BP，用于Fe2+，200μM，Aldrich-Sigma，或浴銅靈二磺酸，BC，用于Cu+，200μM，Aldrich-Sigma)在37℃共同培養1小時。通過將購自the National Institute of Standardsand Technology(NIST)的金屬離子的含水備用液直接在緩沖液中稀釋制備金屬離子溶液。然后使用96孔板閱讀器(SPECTRAmax 250，Molecular Devices，CA)分別在536nm(Fe2+-BP復合體)和483nm(Cu+-BC復合體)下測量吸光度。還測量了對照樣品的吸光度，以評價光散射作用并測定在這些波長下的背景緩沖液信號。通過在有各自的指示劑和雙官能分子存在的肽和金屬產生的吸光度中減去這些對照吸光度得到536nm或483nm的凈吸光度(ΔA)。
根據式[Fe2+]或[Cu+]＝(ΔAx106)/(εxι)，其中ι為儀器的說明書手冊中所述的300μL容積孔的測量后的相同垂直長度(Fe2+為0.856cm，Cu+為1.049cm)，ε是已知的復合體的摩爾吸光度，即Fe2+-BP為7124M-1cm-1，Cu+-BC為2762M-1cm-1。
對金屬介導的和淀粉樣物質介導的活性氧物質產生的抑制H2O2試驗可根據從現有方案(J.C.Han等人，Anal.Biochem.，1996，234107-109；和J.C.Han等人，Biochem.，1994，2205-10)改編的方法在UV透明的96孔微量滴定板(Molecular Devices，CA)中進行H2O2分析。在有或沒有本發明的待測雙官能分子(1-5μM)的存在下、在PBS緩沖液(300mL，pH 7.4)中將Aβ肽(Aβ1-40或Aβ1-42；10μM)或維生素C(10μM)、Fe3+或Cu2+(1μM)，和H2O2截留劑(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP，Pierce，50μM)在37℃共同培養1小時。在相同條件下，用過氧化氫酶(Aldrich-Sigma，100U/mL)代替肽，用作表示沒有H2O2的對照信號。在培養之后，通過5，5-二硫-雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Aldrich-Sigma)檢測未反應的TCEP，其產生2摩爾的顯色產物2-(硝基-5-硫代苯甲酸)(NTB)。該反應如下
然后殘留的TCEP與DTNB反應
根據下式定量H2O2的產生量H2O2(μM)＝(ΔA*×106)/(2×ι×ε)，其中ΔA*為在412nm下的樣品和只有過氧化氫酶對照之間的絕對吸光度差；ι＝0.875cm，為得自板閱讀器制造商的說明書的相等垂直長度；ε為NTB的摩爾吸光度(在412nm下為14，150M-1cm-1)。TCEP為強還原劑，其可以主動與包含二硫鍵的多肽反應。然而，該反應不能在Aβ上發生，因為Aβ沒有這種化學鍵。
用于O2·-檢測的試驗可以通過在有或沒有本發明的待測雙官能分子(1-5μM)的存在下、在PBS(pH 7.4)中在37℃培養一小時之后測量(使用96孔板閱讀器)Aβ肽(Aβ1-42或Aβ1-40，10M，300μL每孔)的吸光度來評價O2·-的產生。相應的空白為單獨的PBS的信號。在該試驗中沒有得到通過肽產生的信號的絕對基線，因為酪氨酸的吸收峰(Aβ的殘基10)接近O2·-的吸收峰值(254nm)。然而，通過與過氧化物歧化酶(100U/mL)的共同培養引起的吸光度的降低幫助確定大部分吸光度信號是由于O2·-的存在。
用于檢測·OH的硫代巴比妥酸反應物質(TBARS)試驗在根據已有方案(J.M.Gutteridge等人，Biochim.Biophys.Acta，1983，75938-41)改造的96孔微量滴定板中進行與Fe3+或Cu2+的培養混合物的硫代巴比妥酸活性物質(TBARS)試驗。在有或沒有本發明的待測雙官能分子的存在下將β淀粉樣肽(Aβ1-42或Aβ1-40；10μM)或維生素C(100μM)與Fe3+或Cu2+(1μM)和脫氧核糖(7.5mM，Aldrich-Sigma)在PBS(pH7.4)中培養。在培養(37℃，1小時)之后，加入冰醋酸和2-硫代巴比妥酸(1％，w/v的0.05M NaOH中，Aldrich-Sigma)并加熱(100℃，10分鐘)。將最終的混合物置于冰上1-3分鐘，然后在532nm下測量吸光度。通過減去由除了維生素C或Aβ肽之外的相同化學組分構成的對照樣品的吸光度得到每個樣品的凈吸光度改變。
對金屬誘導的Aβ聚集物的再溶解作用為了評價本發明的雙官能分子再溶解金屬誘導的Aβ聚集物的能力，首先通過加入ZnCl2(25μM)或CuCl2(5μM)誘導Aβ(Aβ1-40或Aβ1-42；10ng/孔，在PBS中)聚集。然后通過過濾將聚集物轉移到0.22μm尼龍膜上。然后用單獨的PBS或包含2μM的本發明的待測雙官能分子的PBS或包含2μM的氯碘羥喹作為對照洗滌聚集物(200μL/孔)。將膜固定，用抗Aβ單克隆抗體6E10探測，并且通過暴露ECL-膜顯影。通過ECL膜的光密度分析測定相對信號強度，根據已知量的肽進行校正。各個值表示為在用單獨的PBS洗滌后保留在過濾器上的Aβ信號的百分比。
實施例5檢測雙官能分子的基于細胞的試驗雙官能分子的神經毒性(a)E17大鼠皮層原代神經元使用原代神經元培養物檢測母體雙官能分子XH1的神經毒性。如G.J.Brewer和C.W.Cotman(在Brain Res.，1989，49465-74)中所述，E17大鼠皮層原代神經元得自妊娠之后17天的無病原體的雌性Sprague-Dawley大鼠(購自Taconic Farms，MA)。使用的方案允許在精確定義的培養條件下以低密度長期培養神經元。該方案提供最大為90％的神經元培養物。最好使少數的膠質細胞與大鼠皮層原代神經元共同培養，因為這些細胞有助于神經元的存活。阿糖胞苷(1μM)用于控制培養物制備中膠質細胞的增長。使用神經元特異性的烯醇酶(和/或星形神經膠質特異性的S100β)免疫組織化學有規律地檢查神經元群。
使E17大鼠皮層原代神經元在95％O2、5％CO2、85％濕度條件下，在37℃下，在具有B-27添加劑(Life Technologies，Inc.)、20μM L-谷氨酸鹽、100單位/mL青霉素、0.1g/mL鏈霉素、和2mM L-谷氨酰胺的不含血清的NeurobasalTM介質中生長4天。在第5天(處理日)，將介質替換為不含血清的NeurobasalTM加上L-谷氨酰胺，沒有B-27添加劑。然后在XH1(0、1或10μM)的存在下培養細胞并在用XH1處理后48小時分析細胞存活率。使用購自Roche(Nutley，NJ)的試劑盒進行LDH釋放試驗和MTT試驗，以分別評價壞死細胞的死亡并測定細胞代謝活動。
這些分析的結果在圖9A中報告，是使用三組實驗得到的數據的平均值。結果表明，XH1在E17大鼠皮層原代神經元中的低的大分子濃度沒有誘導任何顯著的細胞死亡。
(b)人SH-SYSY成神經細胞瘤細胞還在人SH-SYSY成神經細胞瘤細胞上試驗了XH1的神經毒性。SH-SYSY細胞系通常用于研究神經生成、分化、和腫瘤形成(D.Vu等人，Brain Res.Mol.Brain Res.，2003，11593-103)。SH-SYSY細胞得自American Type Culture Collection并在補充有10％胎牛血清(Gibco-BRL)和抗生素的Dulbecco氏改進伊格爾培養基中生長。
在XH1(0、1、5或10μM)的存在下培養(95％O2，5％CO2，85％濕度，37℃)人SH-SYSY成神經細胞瘤細胞并在處理48小時后使用上述LDH釋放試驗評價細胞的存活率。在圖9B中報導的這些實驗的結果表明，XH1在人SH-SYSY成神經細胞瘤細胞的低的大分子的濃度沒有引起任何顯著的細胞死亡。
雙官能分子對金屬介導的APP蛋白表達的效果若干事實暗示在淀粉樣蛋白前體(APP)的水平增加與阿爾茨海默氏病發展之間有直接聯系。APP已經與AD有關，因為其通過蛋白酶剪切處理進入β-肽中，β-肽積聚成為淀粉樣蛋白斑，并且因為APP基因突變可以引起AD的早期發病。然而，即使在家族性AD突變的存在下，發現在轉基因小鼠中APP的過度表達是引起淀粉樣纖絲沉積和阿爾茨海默狀病理的發展的足夠Aβ肽所必需的。現在有若干報告支持翻譯的調節機制對控制APP合成和可能的Aβ肽分泌物在生物學相關的狀況中的重要作用(van Leeuwen等人，Science，1998，279242-247)。
可以通過進行不同的實驗評價XH1及其類似物降低或抑制APP合成和隨后發生的Aβ產生的能力。
(a)APP蛋白合成的測定在SH-SYSY人成神經細胞瘤細胞中，通過SDS-PAGE測量XH1抑制APP合成的能力。對照蛋白質(β-微管蛋白和/或兩種淀粉樣蛋白前體狀蛋白APLP1和APLP2)用于保證本發明的雙官能分子的靶向抑制特異性。
SDS-PAGE收獲SH-SYSY人成神經細胞瘤細胞并用冷的PBS洗三次，然后混合有蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche)的M-PERTM哺乳動物蛋白萃取試劑(Pierce)進行細胞溶解。將細胞溶解產物在冷藏室中以13,000rpm渦流15分鐘，并且BCA分析上層清液的總蛋白濃度。在具有相等的蛋白質負荷(15μg/孔)的預制的NuPAGETM4-12％Bis-TrisGel(Invitrogen)上進行蛋白質印跡。其在200V進行45分鐘并在75mA/凝膠轉運95分鐘。根據制造商的說明書通過原代和二代抗體探測印跡并最后以15分鐘間隔洗滌2-3小時。然后使用化學發光的試劑盒(Pierce)使印跡顯影。
這些實驗的結果在圖10中報告。如圖10中所示，XH1濃度增加使APP合成減少，而在同樣的條件下，對β-微管蛋白表達無作用。類似地，如圖10B所示，XH1的存在(最大為10μM的濃度)不影響APLP1或APLP2合成。這些數據證明XH1的靶向抑制特異性。
成神經細胞瘤細胞的代謝標記可以在每次處理之前將細胞以相同數目平皿接種到8微量滴定孔(96孔皿中每孔1×105細胞)之后測定原代成神經細胞瘤中的胞內APP蛋白合成。在XH1、DPTA的存在下處理細胞48小時，或未處理。計數隨機孔中的細胞，以保證在每個實驗開始時每個孔都存在1×105細胞。在不含甲硫氨酸的介質中預培養成神經細胞瘤細胞15分鐘并在不含甲硫氨酸的介質(RPMI1640，GIBCO)中用300μCi/mL[35S]-甲硫氨酸脈沖標記30分鐘。在用25mLSTEN緩沖液和無菌玻璃棒(STEN緩沖液是0.2％NP-40、2mM EDTA，50mM Tris，pH7.6)使成神經細胞瘤細胞溶解之前在冷的PBS(4℃)中洗滌每個微量滴定板兩次。向細胞溶解緩沖液中加入20mM PMSF、5mg/mL亮肽素以防止蛋白質水解。將每個孔的緩沖液合并為300uL的總體積。使用對抗APP的羧基末端產生的抗血清(對抗APP-695的676-695氨基酸殘基產生的C-8抗體的1∶500稀釋物)使每種合并的溶解液的一半免疫沉積。每種溶解液的殘余部分用人鐵蛋白抗血清(1∶500稀釋物，Boehringer)免疫沉積。
在所有的標記實驗中，通過將抗體標記的抗原復合體結合于A蛋sepharoseTM小珠收集免疫沉積的蛋白質。將免疫沉積的樣品施用于10-20％的Tris-Tricine凝膠(Novex)并且根據生產商的說明書使樣品在Tris-Tricine緩沖液中電泳。用25％甲醇、7％(v/v)甲醇使凝膠固定1小時，用熒光試劑(Amplify，Amersham)處理30分鐘，干燥，并在-80℃暴露于X-omat Kodak膠片下過夜。
(b)APP mRNA水平的測定為了比較，通過實時RT-PCR測量APP的mRNA水平評價XH1影響APP生成的能力。
(c)胞內和分泌的Aβ1-40和Aβ1-42濃度的測定使用市售的用于Aβ40/42水平的ELISA試劑盒(BioSourceInternational)測定在用XH1處理SH-SYSY細胞后的胞內和分泌的Aβ1-40和Aβ1-42濃度。
(d)篩選分析APP的mRNA編碼的5′-非翻譯區(5′-UTR)被證明包含鐵應答元素(J.T.Rogers等人，J.Biol.Chem.，2002，4745518-45528)，即，通過調節鐵蛋白翻譯和轉鐵蛋白受體mRNA穩定性控制細胞鐵動態平衡的RNA莖環。已經表明鐵含量調節星形膠質細胞的APP mRNA翻譯(J.T.Rogers等人，J.Biol.Chem.，1999，2746421-6431)，而已經發現胞內的鐵含量調節成神經細胞瘤細胞中的APP合成(J.T.Rogers等人，J.Biol.Chem.，2002，4745518-45528)。此外，報導鐵螯合劑如desferrioxiame的存在誘導對由APP 5′-UTR引起的翻譯的下調，觀察到通過鐵內流而使其反轉。
J.T.Rogers和同事開發了基于轉染的分析，以通過與用于APP的mRNA編碼的5′-UTR的相互作用抑制APP表達的能力篩選可能的藥物。他們使用這種分析篩選不同類別的藥物，包括已知的受體配體相互作用的阻斷劑、細菌抗生素、脂類代謝中涉及的藥物、和金屬螯合劑。
與Dr.Rogers合作，類似于較早報告的試驗用于檢測XH1及其類似物通過與mRNA 5′-UTR的相互作用降低APP表達和隨后發生的Aβ產生的能力。
構造制備如J.T.Rogers等人，J.Mol.Neurosci.，2002，1977-82中所述，通過將APP基因的5′-UTR序列分別與下游報道基因(熒光素酶和綠色熒光蛋白質，GFP)熔合制成pSV2(APP)熒光素酶和pSV2(APP)GFP構造。
轉染用10μg的pGL-3、pGAL和pGALA構造的DNA轉染人SH-SYSY成神經細胞瘤細胞，并用5μg的表達綠色熒光蛋白質(GFP)的構造的DNA共同轉染。從SV40促進劑表達熒光素酶和GFP報道基因。根據生產商的說明書(Invitrogen)，轉染在LipofectAMINE-2000的存在下進行。典型地，在燒瓶(100mm2)中生長的成神經細胞瘤細胞用于每種處理。將各個燒瓶轉染(12h)，隨后相同地轉移到96孔板中用于每種處理中接觸XH1(或其它待測雙官能分子)和作為對照的去鐵草酰胺48小時。
在處理48小時之后，通過顯微鏡檢查每個孔確定細胞的存活率。通過使用自動Wallac 1420 multilabel計數器在480/509nm波長(GFP)下讀取96孔板的每個孔中GFP的相對表達來證實細胞生的存活率。在得到GFP讀數之后，將每個96孔板中的細胞在50μL的報道溶解緩沖液(Promega，Madison，WI)進行細胞溶解，隨后使用Wallac 1420計數器進行熒光素酶分析。
為了排除本發明的雙官能分子表現出對總翻譯的非特異性下調作用的可能性，還需要在報道分子(即，APP、CAT、熒光素酶、和GFP)前面使用表達APP 5′UTR序列的反義版本的構造。這些構造的轉染將保證篩選的化合物以高選擇性靶向于APP-mRNA的正確的二級結構。特異性的黃金標準(gold standard)將用于檢查當APP基因表達、合成、和Aβ水平被抑制時是否APLP1和APLP2合成和5′-UTR驅動的基因表達仍然是未改變的。
實施例6Aβ淀粉樣物質通過本發明雙官能分子的回體溶解下述試驗可用于評價本發明的雙官能分子從人腦組織提取Aβ沉積物的能力。
樣品制備得到貯存在-80℃下的死后組織以及隨附的組織病理學和臨床數據，一半樣品得自阿爾茨海默氏病患者，另一半得自年齡相當的健康患者。根據Consortium to Establish a Register for Alzheimer′sDisease(CERAD)標準(S.S.Mirra等人，Neurology，1997，49S14-16)評價阿爾茨海默氏病，特別注意神經炎斑和神經元纖維纏結的存在。
得自死后腦組織的Aβ淀粉樣物質提取物使用DIAX 900勻漿器(Heidolph&Co，Kelheim，Germany)以全速將在3mL冰冷的PBS(pH7.4)中的額皮層的相同區域(0.5g)勻化三個30秒周期，每個動作之間靜止30秒，PBS包含除了EDTA之外的蛋白酶抑制劑混合物(BioRad，Hercules，CA)，或在0.1到2mM的本發明的雙官能分子或用作對照的氯碘羥喹的存在下。為了得到PBS-可提取級分，將勻漿以100,000xg離心30分鐘(Beckman J180，Beckman instruments，Fullerton，CA)并收集上層清液，分成1-mL等分試樣量并在冰上貯存或立即在-70℃凍結。使用1∶5的冰冷的10％三氯乙酸使1-mL上層清液樣品中的蛋白質沉積，并通過在10,000xg離心20分鐘形成小球。通過在包含8％SDS、10％巰基乙醇、和8M尿素的Tris-Tricine SDS-樣品緩沖液中煮沸10分鐘將小球準備用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過在1mL PBS中勻化并在如上樣品緩沖液中煮沸得到皮層樣品中的總Aβ。
聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質印跡通過將樣品裝載到10孔、10-20％梯度凝膠(Novex，San Diego，CA)隨后Western轉移到0.2-mm硝化纖維素膜(BioRad，Hercules，CA)上進行Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用單克隆抗體WO2(其檢測5到8表位處的Aβ1-40和Aβ1-42)、G210(其對在羧基殘基40封端的Aβ物質有特異性)或G211(其對在殘基42處封端的Aβ物質有特異性)(N.Ida等人，J.Biol.Chem.，1996，27122908-22914))與辣根過氧化酶結合兔抗小鼠IgG(Dako，Denmark)結合并使用化學發光(ECL，Amersham BiosciencesCorp.，Piscataway，NJ)顯現來檢測Aβ肽。每個凝膠包括兩個或多個泳道，泳道含有起內部參考標準作用的已知量的合成Aβ。
Aβ印跡掃描和透射密度測定分析使用配有透明適配器(TecoInformation Systems，Taiwan)的Relisys掃描器掃描印跡圖像，并且使用用于PC(Scion Corporation，Frederick，MD)的改進的Image 1.6軟件(NIH，Bethesda，MD)進行密度測定，使用步進擴散表進行校正。為了定量測量腦提取物中的Aβ，使用合成Aβ作為內部參考標準產生標準曲線，并將得到的值內插。
實施例7本發明的MRI對比成像劑的性質得自球形圖的MRI信號將不同的溶液混合物(在PBS中包含對比成像劑、Gd-XH1或Gd-DTPA，有或沒有Aβ1-40、Aβ1-42、或HSA，pH7.4)注射到4.5-mL空心圓球體(由聚丙烯制成)中并經受3-T磁掃描器(Simens)。使用旋轉-回聲掃描方式并使用12TR值(TE＝5ms)測量每個溶液的T1信號，R1＝1/T1，R1(obs)＝R1(0)+R1(Gd-XH1-Aβ1-40或Aβ1-42)。
報告在圖11中的這些實驗結果表示了Gd-XH1對縱向(T1)磁弛豫速率的影響。當Gd-XH1濃度增加時，T1減小并且信號變得更亮。對于Gd-DTPA(用作對照的小的親水性分子)與HSA或Aβ的組合沒有觀察到效果。
這些實驗的結果還在圖12和圖13中報告。它們表明Gd-XH1特異性地與Aβ1-40肽相互作用，而只與HSA有輕微的相互作用(圖12)。另外，如圖13所示，當與富有β折疊的Aβ1-42結合時，Gd-XH1的馳豫速率比與表現出較少β折疊含量的天然Aβ1-40結合時有增加。
AD小鼠和人腦組織提取物的MRI信號通過使用與蛋白酶抑制劑雞尾酒(Roche)混合的T-PER組織蛋白提取試劑將組織溶解制備AD小鼠(PS1(M146V)xAPPTg2576)和人腦組織提取物。然后將包含0.25mM Gd-XH1和10μg/mL(總蛋白)提取物的不同的溶液混合物注入到4.5-mL空心圓球體中并進行與上述同樣的實驗方案。
這些實驗的結果報告在圖14中。它們表明，當與Gd-XH1混合時，AD小鼠和人腦組織提取物中的MRI信號增強。
實施例8在AD動物模型中的Aβ淀粉樣沉積物的MRI檢測本文描述了檢測阿爾茨海默氏病的動物模型中淀粉樣沉積物存在的方法。該方法基于Gd-XH1的使用。如上所述，Gd-XH1特異性地與Aβ1-40和Aβ1-42相互作用。此外，發現當AD小鼠和人腦組織提取物與Gd-XH1混合時，提取物的MRI信號增強。
用于該系列實驗的動物模型為轉基因Tg2576小鼠株，其過度表達具有家族性AD基因突變的人淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)，并表現出AD的神經病理學特征，如記憶缺失和在腦的特定區域形成年齡相關性淀粉樣沉積物。使用小的9.4T MRI系統(400MHz，MagnexScientific，Kidlington，UK)在MGH/MIT/HMS Athinoula A.MartinosCenter for Functional and Structural Biomedical Imaging(Department ofRadiology，Massachusetts General Hospital，Boston，MA)進行成像。
為了評價Gd-XH1的體內毒性，為PS1(M146V)xAPPTg2576小鼠(約6個月大，每組5只小鼠)每天腹腔內注射每千克體重為30mg劑量的Gd-XH1，進行4周。對照包括注射相同劑量的Gd-DTPA和無治療。沒有觀察到Gd-XH1的急性毒性。
進行第一系列的試驗實驗以評價Gd-XH1的MRI對比成像能力。將Gd-XH1與甲基纖維素混合并制備為懸浮液。為一只雄性Sprague-Dawley大鼠(8個月大)腹腔內注射每千克體重為10mg的單一劑量的這種懸浮液。注射一小時后，使用4.7T MRI儀器(GE)以序列掃描方式為動物成像。記錄解剖學的和S/N比率制的MRI圖像。得到的一些圖像在圖15中表示。在i.p.注射一小時之后，觀察到信噪比有8％的增加。T1加權信號強度的增加好象是普遍的，表明Gd-XH1可以滲透BBB和骨骼肌。
使用APP轉基因小鼠代替大鼠進行另外的實驗。更具體地，為每組5到10只APP轉基因Tg2576小鼠腹腔內注射每千克體重為0.1mmol單一劑量的本發明的MRI對比成像劑如Gd-XH1在DMSO和PBS(60∶40；v∶v)的混合物中溶液。為了比較，另一組5到10只PS1(M146V)xAPPTg2576小鼠腹腔內注射每千克體重為0.1mmol單一劑量的對照用對比成像劑在PBS中的溶液。對照成像劑為使其包括與本發明的對比成像劑同樣的復合于相同的順磁性金屬離子的同樣的金屬螯合部分，但是與本發明的對比成像劑的不同之處在于其不包括任何淀粉樣物質結合部分。例如，在對比成像劑Gd-XH1的情況中，使用Gd-DTPA作為對照。在注射之后，通過MRI為兩組動物成像。通過在處死動物之后的Aβ免疫染色評價和證實本發明的MRI對比成像劑對轉基因小鼠中腦的Aβ淀粉樣物質成像的增強的作用。
實施例9一類包括α-硫辛酸部分的雙官能分子的合成已經設計并了正在開發第二類新的雙官能分子。新的雙官能分子包括直接共價連接于一個淀粉樣物質結合部分的一個金屬螯合部分。該類的所有雙官能分子共有的金屬螯合部分為α-硫辛酸，其還已知具有強大的抗氧化性質。如圖6A所示，該類的母體分子的淀粉樣物質結合部分是與第一雙官能分子(實施例1)中所用的同樣的苯并硫代黃素衍生物。
該類的其它成員為其中苯并噻唑部分的芳環被一個或多個官能團取代的母體雙官能分子的類似物，所述官能團包括例如4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰氧基、5-溴、4-，5-或6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-，5-或6-甲磺酰基、和4-，5-或6-羥基(參見圖6B)。
本文描述該類母體雙官能分子(化合物XH2)的合成。XH2的制備涉及在金屬螯合部分和淀粉樣物質結合部分之間形成酰胺鍵。根據由以前發表的合成方法(W.E.Klunk等人，Life Sci.，2001，691471-1484；D.Shi等人，J.Med.Chem.，1996，393375-3384；h M.S.Konings等人，Inorg.Chem.，1990，291488-1491)改編的方法進行反應。
向在室溫下攪拌的1mg硫辛酸(Aldrich Chemical)的二氯甲烷溶液加入二滴DMF。向該溶液中逐滴加入0.5mL草酰氯。反應表面顯示產生少量氣體。當起泡停止時，混合物用1.2mg的4-苯并噻唑-2-基苯胺和1mL的N，N-二異丙基乙胺在15mL二氯甲烷中的溶液處理。在室溫下攪拌深綠色混合物一小時。用水洗混合物，硫酸鈉干燥，過濾并蒸發，得到固體。將其與乙酸乙酯研磨并在真空下干燥，得到XH2(90％)，其結構通過1H-NMR證實(參見圖7)。
權利要求
1.雙官能分子，其包括與至少一個淀粉樣物質結合部分連接的至少一個金屬螯合部分。
2.權利要求1的雙官能分子，其中金屬螯合部分以高親合性與至少一種選自鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)的過渡金屬離子結合。
3.權利要求1的雙官能分子，其中金屬螯合部分包括DTPA。
4.權利要求1的雙官能分子，其中金屬螯合部分包括α-硫辛酸衍生物。
5.權利要求1的雙官能分子，其中淀粉樣物質結合部分可透過血腦屏障。
6.權利要求1的雙官能分子，其中淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
7.權利要求1的雙官能分子，其中淀粉樣物質結合部分包括苯并噻唑衍生物。
8.權利要求1的雙官能分子，其中金屬螯合部分以高親合性與至少一種選自鋅II(Zn2+)、銅II(Cu2+)、和鐵III(Fe3+)的過渡金屬離子結合，并且其中淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
9.權利要求8的雙官能分子，其中金屬螯合部分包括DTPA。
10.權利要求8的雙官能分子，其中淀粉樣物質結合部分包括苯并噻唑衍生物。
11.權利要求8的雙官能分子，其中金屬螯合部分包括DTPA，并且其中淀粉樣物質結合部分包括苯并噻唑衍生物。
12.具有以下化學結構的雙官能分子
13.具有以下化學結構的雙官能分子 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
14.具有以下化學結構的雙官能分子
15.具有以下化學結構的雙官能分子 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
16.對比成像劑，其包括與至少一個淀粉樣物質結合部分連接的至少一個成像部分。
17.權利要求16的對比成像劑，其中淀粉樣物質結合部分可透過血腦屏障。
18.權利要求16的對比成像劑，其中淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
19.權利要求16的對比成像劑，其中淀粉樣物質結合部分包括苯并噻唑衍生物。
20.權利要求16的對比成像劑，其中成像部分包括至少一個與金屬實體復合的金屬螯合部分。
21.權利要求20的對比成像劑，其中金屬螯合部分包括DTPA。
22.權利要求16的對比成像劑，其中成像部分包括至少一個與金屬實體復合的金屬螯合部分，并且其中淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
23.權利要求22的對比成像劑，其中金屬螯合部分包括DTPA，并且其中淀粉樣物質結合部分包括苯并噻唑衍生物。
24.權利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實體是順磁性金屬離子。
25.權利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實體是選自釓III(Gd3+)、鉻III(Cr3+)、鏑III(Dy3+)、鐵III(Fe3+)、錳II(Mn2+)、和鐿III(Yb3+)的順磁性金屬離子。
26.權利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實體是釓III(Gd3+)。
27.權利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實體是放射性核素。
28.權利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實體是選自锝-99m(99mTc)、鎵-67(67Ga)、釔-91(90Y)、銦-111(111In)、錸-186(186Re)、和鉈-201(201Tl)的放射性核素。
29.權利要求20或22的對比成像劑，其中金屬實體是锝-99m(99mTc)。
30.對比成像劑，其中釓III(Gd3+)與具有以下化學結構的雙官能分子復合
31.對比成像劑，其中釓III(Gd3+)與具有以下化學結構的雙官能分子復合 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
32.對比成像劑，其包括與至少一個由穩定的順磁性同位素標記的淀粉樣物質結合部分連接的至少一個金屬螯合部分。
33.權利要求32的對比成像劑，其中穩定的順磁性同位素是碳-13(13C)或氟-19(19F)。
34.藥學組合物，其包括有效量的權利要求1的至少一種雙官能分子或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
35.藥學組合物，其包括有效量的權利要求8的至少一種雙官能分子或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
36.藥學組合物，其包括有效量的權利要求12的至少一種雙官能分子或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
37.藥學組合物，其包括有效量的權利要求13的至少一種雙官能分子或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
38.藥學組合物，其包括有效量的權利要求14的至少一種雙官能分子或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
39.藥學組合物，其包括有效量的權利要求15的至少一種雙官能分子或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
40.藥學組合物，其包括成像有效量的權利要求16的至少一種對比成像劑或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
41.藥學組合物，其包括成像有效量的權利要求20的至少一種對比成像劑或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
42.藥學組合物，其包括成像有效量的權利要求25的至少一種對比成像劑或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
43.藥學組合物，其包括成像有效量的權利要求28的至少一種對比成像劑或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
44.藥學組合物，其包括成像有效量的權利要求30的至少一種對比成像劑或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
45.藥學組合物，其包括成像有效量的權利要求31的至少一種對比成像劑或其生理學可耐受的鹽，和至少一種藥學可接受的載體。
46.用于降低或抑制系統中淀粉樣物質毒性的方法，其包括使系統與權利要求1的雙官能分子或其藥學組合物接觸。
47.權利要求46的方法，其中所述方法預防、減慢或終止系統中的淀粉樣物質積聚；或促進、誘導、或幫助系統中存在的淀粉樣沉積物的溶解；或兼有上述兩種作用。
48.權利要求46的方法，其中所述方法降低、抑制或干擾淀粉樣物質介導的活性氧物質的產生。
49.權利要求46的方法，其中接觸通過體外或回體培養進行，并且其中系統選自細胞、生物流體、和生物組織。
50.權利要求49的方法，其中細胞、生物流體、或生物組織來源于懷疑患有與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的患者。
51.權利要求50的方法，其中病理生理學狀況與β淀粉樣肽的積聚有關，并且其中雙官能分子中的淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
52.權利要求46的方法，其中雙官能分子具有以下化學結構
53.權利要求46的方法，其中雙官能分子具有以下化學結構 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
54.權利要求46的方法，其中雙官能分子具有以下化學結構
55.權利要求46的方法，其中雙官能分子具有以下化學結構 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
56.用于治療患有與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的患者的方法，其包括對患者給藥有效量的權利要求1的雙官能分子或其藥學組合物。
57.權利要求56的方法，其中所述方法預防、減慢或終止患者體內的淀粉樣物質積聚；或促進、誘導、或幫助患者體內存在的淀粉樣沉積物的溶解；或兼有上述兩種作用
58.權利要求56的方法，其中所述方法降低、抑制或干擾淀粉樣物質介導的活性氧物質的產生。
59.權利要求56的方法，其中給藥通過選自口服給藥和腸胃外給藥的方法進行，包括靜脈內、肌內、皮下注射、和經皮給藥以及腸給藥。
60.權利要求56的方法，其中病理生理學狀況與β淀粉樣肽的積聚有關，并且其中雙官能分子中的淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性和特異性。
61.權利要求56的方法，其中雙官能分子具有以下化學結構
62.權利要求56的方法，其中雙官能分子具有以下化學結構 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
63.權利要求56的方法，其中雙官能分子具有以下化學結構
64.權利要求56的方法，其中雙官能分子具有以下化學結構 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
65.權利要求56的方法，其中病理生理學狀況選自阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、路易體癡呆、具有淀粉樣病變的(荷蘭型)遺傳性腦出血、關島帕金森癡呆、和腦外傷。
66.權利要求56的方法，其中病理生理學狀況是阿爾茨海默氏病。
67.檢測系統中淀粉樣沉積物存在的方法，其包括步驟使系統與成像有效量的權利要求20的對比成像劑或其藥學組合物在可使對比成像劑與存在的任何淀粉樣沉積物相互作用從而導致對比成像劑與淀粉樣沉積物結合的條件下接觸；使用成像技術檢測系統中存在的并與對比成像劑結合的任何淀粉樣沉積物；和產生系統的至少一部分的一個或多個圖像。
68.權利要求67的方法，其中系統中存在的淀粉樣沉積物通過β淀粉樣肽的積聚形成，并且其中對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性。
69.權利要求67的方法，其中接觸通過體外或回體培養進行，并且其中系統選自細胞、生物流體、和生物組織。
70.權利要求69的方法，其中細胞、生物流體、或生物組織來源于懷疑患有與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的患者。
71.權利要求69的方法，其中細胞、生物流體、或生物組織來源于接受與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的治療的患者。
72.權利要求69的方法，其中細胞、生物流體、或生物組織與用于治療與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的潛在治療劑接觸。
73.權利要求67的方法，其中所述方法用于鑒別用于治療與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的潛在治療劑。
74.權利要求67的方法，其中所述方法用于診斷與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況。
75.權利要求67的方法，其中所述方法用于跟蹤與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的進展。
76.權利要求67的方法，其中所述方法用于監測患者對與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的治療的應答。
77.檢測患者體內淀粉樣沉積物存在的方法，其包括步驟在可使對比成像劑與存在的任何淀粉樣沉積物相互作用從而導致對比成像劑與淀粉樣沉積物結合的條件下對患者給藥成像有效量的權利要求20的對比成像劑或其藥學組合物；使用成像技術檢測患者體內存在的并與對比成像劑結合的任何淀粉樣沉積物；和產生患者身體的至少一部分的一個或多個圖像。
78.權利要求77的方法，其中給藥通過選自口服給藥和腸胃外給藥的方法進行，包括靜脈內給藥、動脈內給藥、鞘內給藥、皮內給藥、和腔內給藥、以及腸給藥。
79.權利要求77的方法，其中淀粉樣沉積物通過β淀粉樣肽的聚集和積聚形成，并且其中對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分對A β淀粉樣沉積物具有高的親合性或特異性。
80.權利要求77的方法，其中所述方法用于定位患者體內的淀粉樣沉積物。
81.權利要求77的方法，其中所述方法用于定位患者腦中的淀粉樣沉積物，并且其中對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分可透過血腦屏障。
82.權利要求77的方法，其中所述方法用于診斷與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況。
83.權利要求77的方法，其中所述方法用于跟蹤與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的進展。
84.權利要求77的方法，其中所述方法用于監測患者對與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的治療的應答。
85.權利要求67或77的方法，其中對比成像劑中的成像部分包括至少一個與順磁性金屬離子復合的金屬螯合部分；檢測通過磁共振成像(MRI)進行；和產生MR圖像。
86.權利要求85的方法，其中順磁性金屬離子選自釓III(Gd3+)、鉻III(Cr3+)、鏑III(Dy3+)、鐵III(Fe3+)、錳II(Mn2+)、和鐿III(Yb3+)。
87.權利要求85的方法，其中順磁性金屬離子是釓III(Gd3+)。
88.權利要求87的方法，其中釓III(Gd3+)與具有以下化學結構的雙官能分子復合
89.權利要求87的方法，其中釓III(Gd3+)與具有以下化學結構的雙官能分子復合 其中R選自4-二甲氨基、4-氨基、4-氯、4-氯-5-乙基、4-乙酰基、5-羧基、5-磺酰基、5-溴、4-甲基、5-甲基、6-甲基、5-三氟甲基、4-乙氧基、4-甲磺酰基、5-甲磺酰基、6-甲磺酰基、4-羥基、5-羥基、和6-羥基。
90.權利要求67或77的方法，其中對比成像劑中的成像部分包括至少一個與放射性核素復合的金屬螯合部分；檢測通過單光子發射計算機斷層成像(SPECT)進行；和產生SPECT圖像。
91.權利要求90的方法，其中放射性核素選自锝-99m(99mTc)、鎵-67(67Ga)、釔-91(90Y)、銦-111(111In)、錸-186(186Re)、和鉈-201(201Tl)。
92.權利要求90的方法，其中放射性核素是锝-99m(99mTc)。
93.權利要求73、74、75、76、82、83或84的方法，其中病理生理學狀況與β淀粉樣肽的積聚有關，并且其中對比成像劑中的淀粉樣物質結合部分對Aβ淀粉樣沉積物具有高的親合性。
94.權利要求73、74、75、76、82、83或84的方法，其中病理生理學狀況選自阿爾茨海默氏病、唐氏綜合癥、路易體癡呆、具有淀粉樣病變的(荷蘭型)遺傳性腦出血、關島帕金森癡呆、和腦外傷。
95.權利要求73、74、75、76、82、83或84的方法，其中病理生理學狀況是阿爾茨海默氏病。
全文摘要
本發明涉及與淀粉樣物質積聚有關的病理生理學狀況的診斷、預防和治療。本發明描述了表現出對淀粉樣沉積物具有高親合性的雙官能治療分子和對比成像劑、及其藥學組合物。本發明還提供了使用成像技術以及這些雙官能分子、對比成像劑、及其藥學組合物用于檢測淀粉樣沉積物存在的方法；并且提供了用于預防或治療淀粉樣物質相關性狀況諸如例如阿爾茨海默氏病的方法。
文檔編號A61P25/28GK1774267SQ200480004902
公開日2006年5月17日 申請日期2004年1月22日 優先權日2003年1月22日
發明者黃旭東 申請人:綜合醫院有限公司