專利名稱：用于治療單鏈rna病毒感染的抗病毒反義核酸的試劑和方法
技術領域：
本發明涉及用于治療小RNA病毒(picornavirus)、杯狀病毒(calicivirus)、外衣病毒(togavirus)或黃病毒(flavivirus)感染的反義寡聚物，用該寡聚物進行抗病毒治療的方法，以及監測反義寡聚物與病毒基因組靶位點結合的方法。
參考文獻Agrawal，S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(4)1401-5(1990).
Alt，M.et al.，Hepatology 22(3)707-17(1995).
Alvarez-Salas，L.et al.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.9441-450(1999).
Aurelian，L.et al.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.1077-85(2000).
Bloomers，M.，Nuc Acids Res，22(20)4187(1994).
Bonham，M.A.et al.，Nucleic Acids Res.23(7)1197-1203(1995).
Boudvillain，M.et al.，Biochemistry 36(10)2925-31(1997).
Clarke，G.E.，and Lambden，P.，J.Infect.Dis.181，S309-316(2000).
Cottral，G.E.，inManual of Standard Methods for VeterinaryMicrobiology，Eds.，Cornell sity Press，Ithica，N.Y.pp.60-93.
Cross，V.et al.，Biochem 364096(1997).
Dagle et al.，Nuc Acids Res.28(10)2153(2000).
Ding，D.et al.，Nuc Acids Res.24(2)354(1996).
Felgner et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 847413(1987).
Gait，M.J.；et al.，J.Chem.Soc.Perkin I，1684-1686(1974).
Gee，J.E.et al.，Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.8103-111(1998).
Green，K.et al.，J.Am.Coll.Surg.19193-105(2000).
Gutierrez，A.et al.，Antiviral Research 22(1)1-13(1993).
Hanecak，R.et al.，Journal of Virology 70(8)5203-12(1996).
Holland，J.inEmerging Virus，Morse，S.S.，Ed.，OxfordUniversity Press，New York and Oxford pp.203-218(1993).
Kusunoki，A.et al.，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids191709-1719(2000).
Lesnikowski，Z.J.et al.，Nucleic Acids Research 18(8)2109-15(Apr.25，1990).
Matteucci，M.Tetrahedron Lett.312385-2388(1990).
McElroy，E.B.et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.41071(1994).
Mertes，M.P.et al.，J.Med.Chem.12154-157(1969).
Miller，P.S.et al.，inAntisense Research Applications，Crooke，S.T.and Lebleu，B.，Eds.，aton，CRC Press pp.189(1993).
Mizuta，T.et al.，Nature Biotechnology 17583-587(1999).
Mohan，V.et al.，Tetrahedron 518655(1995).
Murray，R.et al.，inMedical Microbiology(Third Edition)St.Louis Mo.，Mosby Press pp.542-543(1998).
O’Ryan，M.et al.，inSpector S，Lancz G，Eds.，Clinical VirologyManual，New York，Elsevier Science pp.361-196(1992).
Robbins，I.et al.，Methods in Enzymology 313189-203(1999).
Roughton，A.L.et al.，J.Am.Chem.Soc.1177249(1995).
Smith，A.et al.，Emerg.Inf.Dis.413-20(1998a).
Smith A.et al.，Clin.Inf.Dis.2643-40(1998b).
Stein，C.et al.，Pharmacol & Therapeutics，85231(2000).
Toulme，J.J.et al.，Biochimie 78(7)663-73(1996).
Vasseur，J.J.et al.，J.Am.Chem.Soc.1144006(1992).
Wei，X.et al.，Nucleic Acids Res.283065-3074(2000).
Wu，G.et al.，J.Biol.Chem.26712436-12439(1992).
Xu，W.，Revue Scientifique et Technique，Office of Internationaldes Epizooties 102393-2408(1991).
背景技術：
RNA病毒引起多種野生、家養動物及人類的疾病。這些病毒在遺傳和抗原性上具有多樣性，表現為較寬的組織趨向性和廣泛的致病潛力。一些致病力最強的病毒，如杯狀病毒，具有較短的潛伏期。病毒復制和毒性因子的表達可以壓制宿主早期的防御機制(Xu，1991)，導致急性的和嚴重的癥狀。
對許多病毒感染尚沒有特異的治療方案。感染可能有血清型特異性，因而自然免疫常常是短暫的或缺少(Murray et al.，1998)。由于血清型多樣性的存在，通過免疫作用來對抗這些致命的病毒缺乏可行性。RNA病毒在復制過程中缺乏有效的遺傳修復機制，目前，對其復制錯誤率的估計是認為每次基因組復制發生十分之一的錯誤，由此產生出很高的遺傳變異(Hollan，1993)。由于各種血清型常常沒有交叉保護，以至于任何一種血清型引起的傳染并不能保護不被其它血清型傳染。例如，抗杯狀病毒囊病毒屬(vesivirus genus)的疫苗僅提供對約40種不同的中和血清型的保護(Smith et al.，1998a)，而疫苗對杯狀病毒其它屬也被認為有類似的限制。
反義核酸試劑已被提出用于治療各種類型的病毒感染。一般而言，根據目標病毒的類型、病毒基因組的靶標和反義化合物中寡聚核苷酸主鏈的種類，可以將目前提出的手段進行分類。被作為治療靶標的病毒有水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)(Robbinsand Lebleu，1999)、流感病毒(influenza virus)(Mizuta et al.，1999)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)(Wu and Wu，1992)、人乳突瘤病毒(human papilloma virus，HPV)(Alvarez-Salas et al.，1999)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)(Aurelian andSmith，2000)、人體免疫缺陷病毒(HIV)(Kusunoki et al.，Wei et al.，2000)和口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)(Gutierrez etal.，1993)。已被提出作為病毒基因組上靶標的分子包括巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)的IE-2基因(Green et al.，2000)，一個5’非編碼區域的莖—環結構；翻譯起始密碼，丙型肝炎病毒(hepatitisC virus，HCV)編碼核心蛋白的序列，以及口蹄疫病毒的第二個功能性起始密碼子AUG(Hanecak et al.，1996；Alt et al.，1995；Gutierrezet al.，1993)。最后，提出了各種反義主鏈結構，其中包括帶負電荷的硫代磷酸脂(PSO)主鏈的寡聚物，特別是硫代磷酸寡聚脫氧核苷酸(Hanecak et al.，1996；Alt et al.，1995；Gutierrez et al.，1993)和均一修飾的2’-甲氧乙氧磷酸二脂寡聚核苷酸(2’-methoxyethoxyphosphodiester oligonucleotide)(Hanecak et al.，1996)。
發現和進展通常是在細胞培養中證實抗病毒的活性。表1收編了有關在細胞培養中進行的抗病毒實驗。
表1.體外抗病毒反義物研究
利用反義療法，對HIV、HPV、CMV和HCV的臨床試驗已經啟動，且全部都利用硫代磷酸鹽連接的寡聚核苷酸(見表2)。正如所看到的，盡管抗CMV感染的反義物(ISIS2922)已經被FDA批準，而且是到現在為止唯一被FDA批準的反義物，但是已經有臨床試驗表明存在一些無效的情況。
表2.用反義物進行抗病毒治療的臨床試驗
最初那種對反義核酸療法能有效抵抗病毒所持有的樂觀態度在減弱。許多在細胞培養模型中有效的反義核酸策略(如表1所列)并沒有成功地應用在臨床中。研究進展緩慢的部分原因可歸究于缺乏可靠的細胞培養模型。例如，從被感染的培養細胞中分離出的HIV并不總是反映出被感染人群中發現的情況，而且，細胞培養模型不能包含感染多細胞類型時出現的情況。由于缺乏能夠充分研究病毒在體內基因表達和復制情況的臨床前動物模型，這個問題變得更加復雜。再次以HIV為例，人體中的病毒要么不能感染動物，要么當靈長類被感染時，它們并不表現出與在人類身上所看到的相似的病理情況。在沒有可靠的細胞培養模型和適當的動物模型時，發展反義抗病毒制劑具有相當的風險。
因此，仍然需要發展針對幾種病毒科的，有效的抗病毒治療方法，這些病毒類型包括屬于小RNA病毒科、杯狀病毒科、外衣病毒科和黃病毒科的小的、單鏈的、正義RNA病毒。為滿足該需要，反義核酸應該具有這些特性能夠基本穩定地抵抗核酸酶的降解，通過化合物投藥后，能夠容易的被感染的宿主細胞所吸收，并且能夠以病毒基因組的有效區域為靶標，即阻斷病毒的復制。
發明概述一方面，本發明提供了一種抗病毒化合物，能針對來源于小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒、黃病毒科的RNA病毒，這些病毒具有單鏈、正義的少于12kb的基因組，有編碼包含多種功能蛋白質的多蛋白的第一開放閱讀框。抗病毒化合物包含一個基本不帶電荷的寡聚體，該寡聚體有(a)一個長12-40個亞基的序列，負載與病毒靶序列基本互補的目標堿基序列，病毒靶序列是指跨越所述的第一開放閱讀框的翻譯開始區域，和(b)一個基本不帶電荷的主鏈。
在一個優選的實施方案中，寡聚體是嗎啉代寡聚體，其有一條序列或嗎啉代亞基。亞基通常是由不帶電荷的、含磷的亞基間鍵合連接的，這個鍵合將一個亞基上的嗎啉基氮與鄰近亞基上的5’外環碳原子連接起來。在一個實施方案中，這些鍵合是二氨基磷酸鹽鍵。例如，一個嗎啉代亞基和二氨基磷酸鹽的連接的實施方案可以由結構1表示 其中Y1＝氧，Z＝氧，Pj為能通過堿基特異性氫鍵有效地與多核苷酸(在不同亞基上的堿基對部分可以相同或不同)中的一個堿基相結合的嘌呤或嘧啶堿基對部分，X是烷基、氧烷基、硫代氧烷基或烷基胺。在一個實施方案中，X是NR2，其中每一R獨立為氫或甲基。在具有這樣結構單元的一個寡聚體中，一個單元的磷原子與下一個單元的嗎啉代上的氮結合。
基本不帶電荷的寡聚體在與病毒靶序列結合后典型地有一個超過50℃解旋溫度(Tm)，以及能夠被哺乳動物細胞吸收的能力。另外，在將化合物給予受試哺乳動物幾個小時后，可以在受試者的血清或尿中復性以異源雙螺旋的形式存在的化合物，這個異源雙螺旋含有寡聚體與RNA病毒的病毒基因組的互補部分。
在各種實施方案中，抗病毒化合物是針對特定的病毒或病毒科的。如，可選擇的實施方案包括針對小RNA病毒的具體抗病毒化合物。例證性化合物包括那些含有與以下組中選出的序列有至少90％同源性的目標序列的化合物，這個組包含(i)序列識別號16，針對脊髓灰質炎病毒(polio virus)的Mahoneyand Sabin株，(ii)序列識別號17，針對甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)，(iii)序列識別號18，針對鼻病毒(rhinovirus)14，(iv)序列識別號19，針對鼻病毒16，(v)序列識別號20，針對鼻病毒1B，(vi)序列識別號21和22，對口瘡病毒(Aphthovirus)，和(vii)序列識別號23、24和25，對柯薩奇病毒(coxsackie virus)。
其它的實施方案包括針對杯狀病毒的抗病毒化合物。例證性化合物包括那些有一條與以下組中選出的序列有至少90％同源性的目標序列的化合物，這個組包含(i)序列識別號27、28和29，對囊病毒的Pan-1血清型，(ii)序列識別號30，針對豬的囊病毒，(iii)序列識別號31，針對諾沃克病毒(Norwalk vrus)，和(iv)序列識別號32，針對貓的囊病毒。
其它的實施方案包括針對外衣病毒的抗病毒化合物。用于抑制戊型肝炎病毒的化合物包括與選自序列識別號33和34的序列有至少90％同源性的目標序列的寡聚物。其它的具體化合物包括針對外衣病毒的抗病毒化合物。用于抑制丙型肝炎黃病毒(hepatitis C flavivirus，)的化合物含有一條與序列識別號為35的序列有至少90％同源性的目標序列的寡聚物。
在更特異實施方案中，化合物有確切的目標序列顯示，和/或包含二氨基磷酸鹽連接嗎啉代寡聚物。例如，針對囊病毒的Pan-1血清型的化合物包含二氨基磷酸連接嗎啉代寡聚物(PMO)，該寡聚物有一條包括序列識別號27、28和29的序列組中選出的目標序列。針對貓囊病毒的化合物包含有一條其序列識別號為31的目標序列的PMO。
在相關的方面，本發明提供了一種抑制來源于小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒、黃病毒科的RNA病毒復制的方法，這些病毒具有單鏈、正義的少于12kb的基因組，有第一開放閱讀框，編碼包含多種功能蛋白質的多蛋白。該方法包括將病毒或更典型的，被病毒感染的細胞暴露在基本不帶電荷的嗎啉代寡聚物中，這個寡聚物有(a)一個長12-40個亞基的序列，負載與病毒靶序列基本互補的目標堿基序列，病毒靶序列跨越所述的第一開放閱讀框的翻譯開始區域，和(b)一個基本不帶電荷的主鏈。在這個方法的一個實施方案中，將寡聚物給予一個被病毒感染的受試哺乳動物。優選的反義化合物的特性和結構的實施方案正如上面所描述的。
在更進一步的方面，本發明提供了一種證實感染了哺乳動物受試者的小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒與基本無電荷、針對感染病毒的反義寡聚物之間存在有效的相互作用的方法。方法包括(a)將寡聚物給予受試者，(b)在所述的給予后一個選定的時間，從受試者獲取體液樣本；和(c)分析樣本中是否存在含有反義寡聚物和病毒靶序列的互補部分的能抵抗核酸酶的異源雙螺旋。如上所述，這個寡聚物有一個長12-40個亞基的序列，負載與病毒靶序列基本互補的目標堿基序列，病毒靶序列跨越感染病毒的第一開放閱讀框(ORF1)的翻譯開始區域。優選的寡聚體是嗎啉代寡聚體，有不帶電荷的，含磷的亞基間鍵合，將一個亞基上的嗎啉基氮與鄰近亞基上的5’外環碳原子結合在一起。在一個實施方案中，這些連接是二氨基磷酸鹽鍵合。
通過完成所描述的步驟，這個方法能用于確定治療小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒感染的效果，所述的步驟包括給予寡聚物，獲取樣本和在整個治療期間定期分析異源雙螺旋。
另外，這個方法也被用于確定感染的小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒的特性。這樣一個病毒的科或屬能通過以下步驟被確定(a)提供各種反義寡聚物，每個都有一個與多個已知病毒的病毒靶序列基本互補的堿基序列，已知病毒選自小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒，其中每個所述的病毒靶序列是(i)對一個病毒科或屬是共同的，和(ii)沒有在人類中發現；(b)將多種寡聚物中的至少一種給予受試者，(c)在所述的給予后一個選定的時間，從受試者身上獲取體液樣本；(d)分析樣本中是否存在含有反義寡聚物和病毒靶序列的互補部分的能抵抗核酸酶的異源雙螺旋，和(e)根據含有給予的反義寡聚物和所述的病毒靶堿基序列的互補部分的異源雙螺旋的存在或缺如，鑒別感染病毒的科或屬。
為了確定感染的小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒的種，可以完成下面更進一步的步驟(a)提供第二類的反義寡聚物，每個都有一個與多個已知病毒的病毒靶序列基本互補的堿基序列，病毒來源于從上面(e)步中確定的科或屬，其中每個所述的病毒靶序列是(i)對一種所述的已知病毒是特異性的，和(ii)沒有在人類中發現；(b)將多種寡聚物中的至少一種給予受試者，(c)在所述的給予后一個選定的時間，從受試者獲取體液樣本；(d)分析樣本中是否存在含有反義寡聚物和病毒靶序列的互補部分的能抵抗核酸酶的異源雙螺旋，和(e)根據含有給予的反義寡聚物和所述的病毒靶堿基序列的互補部分的異源雙螺旋的存在或缺如，確定感染病毒。
在閱讀了以下關于本發明的詳細說明以及附圖后，本發明的這些和其它目地及特征將獲得深入的理解。。


圖1A-1E顯示了幾種優選的嗎啉代型亞基，有適合形成聚合物的5原子(A)、6原子(B)和7原子(C-E)連接基團；圖2A-E顯示了例證性嗎啉代寡核苷酸的重復亞基片段，指定為A至E，分別使用圖1的亞基A至E構建；圖3A-3D是例證性病毒基因組和病毒靶位點的示意圖；圖4A-4H顯示了寡核苷酸類似物的無電荷連接的例子；圖5顯示了本發明的反義寡聚物在體外對人鼻病毒的抑制百分比，如實施例1所描述的與病毒序列有三個錯配；圖6顯示了本發明的反義寡聚物在治療小鼠HCV感染時的劑量效應，如實施例4所描述的；劑量按每天/每只鼠給多少mg來計量。
發明的詳細說明I.定義在此使用的術語，除非另有說明，應具有下述含義術語“開放閱讀框”或者“ORF”指一段核苷酸序列，它包括一個單獨的5’端起始密碼子，編碼一種或多種單個蛋白質，并在終止密碼子處停止翻譯。
術語“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“寡聚體”可以互換使用，是指一個多聚分子，含有一條負載能用氫鍵與典型的多核苷酸相結合的主鏈，聚合物的堿基的主鏈能使堿基按照特定序列形式，利用氫鍵使聚合物分子和典型的多核苷酸(例如單鏈RNA、雙鏈RNA、單鏈DNA或雙鏈DNA)結合。“多核苷酸”包括一些具有核苷酸的聚合物，它們是嘌呤或嘧啶堿基的N端或C端的配糖體，以及含有非標準核苷主鏈的聚合物，例如用二氨基磷酸嗎啉代化學形成的主鏈，利用聚酰胺連接(如，肽核酸或PNAs)和其它合成的序列特異性核酸分子所形成的主鏈。
在生理條件下，如果具有第一序列的多核苷酸能夠與具有第二序列的多核苷酸特異性地結合或特異性地雜交，則第一序列即為第二序列的“反義序列”。
“反義寡核苷酸”和“反義寡聚體”指一段通過亞基與亞基的主鏈連接起來的序列，其中亞基負載核苷酸堿基對部分，能夠有效地與病毒的正義ssRNA的靶序列雜交。典型情況下，這樣的寡聚體有8到大約40個核苷酸亞基長；更典型的情況是大約12到40個核苷酸亞基長；優選大約12到30，或12到25個亞基長。正如以下定義的那樣，寡聚體應該能與靶序列精確互補或接近于互補。這樣的一個反義寡聚體可以阻止或抑制靶開放閱讀框編碼的多蛋白的翻譯。
寡核苷酸或寡核苷酸類似物的“亞基”是指寡聚體的一個核苷(或核苷類似物)單元。盡管當指“帶電亞基”時，電荷往往存在于亞基間鍵合(如磷酸鹽或二硫代磷酸酯)上，這個術語也可以指具有或不具有亞基間附著連接的核苷單元。
“嗎啉代寡聚體”是寡核苷酸類似物，由圖1A-E所示形式的嗎啉代亞基結構組成，其中(i)這個結構由1-3個原子長的，含磷的鍵合，將一個亞基上的嗎啉基氮與鄰近亞基上的5’外環碳原子結合而成，并且(ii)Pi和Pj是嘌呤或嘧啶堿基對部分，通過堿基特異性的氫鍵與一個多核苷酸上的堿基有效結合。嘌呤和嘧啶堿基對部分往往是腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。嗎啉代寡聚體的合成、結構和結合特性在美國專利5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,521,063和5,506,337中有詳細描述，所有這些在此引入以供參考。
顯示在圖1B中的亞基和鍵合用于6個原子的重復單元主鏈，如圖2B所示(在此，六個原子包括一個嗎啉基氮原子，連接的磷原子，將磷原子與5’外環碳原子連接起來的原子(通常是氧)，5’外環碳原子、和嗎啉環上鄰近的兩個碳原子)。在這些結構中，將5’外環嗎啉碳原子與磷基團連接起來的Y1原子可以是硫、氮、碳，或者最好是氧原子。磷旁的X側基是任何穩定的基團，不會干擾堿基特異性的氫鍵結合。優選的X基團包括氟、烷基、氧烷基、硫代氧烷基、烷基氨包括環胺，只要堿基特異性結合不被破壞，所有的這些都可以進行各種替換。烷基、氧烷基、硫代氧烷基最好具有1-6個碳原子。烷基氨最好是指低烷基替換(C1-C6)，環胺最好是有5-7元的氮雜環，任選的包含1-2個另外的雜環原子，如氧、氮或硫。Z是硫或氧，最好是氧。
一個優選的嗎啉代寡聚物是與二氨基磷酸鹽相連的嗎啉代寡聚物，在此稱為PMO。這樣的寡聚體由圖2B所示的嗎啉代亞基結構組成，其中X為NH2、NHR或NR2(R是低碳烷基，優選甲基)Y為氧，Z為氧，Pi和Pj為能通過堿基特異性的氫鍵有效地與多核苷酸中的一個堿基相結合的嘌呤或嘧啶堿基對部分。這樣一個結構也表示在圖4H上。還有一個優選的結構是如圖2B所示的，含有另一種二氨基磷酸鹽鍵合的結構，在此結構上，X是低碳氧烷基，如甲氧基或乙氧基，Y是NH或NR，這里R是低碳烷基，Z則代表氧。
術語“取代的”，特別是涉及到烷基、氧烷基、硫代氧烷基和烷基氨基團時，是指用含雜原子取代基的取代碳原子上連接的氫原子，這些含雜原子的取代基包括鹵素、羥基、氧烷基、硫醇、烷硫醇、氨基、烷基胺、亞氨基、氧代(酮基)、硝基、氰基或各種酸或酯如羧基、磺酸基和磷酸。它也可指將一個雜環原子上的氫(如胺上的氫)用烷基、碳酰基或其它包含碳的基團所取代。
當雜交發生在兩條反向平行結構的單鏈多核苷酸之間時，它們被描述為能夠彼此“互補”。如果雜交能發生于一個多核苷酸兩條鏈中的第一核苷酸鏈和另一個多核苷酸之間，則這條雙鏈多核苷酸能與另一條多核苷酸“互補”。“互補率”(即一條多核苷酸與另一條多核苷酸互補的程度)是可以以比率計算的，即按照廣泛接受的堿基配對原則，相反鏈上的堿基可能與另一條鏈形成氫鍵的堿基的比率(如百分比)。一條反義寡聚體可以有與靶序列“接近”或“基本”的互補性，而且仍能符合本發明目的。較好的情況是，當與在此所指定的，作為實例的序列識別號(SEQ ID Nos)為16-35的寡聚體進行對比時，所使用的反義寡聚體具有10個核苷酸中至多只有1個錯配，最好是20個中至多有1個錯配。可選擇地，所使用的反義寡聚體，在與所指定的序列識別號為16-35的例證性寡聚體至少要有90％的序列同源性，最好至少有95％的序列同源性。
如果寡聚物在生理條件下靶序列雜交，一個寡核苷酸或反義寡聚體能與靶核苷酸特異性雜交，其Tm完全高于37℃，較好的是至少50℃，最好是60℃-80℃或更高，則該雜交稱為“特異性雜交”(。這樣的雜交能較好地符合嚴格的雜交條件。在特定的離子濃度和PH值下，解鏈溫度是指有50％的靶序列與互補核苷酸發生雜交時的溫度。此外，和精確互補時一樣，這樣的雜交也可以發生在反義寡聚體和靶序列“接近”和“基本”互補時。
無論是以非雜交或雜交形式，或是在體內胞外和胞內核酸酶的共同作用下，“核酸酶耐受”(nuclease-resistance)寡聚分子(寡聚體)是指該寡聚體的主鏈能基本耐受核酸酶裂解；通常是體內的胞外和胞內核酶，也就是說，當寡聚體在體內正常的核酸酶條件下，應該很少或不被核酸酶降解。
“異源雙鏈”是指由反義寡聚體與靶RNA的互補部分形成的雙鏈。“核酸酶耐受的異源雙鏈核酸分子”指通過反義寡聚體和它的互補靶序列形成的異源雙鏈核酸分子，能基本耐受活體內胞內和胞外核酸酶的降解，這些酶包括RNAse H，它能夠切斷雙鏈RNA/RNA或RNA/DNA復合物。
在此所用的術語“靶”，涉及病毒基因組RNA或mRNA，指一條mRNA或病毒的基因組RNA，其能在一種或多種哺乳動物細胞內以單鏈形式被表達或存在。
“堿基特異性的胞內結合靶RNA的事件”指一條寡聚體在細胞內與一條靶RNA序列特異性地結合。這樣的堿基特異性結合是序列特異性。例如，一條單鏈的多核苷酸能夠與一條與之在序列上互補的單鏈多核苷酸特異性結合。
“反義寡聚體組合物”指含有一個或多個反義寡聚體的化合物，能用于本發明的RNA的檢測方法。在有些例子中，這樣的“反義寡聚體合成物”包含大量的反義寡聚體。
反義寡聚體針對病毒ssRNA感染的“有效數量”是指能有效降低病毒的復制率，和/或病毒載荷，和/或病毒感染相關的癥狀的反義寡聚體的數量。
在此處所用的術語“體液”包含多種樣本類型，這些樣本來自包括尿、唾液、血漿、血液、脊髓液，或其它的生物來源的樣本，如皮膚細胞或皮膚碎片，也可以指懸浮在那里的細胞或細胞片段，或液體培養基和它的溶質。
術語“相對數量”用于測試測定和對照測定。在一個反應中，形成復合物的試劑的相對數量是將試驗樣本反應的數量與對照樣本反應的數量進行對比獲得的。對照樣本可以在相同的試驗中單獨操作，或者也可以是相同樣本的一部分(例如，在組織切片的惡性部分周圍的正常組織)“處理”一個個體或細胞是任何類型的干預，即提供一種方式來改變個體或細胞的自然過程。處理包括，但并不僅限于給藥(如藥物組合物)，可以是預防性地，或在疾病初起后，或是與病源物聯用。與被診斷為被特定病毒感染的患者相關的相關術語“改善治療結果”指能減慢或減少病毒的增長，或病毒的載荷，或被特定病毒感染相關的可檢測的癥狀。
當一種試劑不是通過被動擴散的方式穿過細胞膜，則是被“哺乳動物的細胞主動吸收”。試劑可以被轉運進入細胞內，例如，通過“主動運輸”方式，這是指通過如ATP依賴這樣的轉運機制轉運物質通過細胞膜；或“易化運輸”，即通過將反義物質與轉運蛋白結合在一起這樣的轉運機制通過細胞膜，轉運蛋白能夠使物質穿過細胞膜更容易。正如以下定義的，對主動運輸或易化運輸而言，反義物質最好具有穩定的，不帶電荷的主鏈。或者，反義化合物也可以以復合物的形式配方，如形成含有活化陽離子脂質或脂質體的，帶有陰離子主鏈的試劑，從而使之能通過內吞作用進入細胞。
II.靶病毒本發明基于這樣的發現，即將被病毒感染的細胞暴露在反義化合物中時，反義化合物能有效抑制某一類小的、單鏈的、正義RNA病毒，反義化合物能夠(i)靶向病毒第一開放閱讀框的起始區域和(ii)具有反義化合物與宿主細胞中的病毒之間有效相互作用的物理和藥代動力學特征。一個方面，寡聚體能夠被用于治療被病毒感染的哺乳動物受試者。
本發明靶向RNA病毒，該病毒有如下的基因組(i)單鏈，(ii)正極性，(iii)小于12kb，(iv)在第一開放閱讀框編碼多蛋白。特別地，目標病毒科包括小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒和黃病毒。這四個科的每一科和其中各成員的物理的、形態學的和生物學的特性能夠在如人類病毒學教科書(Textbook of Human Virology)，R.Belshe，ed.，2nd Edition，Mosby，1991上找到。每個科的關鍵性生物學特性總結如下A.小RNA病毒(picornavirus).小RNA病毒能感染人類和動物，引起嚴重的癱瘓(脊髓灰質炎癱瘓)、表面腦膜炎、肝炎、胸膜炎、心肌炎、皮疹、感冒；無癥狀感染很普通。幾個醫學上很重要的成員包括脊髓灰質炎病毒、甲型肝炎病毒、鼻病毒、口瘡病毒(口蹄疫病毒)和柯薩奇病毒。
鼻病毒被公認是導致人類患普通感冒的原因。血清型分類從1A到100。主要通過浮塵途徑傳播，并在鼻腔中復制。
與所有的正義RNA病毒一樣，小RNA病毒的基因組RNA是有傳染性的；也就是說，基因組RNA能夠直接指導病毒蛋白質的合成，而不需要宿主的轉錄過程。
B.杯狀病毒。杯狀病毒能感染人類和動物。囊病毒屬在哺乳動物上引起的疾病中，包括上皮皰疹，它還被懷疑會導致動物爆發流產及人類的肝炎(非A到E型)(Smith et al.，1998a and 1998b).其它屬的杯狀病毒包括Norwalk-like and Sapporo-like病毒，一起組成了人的杯狀病毒，以及lagoviruses，這種病毒引起兔的出血病，是一種傳播特別迅速和致死性的病毒。
人類杯狀病毒是全球性的，引起成人病毒性痢疾的最主要原因，也是嬰兒的重要病原體(O’Ryan et al.，1992)。至少有五種人類的杯狀病毒存在于胃腸道內。Norwalk病毒是一種廣泛傳播的人類急性傳染性胃腸炎的致病因子，約占人類腸胃炎發作的10％。
囊病毒現在已公認是一種已知的、具有多種類群的病原，而不是以前認為的有些模糊和具有宿主特異性。例如，單個血清型能感染不同的16個種的動物，包括海產魚(蛋白眼)、海獅、豬和人。
C.外衣病毒。這個科的成員包括了感染人和動物的蚊媒病毒。這個科包括甲病毒屬、紅病毒屬(風疹)、瘟病毒屬(黏膜疾病)、動脈病毒屬(馬動脈)炎和戊型肝炎病毒(HEV)。
HEV最開始在1987被記錄，在美國第一次被報道是1991年。最早這個病毒因為具有小、單鏈RNA的性質，而被描述為一種杯狀病毒。有些人仍將它分到杯狀病毒科，但它也被分為外衣病毒科。其感染看起來更像甲型肝炎病毒。這個病是急性肝炎，感染后大約20天顯現，病毒在20天左右可以在血清中被觀察到。通過被污染的水傳播，因地理原因，病毒被限制在少數的發展中國家。
D.黃病毒。這個科的成員包括幾種危害極大的人病原物，它們當中有蚊媒傳播的黃熱病、西尼羅熱、丙型肝炎、日本腦炎、圣路易腦炎、默里河谷腦炎和登革熱。
黃病毒粒子的直徑大約40-50納米。對稱的黃病毒粒子還沒被充分研究過。據了解，黃病毒的外殼僅僅含有一類糖蛋白。到現在為止，在黃病毒中既沒有發現亞基因組mRNA，也沒發現多蛋白前體。
III.病毒靶區域優選的靶序列是以AUG開始的，橫跨病毒基因組第一開放閱讀框的區域。第一ORF通常編碼多蛋白，含非結構蛋白如聚合酶、解旋酶和蛋白酶。“橫跨AUG起始位點”的意思是目標序列包括AUG起始位點上游至少3個堿基，以及下游至少2個堿基(總計至少8個堿基)。更優選的是，它能包括兩側各至少4個堿基(總計至少11個堿基)。
更普遍地，優選的靶位點包括病毒分離物的變化間的保守位置。其它有利的位點包括IRES(內部核糖體進入位點)、反作用蛋白結合位點和復制起始位點。復雜、大的病毒基因組可以提供多種冗余的基因，可以通過宿主細胞編碼病毒進入的基因和宿主對病毒存在發生反應的基因來有效地識別多種病毒的基因組序列可以從眾所周知的來源獲得，如美國國立生物技術信息中心的基因庫(NCBI Genbank數據庫)。另外，這個領域的熟練技術人員可以在公開的文獻中找到許多受試病毒的序列。如通過檢索釋放指定病毒的序列信息的文獻。一旦獲得一個完全或部分的病毒序列，就可以確定病毒的ORF1。典型地，ORF1可以在基因數據庫中或依靠文獻得到確定。另外，也可以通過病毒基因組的組織規律獲知，如以下描述的這四個科。ORF1的AUG起始位點可以在基因數據庫或所依靠的文獻中確定，也可以在預測的ORF1序列的起始區域，通過搜索AUG密碼來確定。
下面給出四個科病毒中每一類基因組的組織形式，以及從每個科中選出的成員(屬、種、株系)的例證性靶序列。
A.小RNA病毒。圖3A顯示了一個RNA病毒的基因組結構10，這個例子是小RNA病毒科中的鼻病毒。作為典型的小RNA病毒，鼻病毒基因組10是一條單鏈的、正義聚腺苷酸化RNA的單個分子，大約7.5kb。正如顯示的，這個基因組包括一個長的非翻譯區(UTR)12，位于第一多蛋白位點的上游，還有一個單獨的開放閱讀框(ORF)，有一個VPg(病毒基因組連接)蛋白共價地連接在它的末斷。ORF被分為兩個片段(14，16)，每個編碼一個多蛋白。第一片段14編碼一個多蛋白，隨后可剪切形成病毒蛋白VP1到VP4，第二片段16編碼病毒蛋白包括順式蛋白、蛋白酶和聚合酶的前體。ORF終止于聚腺苷酸終止序列18。
靶初始AUG起始位點位于堿基位置615-640之間，以這個區域為目標可以有效地抑制多蛋白片段14，16的翻譯。
B.杯狀病毒。圖3B顯示了一個RNA病毒的基因組結構20，這個例子是杯狀病毒科的囊病毒。囊病毒基因組是具傳染性的單分子，有一條單鏈的、正義RNA，長約7.5kb。正如顯示的，這個基因組20包括一個非翻譯區22，位于第一開放閱讀框(ORF1)24的上游。ORF1未被修飾。基因組20的3’末端26是多聚腺苷酸化的。基因組20包括三個開放閱讀框。第一開放閱讀框24編碼一個多蛋白，能夠剪切形成病毒非結構蛋白包括解旋酶、蛋白酶、依賴RNA的RNA聚合酶和結合在病毒基因組RNA5’端的VPg(Clarke and Lambden，2000)。第二開放閱讀框28編碼單一的外殼蛋白。第三開放閱讀框29編碼據報道是一個在自然狀態很重要的結構蛋白，可能與RNA相關(Green et al.，2000)。
靶位點起始AUG起始位點位于堿基位置7-35之間，以這個區域為目標可以有效地抑制第一開放閱讀框24的翻譯。
C.外衣病毒。圖3顯示了一個外衣病毒的基因組結構30，這個例子是外衣病毒科的風疹病毒。基因組30是一個單純線形分子，有單鏈、正義RNA，大約11.7kb，具有傳染性。5’端32被7-甲基鳥苷戴帽修飾，3’末端34被多聚腺苷酸化。全長和次基因組信使RNA已被證明，多蛋白翻譯后的切割發生在RNA復制期間。基因組30包含兩個開放閱讀框36，38。第一開放閱讀框36編碼一個多蛋白，該多蛋白隨后裂解為四個功能蛋白質，nsP1到nsP4。第二開放閱讀框38編碼病毒外殼蛋白和三個其它的病毒蛋白PE2，6K和E1。第一開放閱讀框36的初始AUG起始位點位于堿基位置10-40之間，以這個區域為目標可以有效地抑制第一開放閱讀框36的翻譯。
D.黃病毒。圖3D顯示了一個黃病毒科的丙型肝炎病毒的基因組結構40。丙型肝炎病毒的基因組是一個單純線形分子，具有單鏈、正義RNA，大約11kb。5’末端42被7-甲基鳥苷(m7GppAmp)分子戴帽修飾，3’末端44未被聚腺苷酸化。基因組40僅包含一個開放閱讀框46，編碼一個多蛋白前體，該多蛋白可剪切為六個結構和功能蛋白質。初始AUG起始位點位于堿基位置310。
表3列出GenBank中，包含相應病毒基因組ORF1起始位點的病毒核酸序列信息。應予理解的是，這些序列僅只反映了4個病毒科中其它成員在ORF1起始區域的情況，這些序列可以從基因序列數據庫文獻或專利資源中獲得。序列識別號為1-15的序列列于本說明書末尾的表10當中。
表3.跨越ORF1的AUG位點的例證性病毒核酸序列

正如以上所示，目標序列，即反義寡聚體的堿基序列，優選針對病毒靶序列的AUG起始部分。特別是，正如前面所定義的那樣，目標序列與病毒基因組第一開放閱讀框的AUG起始位點的靶區域是互補的或基本互補的，并且靶序列和目標序列間的互補程度足夠形成穩定的雙螺旋。在目標序列至少長8個堿基的情況下，目標序列包含一個能夠針對密碼子AUG的CAT序列，并且，至少有3個堿基在一邊，2個在另一邊。反義寡聚體與靶RNA序列互補的區域至少有8-11個堿基長，但更好是12-15個堿基或更多，如12-20，或12-25。大約15個堿基長的反義寡聚體足夠與病毒基因組形成唯一的互補。另外，為了達到結合所需的Tm需要有一個如下所討論的最小長度的互補堿基。
40個堿基長的寡聚體適合與靶序列互補，堿基數最少應達到8-11個，較好為12-15個。然而，為了促進或激活細胞對寡聚體吸收，寡聚體的長度一般應少于約30個堿基，較好是少于25，更好是20或更少。對PMO寡聚體，下面進一步說明，一個在結合的穩定性和吸收間的最適宜平衡，是堿基長度為13-18個。
寡聚體可以與病毒核酸靶序列100％地互補，或為了容納變異而包括錯配，只要病毒核酸靶序列與寡聚體之間形成的異源雙螺旋足夠穩定，就能夠經受胞內核酸酶的作用和體內其它方式的降解。寡聚體的主鏈較少受到核酸酶的裂解影響，以下進一步討論。如果存在錯配的話，其出現在雜合雙鏈的末斷區域比在中間對穩定性的影響要小些。允許的錯配數量依賴于公認會影響雙螺旋穩定性的因素，比如寡聚體的長度、G∶C堿基對在雙螺旋中百分比、以及雙螺旋中錯配的位置。盡管這樣的一條反義寡聚體不會100％地與病毒核酸靶序列互補，但它能穩定地和特異性地與靶序列結合，從而有效地調整靶核酸的生物活性，如病毒蛋白的表達。
寡聚體與靶序列之間形成的雙螺旋穩定性是由結合的Tm和雙螺旋對胞內酶降解的敏感性決定的。反義化合物與互補RNA序列的解旋溫度可以用常規方法檢測，如Hames et al.，Nucleic AcidHybridization，IL Press，1985，pp.107-108.中所說明的那些。對于互補的RNA序列，每條反義寡聚體應當有一個結合的解旋溫度，這個溫度應高于體溫，優選高于50℃。首選Tm在60℃-80℃或更高。根據眾所周知的原則，對于一個堿基互補的RNA雜交物，一個寡聚體解鏈溫度能夠通過增加雙螺旋中的C∶G堿基對的比例，和/或增加異源雙螺旋的長度(增加堿基對)來提高。同時，為了有利于細胞吸收，限制寡聚體的大小會更加有利。為了這個理由，當Tm值較高時(50℃或更高)，堿基長度為15個或更少的化合物要優于堿基長度大于20個的化合物。
表4列出了從小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒和黃病毒四個科中選出的，病毒第一開放閱讀框的翻譯起始位點的例證性序列。正如上面所論述的那樣，這些序列之所以被選擇，是為了構建一個序列，使其能夠與上述靶序列內一個或多個跨越AUG起始位點的序列進行互補。
這一普通原則的例外如下序列識別號26涉及病毒基因組的起始位置；序列識別號23-25包含錯配和/或插入，用下劃線表示；序列識別號33僅包括AUG起始密碼的一個堿基。
表4.以ORF1翻譯開始區域為目標的例證性反義序列


IV.反義寡聚體A.特性正如以上詳細說明的，寡聚體具有針對病毒基因組靶部分的堿基序列，優選的是跨越ORF1翻譯起始位點區域的序列。另外，當把寡聚體給予被感染的宿主細胞，例如被感染的哺乳動物受試者時，寡聚體能夠有效地將感染病毒作為目標。
達到后一目標的必要條件是寡聚體化合物(a)能夠被哺乳動物細胞主動吸收；(b)一旦被吸收，它與靶ssRNA形成雙螺旋的解旋溫度高于約50℃的。
正如下面將要描述的那樣，能夠被細胞吸收需要寡聚體的主鏈不帶電荷，而且，最好是寡聚體結構能被主動或易化運輸識別為底物，從而能穿過細胞膜。寡聚體能與靶RNA形成穩定的雙螺旋也依賴于寡聚體的主鏈，及上面指出的因素，如反義物核苷酸與靶序列互補的程度和長度，G∶C堿基配對與A∶T配對的比例，以及錯配堿基的位置。反義制劑抵抗細胞核酸酶降解的能力能夠促使反義物存留下來并最終被運輸到細胞的細胞質中。
下面公開測試的方法，用于檢測符合這些條件的，不帶電荷的主鏈。
A1.細胞主動或易化吸收如果給予游離(非-復合)形式的反義化合物，則宿主細胞可以通過主動或易化運輸，以穿過宿主細胞膜的方式加以吸收，或給予復合形式的反義化合物，則宿主細胞就通過胞吞機制加以吸收。
在以游離形式給予反義制劑的情況下，反義化合物應該基本上是無電荷的，意味著在生理PH值條件下，大多數的亞基間連接是無電荷的。用于負載這個發明的所進行的試驗表明，帶有少量凈電荷，如15-20個單體的寡聚體帶有1-2個電荷，實際上能夠促進細胞吸收這些寡聚體，它們具有基本上不帶電荷的主鏈。寡聚體可以自己具有電荷，例如在主鏈連接上，或者可以在末端附加帶電的基團。比較可取的帶電荷的連接數目，是每四個不帶電荷的連接中不要超過有一個帶電荷的。更可取的是每十個中不超過一個帶電荷連接，或者每二十個中不超過一個帶電荷連接。在一個實施方案中，寡聚體是完全不帶電荷的。
只要正負電荷保持大致相同的數量，寡聚體既可以包含帶負電荷的主鏈連接，也可以包含帶正電荷的主鏈連接。最好，寡聚體不含有超過連續3-5個的亞基帶同一種電荷的情況。例如，寡聚體包含有特定數目的陰離子連接，如磷酸二硫代酯或N3’→P5’的磷酸酰胺連接，和相當數目的陽離子連接，如N-N哌嗪磷酸酰胺(Dagle，2000)。凈電荷最好是中性的，或每個寡聚體至多有1-2個凈電荷。
除了基本或完全不帶電荷以外，反義制劑最好是一個細胞膜轉運系統的底物(如細胞膜蛋白質或蛋白質)，能夠通過易化轉運或主動轉運將寡聚體穿過細胞膜。這一特征可以由檢測寡聚體相互作用或細胞吸收的試驗之一所決定。如下第一個檢測是估計細胞表面受體的結合。在細胞表面，通過檢查寡聚體化合物被所選的帶電的寡聚體，如磷酸硫代酯寡聚物，取代或被取代的能力來進行。將細胞與給定數量的試驗寡聚物進行共培養，這些寡聚物常常是被熒光標記的，其終濃度為10-300nM。短時間后，例如10-30分鐘(在試驗寡聚物被細胞顯著吸收前)，將替代化合物加進去，并逐漸增加濃度。如果試驗化合物能結合到細胞表面受體，就會觀察到試驗化合物被替代。如果替代化合物的濃度在試驗化合物10倍或更少時，產生了50％的替代，則試驗化合物就被認為能通過細胞轉運系統，結合在與替代化合物相同的識別位點上。
第二個檢測是測量細胞的轉運，通過檢測受試化合物轉運被標記的報告物(如熒光標記報告物)進入細胞的能力來檢測受試化合物。將細胞在標記受試化合物存在的情況下進行培養，化合物的終濃度加到約10-300nM。培養30-120分鐘后，通過顯微鏡等方式檢測細胞內的標記。胞內存在顯著的標記就是試驗化合物能被易化或主動轉運的證據。
反義化合物也可以以復合物的形式給予，這里，這個復合制劑一般是聚合體，如，陽離子脂質、多肽或非生物陽離子聚合體，帶有與反義化合物的凈電荷相反的電荷。形成復合物的方法是眾所周知的，包括在帶陽離子的寡核苷酸與帶陰離子的脂質之間，或與其它聚合體成分之間形成雙層膜復合物。例如，脂質化合物細胞轉染劑RTM.(Felgner et al.，1987)，包含了陽離子脂質DOTMA(氮-[1-(2，3-氧代二油基)丙基]-N，N，N-氯化三甲銨，N-[1-(2，3-dioleyloxy)pro-pyl]-N，N，N-trimethylammonium chloride)和中性磷脂DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺，dioleyl phosphatidyl ethanolamine)，有廣泛的應用。在給予試劑后，復合物通過細胞內胞吞機制被吸收，常常位于內涵體中，被包封為微粒形式。
另外，根據發明的另一方面，可以通過一個簡單的體內試驗來檢測帶有特定主鏈的寡聚物是否具備所需的特性。在這個試驗中，被標記的化合物被給予動物，幾個小時后，取動物的體液樣本，檢測是否存在與靶RNA形成的異源雙螺旋。這個方法在下面D部分進行詳細說明。
A2.對RNA酶H的基本的抵抗力曾經有兩種常規的機理被提出，用以說明反義寡聚核苷酸如何抑制基因的表達(見e.g.，Agrawal et al.，1990；Bonham et al.，1995；and Boudvillain et al.，1997).首先，將寡核苷酸與病毒RNA間形成的異源雙螺旋作為RNA酶H(RNAse H)的底物，會導致病毒RNA的降解。屬于或推測屬于這一類寡核苷酸包括硫代磷酸脂，磷酸三脂，和磷酸二脂(沒有被修飾過的“自然”寡核苷酸)。然而，由于這樣的化合物會使病毒RNA暴露于寡聚物與RNA的雙螺旋結構之外，從而被RNAseH水解，失去雙螺旋結構，因此，它們并不適宜用在本發明中。
第二種寡聚核苷酸類似物，被稱為“空間阻斷劑”，或者是“無RNAseH活性”，或者稱為″抗RNAseH”，沒有被觀察到會被RNAseH作為底物，而是在空間上阻斷靶RNA的核質轉運、剪接和翻譯。這一種類包括甲基磷酸脂(Toulme et al.，1996)、嗎啉代寡聚核苷酸，肽核酸(PNA’s)、2-氧-丙烯基或2-氧-烷基修飾的寡聚核苷酸(Bonham，1995)，和N3’→P5’氨基磷酸脂(Gee，1998；Ding，1996)。
可以通過試驗來檢測寡聚物對RnaseH的耐受性用受試化合物形成RNA寡聚物雙螺旋，在標準試驗條件下，在有RNAseH的情況下溫育，如Stein et al所描述的那樣。當在RNAseH作用下時，完整雙螺旋的存在與否可以用凝膠電泳或質譜儀進行監控。
A3.體內吸收根據發明的另一方面，提供了一種簡單、迅速的檢測方法，可確定一種給定的反義寡聚物類型具有以上所指出的必要特性，即，高解旋溫度，能被宿主細胞主動吸收，以及對RnaseH具有基本的抵抗力。該方法基于這樣的發現，即將適當設計的反義化合物給予受試哺乳動物后，反義化合物會與病毒RNA靶序列的互補部分形成異源雙螺旋，隨后異源雙螺旋會出現在尿中(或其它體液中)。這個方法的詳細說明也在共同擁有的美國專利中給出，其申請序列號為09/736,920，標題為“檢測目標RNA的非侵入性診斷方法”(非侵入性診斷方法)。該專利在此引入以供參考。
簡要地說，為評估一個包含與已知RNA堿基序列相對應的受試寡聚物，該寡聚物將被注入到受試哺乳動物中。反義寡聚物可以針對任何細胞內的RNA，包括宿主RNA或引起感染的病毒RNA。給藥后幾個小時(典型的是8-72小時)，分析尿樣中是否存在由反義物和RNA形成的異源雙螺旋。如果檢測到異源雙螺旋，則該主鏈適合應用于本發明的反義寡聚物上。
為了便于隨后的分析，可以對受試寡聚物進行標記，如熒光或放射標記。只要這種標記適合受試哺乳動物即可。分析可以在任何適合的固相或液相中進行。通常，固相分析步驟首先是將異源雙螺旋分析物結合到固相負載物上，這個負載物可以是離子，或多聚物，或試驗帶的底物，然后檢測結合于其上的異源雙螺旋的存在/數量。對液相分析而言，典型情況下，應先對分析物樣本進行預處理，以去掉干擾樣本的成分。如果寡聚物已被標記，可以通過檢測標記物來證實異源雙螺旋的存在。對非標記的化合物，如果是以固相形式進行分析，則可以通過免疫測定來檢測異源雙螺旋的存在，或者，如果以溶液或懸浮液形式進行分析時，用質譜法或其它已知的方法進行檢測。
當反義寡聚物與病毒基因組中的病毒特異性區域(如以上所述的ORF1的翻譯開始區域)互補，這個方法也可以用于檢測是否存在特定的ssRNA病毒，或在進行治療時，用于檢測病毒數量的下降。
B.示范性的寡聚物主鏈圖4A-4H顯示了用在寡聚核苷酸類似物中非離子鍵合的例子。在這些圖中，B代表嘌呤或嘧啶堿基對部分，它能通過堿基特異性的氫鍵與多核苷酸中的堿基進行有效的結合，優選結合的堿基是腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤或尿嘧啶。適宜的主鏈結構包括碳酸鹽(4A，R＝O)和氨基甲酸鹽(4A，R＝NH2)鍵合(Mertes，1969；Gait，1974)；烷基磷酸脂和磷酸三脂鍵合(4B，R＝烷基或烷氧基)(Miller，1993；Lesnikowski，1990)；酰胺化合物鍵合(4C)(Bloomers，1994)；砜和氨磺酰鍵合(4D，R1，R2＝CH2)(Roughten，1995；McElroy，1994)；和硫乙酰鍵合(thioformacetyl linkage)(4E)(Matteucci，1990；Cross，1997)。據報道，后者能夠增強硫代反義化合物中雙螺旋和三螺旋的穩定性(Cross，1997)。此外，形如4F中的3’-亞甲基-N-甲基羥基氨(3’-methylene-N-methylhydroxyamino)化合物的結構(Mohan，1995)也曾經被報道過。
肽核酸(PNAs)(圖4G)是DNA的類似物，其主鏈與脫氧核糖的主鏈在結構上同形，包含N-(2-氨乙基)甘氨酸單元，并與嘧啶或嘌呤堿基相連。PNAs帶有天然的嘧啶和嘌呤堿基，能與互補的寡核苷酸雜交。與DNA相類似，其堿基對識別方式服從Watson-Crick的堿基配對原則(Egholm et al.，1993)。PNAs的主鏈是通過肽鍵而不是磷酸二脂鍵形成，這使它們適合于反義應用。由于其主鏈不帶電荷，使得PNA/DNA或PNA/RNA雙螺旋表現出比普通雙螺旋更強的熱穩定性。PNAs不能被核酸酶或蛋白酶識別。
正如以上描述的，優選的寡聚物結構是基于嗎啉代的亞基，帶有堿基對部分，由不帶電荷的鍵合結合起來。特別優選的是如圖4H和2B-B所闡述的，基本不帶電荷的二氨基磷酸脂鍵合嗎啉代寡聚物。嗎啉代寡聚核苷酸，包括反義寡聚物在共有的美國專利5,698,685,5,217,866，5,142,047，5,034,506，5,166,315，5,185,444，5,521,063，和5,506,337中有詳細的說明。在本發明中，所有這些專利都已清楚地編入參考文獻。
圖1A-E顯示了基于嗎啉代的亞基的重要特性，包括通過穩定的、不帶電荷的主鏈連接成寡聚物形式的能力；負載核酸堿基(如腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、鳥嘧啶)的能力，這些使該聚合物能與有互補堿基的靶核酸包括靶RNA進行雜交，即使所形成的雙螺旋寡聚物只有10-14個堿基長度，也具有高的解旋溫度；能被主動轉運進入哺乳動物細胞內；以及所形成的寡聚物和RNA的異源雙螺旋能抵抗RNAse的降解。
本發明中的反義寡聚核苷酸的示范性主鏈結構包括圖1A-E中所顯示的β-嗎啉代亞基類型，每個結構都是通過不帶電荷的含磷亞基連接的。圖1A表示一個含磷連接，形成五個原子的重復單元主鏈，在圖2A中，嗎啉代環通過磷酸酰氨1-原子進行連接。圖1B表示了一個6個原子的重復單元主鏈連接。在圖2B的結構中，連接嗎啉代5’碳原子和磷酸基團的原子Y可以是硫、氮、碳或首選是氧。磷下方的X部分可以是氟、烷基或被取代的烷基、烷氧基或被取代的烷氧基、硫代烷氧基或被取代的硫代烷氧基、或未取代、單基取代的、雙取代氮基團，包括環狀結構，如嗎啉或哌啶。烷基、烷氧基和硫代烷氧基適宜的是包括1-6個碳原子。Z部分是硫或氧，并且最好是氧。圖1C-E是為7個原子單元長的主鏈所設計的連接，其結構表示在圖2C-E中。在結構2C中，X部分與結構2B中的一樣，Y部分可以是亞甲基、硫或優選是氧。在結構2D中，X和Y部分結構與2B是一致的。在結構2E中，X部分和結構2B中的一樣，Y部分可以是硫、氧或NR，其中R是氫或低級烷基，首選氫或甲基。在圖2A-E中描述的所有亞基中，Z是氧或硫，每個Pi和Pj代表一個堿基對部分，最好從腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶中選擇。
特別適宜的嗎啉代寡聚核苷酸包括由圖2B顯示的嗎啉代亞基結構形式組成，其中X為NH2或N(CH3)2，Y為氧，Z為氧。
正如上面所指出的，包含有限的帶電鍵合的，基本不帶電荷的寡聚物更為優越，如可以每5個不帶電鍵合有1個帶電鍵合，更適宜的可以每10個不帶電鍵合有1個。因此少量的帶電鍵合，如帶電的磷酸酰氨或磷酸硫脂，也可以整合到寡聚物中。在嗎啉代寡聚物里，這樣的帶電鍵合可以被圖2A-E中的任一個鍵合所代表，其中X是氧化物(-O-)或硫化物(-S-).。
反義化合物可以通過逐步固相合成來準備，使用的方法詳見以上引證的參考文獻。有些情況下，為了有更好的效果，可在反義化合物中加上其它的化學成分，比如為了增進藥代動力或為了便于獲得或檢測化合物。這樣的化學成分中，最典型的是按照標準合成方法，以共價的方式結合到寡聚物的末端。例如，加上一個聚乙二醇或其它親水的聚合物，如一個有10-100單節的亞基，可以促進溶解。一個或更多的帶電基團，陰離子基團如有機酸，可以促進細胞吸收。為了檢測的目的加上一個報告成分，如熒光或放射基團。作為選擇，結合到寡聚物上的報告標記可以是一個配體，如能與已標記的抗體或鏈霉抗生物素蛋白結合的抗原或生物素。在選擇一個物質對反義寡聚物進行修飾或附加時，當然應選擇生物適應的，試驗動物能夠忍受，沒有不滿意的副作用的化學化合物。
V.抑制病毒復制上面詳述的反義化合物在阻斷小RNA病毒、杯狀病毒科、外衣病毒科和黃病毒科的ssRNA病毒復制是有效的。在一個實施方案中，這樣的阻斷在治療被這些病毒感染的宿主動物時是有效的。因此，方法包括，在一個具體體現中，當反義物接觸被病毒感染的細胞時，它能有效地阻斷特異病毒的第一開放閱讀框編碼的多蛋白的翻譯。在更進一步的具體體現中，反義制劑給予一個受試哺乳動物，如，被給定病毒感染的人或家養動物，反義制劑含適合的藥物載體，可以預期該反義寡聚核苷酸能阻止宿主中RNA病毒的生長。減少RNA病毒的數量或削弱病毒對于宿主正常生長和發育的有害影響到沒有或很少。
A.鑒定感染物質特定病毒引起的感染可以用這個領域已知的方法來確定，如血清或培養方法，或使用本發明的反義寡聚物的方法。
血清鑒定使用病毒樣本或從目標生物的生物樣品如大便、尿、脊髓液、血液等獲得病毒培養。檢測病毒的免疫測定通常是在這個領域的熟練技術人員使用的常規方法，如ELISA(酶聯免疫檢測)或Westernblot(蛋白-抗體雜交)。另外，針對特定病毒株或種進行檢測的特異單克隆抗體常常可通過商業途徑獲得。
培養方法可以用來分離和鑒定特定的病毒類型，所使用的技術包括，但不限于，對比其性狀如生長率和在各種培養條件下的形態。
另一種鑒定在被感染的受試者中的病毒感染因子的方法，是使用一種或多種能測定廣譜的科和/或屬病毒的反義寡聚物，如小RNA病毒、杯狀病毒科、外衣病毒科和黃病毒科。任何特有病毒RNA的序列都可被使用。理想的靶序列首選(i)對廣泛科/屬的病毒是共有的，和(ii)沒在人類中發現。大多數傳染性病毒的特有核酸序列可以在公共數據庫中獲得，作為特定寡聚物設計的基礎。
對于多數寡聚物，可進行下列的步驟(a)寡聚物被注入受試者；(b)在所述的注入后一個選定時間里，從受試者身上提取體液樣本；和(c)檢測樣本中是否存在由反義寡聚物和病毒基因組互補部分所形成的，核酸酶耐受的異源雙螺旋。步驟(a)-(c)至少對一個這樣的寡聚物進行，或根據鑒定病毒或病毒的科的需要執行多次。在寡聚物注入后，可以隨后就進行化驗，或更方便地是同時進行化驗。鑒定病毒是根據異源雙螺旋的存在或(缺如)，該核酸酶耐受的異源雙螺旋含有反義寡聚物和已知病毒或已知科病毒的基因組互補部分。
更適宜的是，先利用第一組具有廣泛科針對性的寡聚物，然后在廣泛的被鑒定的科/屬中，選擇具有特異屬和/或種和/或株互補的寡聚物。第二組寡聚物可在廣泛的被鑒定的科/屬中與特異的屬和/或種和/或株進行作用。通常，可以獲得幾個不同的第二寡聚物類，每一個都是從第一階段對廣泛的每一類病毒科/屬的檢測中獲得。選擇序列的依據是，(i)是特異的對被試驗的單個的屬/種/株，和(ii)沒在人類中發現。
B.反義寡聚物的給予將反義寡聚物有效地傳遞至目標核酸是治療的關鍵。根據本發明，反義寡聚物的遞送途徑包括，但不僅限于，各種全身途徑，包括口服和非腸道的途徑，如靜脈、皮下、腹膜內和肌肉給予，及吸入、經皮的和局部遞送。只要是在對受試者是適當的治療條件下，合適的途徑由該領域熟練的技術人員決定。如在治療皮膚的病毒感染時，給予反義寡聚物的適當途徑是局部給予，而對病毒引起的呼吸傳染進行治療時，給予反義寡聚物的適當途徑是吸入。寡聚物也可以直接用于病毒感染的位置，或給入到血流中。
反義寡聚物可用使用方便的、生理上可接受的載體給予。這樣的化合物可以包括許多這個領域里普通技術人員所使用的，標準的和公認的制藥載體。例如，包括，但不僅限于，鹽、磷酸鹽緩沖液(PBS)，水，水合乙醇，乳劑，如油/水乳劑或甘油三酸脂乳劑，片劑和膠囊劑。選擇適合的，生理上可接受的載體是可以變化的，這依賴于選擇合適的給藥方式。
在有些實例中，脂質體也應用于促進細胞對反義寡聚物的吸收。(如見Williams，S.A.，Leukemia 10(12)1980-1989，1996；Lappalainen et al.，Antiviral Res.23119，1994；Uhlmann et al.，ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDESA NEW THERAPEUTIC PRINCIPLE，Chemical Reviews，Volume 90，No.4，pages 544-584，1990；Gregoriadis，G.，Chapter 14，Liposomes，Drug Carriers in Biologyand Medicine，pp.287-341，Academic Press，1979)。水凝膠也可被用于給予反義寡聚核苷酸的載體，如在WO 93/01286專利中描述的。另外，寡聚核苷酸也可以微球體或微粒的形式給予。(見Wu，G.Y.andWu，C.H.，J.Biol.Chem.2624429-4432，1987)可以使用持續釋放的組合物。包括半透明多聚材料，做成形如膜或微囊的形狀。
方法的另一方面，受試者是人受試者，如一個被診斷為局部或全身病毒感染的人。病人的條件表明，本發明的反義寡聚物可以預防地給予。如在這樣的情況下，病人是(1)免疫缺陷；(2)是個燒傷病人；(3)有內置的導管；或(4)是將要進行手術或最近進行了手術的。在一個優選的具體體現中，寡聚物是二氨基嗎啉代寡聚物，含有一個制藥上可接受的載體，并以口服方式給藥。在另一個優選的具體體現中，寡聚物是二氨基嗎啉代寡聚物，含有一個制藥上可接受的載體，以靜脈注射方式給藥。
在另一個本方法的應用中，受試者是家畜，如雞、火雞、豬、牛或山羊等，治療可以是預防的或治療性的。本發明也包括在家畜或家禽的飼料成分里加入谷類食物添加劑，其中含有少于上述亞治療數量的抗病毒反義化合物。可以預期的是，應用上述含亞治療數量的抗病毒反義核酸化合物的谷類食物添加劑來喂養家畜和家禽，能改善應用含亞治療數量的抗病毒化合物的谷類食物添加劑喂養家畜和家禽的方法。
反義化合物一般以一定的數量和有效的方式給藥，可導致血液中濃度至少達到200-400nM。典型地，一個或更多劑量被給藥時，一般以規律的間隔，大概一到兩個星期一次。優選的口服劑量是每70kg1-25mg寡聚物。在有些情況下，對每個病人的劑量使用超過25mg寡聚物也是必須的。對靜脈注射給藥，優選的劑量是每70kg使用0.5mg到10mg。反義寡聚物可以在短期內規則地間斷給予，例如，在兩周內或更少時間內每天給予。然而，在有些情況下，寡聚物要在較長的時間內間斷給予。可以在給予抗生素或其它治療處理后，或同時給予寡聚物。治療方案可以根據需要來調整(劑量、頻率、途徑等)，主要調整依據是受試者在處理條件下的免疫測定、其它生物化學試驗和生理檢測的結果。
C.對處理的監測按照不同的持續時間、劑量、頻率、和給藥的途徑，及受試者在治療時的條件(如預防給藥相較于局部或全身的感染后給藥的反應)，本發明的反義寡聚核苷酸在體內治療方案的效果會發生變化。因此，為了達到最佳的治療結果，這樣的體內治療常常需要通過適當的試驗，來監測在治療中特定類型病毒的感染，并針對性地調整劑量或治療計劃。治療可以被監測，如通過普通的感染指示劑如全血計數(CBC)，核酸檢測方法，免疫診斷試驗，病毒培養，或異源雙螺旋檢測等方法來進行。
可以通過檢測生物樣本(組織、血、尿等)來決定通過體內注入本發明所述的反義寡聚物阻斷或減少一種或多種RNA病毒的生長的效果，這些樣本是從受試者在注入反義寡聚物前，期間和后取出的。對樣本的分析化驗包括(1)應用該領域專業技術人員已知的程序，如通過凝膠電泳遷移試驗檢測是否存在與靶或非靶序列形成的異源雙螺旋，(2)用標準技術如ELISA或Western blotting，檢測病毒蛋白質產生的數量，或(3)通過Spearman-Karber方法測量病毒滴度的影響(見，for example，Pari，G.S.et al.，Antimicrob.Agents andChemotherapy 39(5)1157-1161，1995；Anderson，K.P.et al.，Antimicrob.Agents and Chemotherapy 40(9)2004-2011，1996，Cottral，G.E.(ed)inManual of Standard Methods for VeterinaryMicrobiology，pp.60-93，1978)。
檢測反義物治療效果的首選方法是檢測反義物與RNA形成的異源雙螺旋。注入反義物后，在選擇的時間里，收集體液來檢測異源雙螺旋的存在和/或測量樣本中異源雙螺旋種類的數量。典型地，體液樣本在注入后3-24小時收集，更適宜的是注入后約6-24小時收集。如以上說明的，體液樣本可以是尿、唾液、血漿、血液、脊髓液，或其它生物來源的液體樣本，也可以包括細胞或懸浮在那里的細胞碎片，或液體媒介和它的溶質。收集的樣本數量一般在0.1到10ml范圍，首選約1ml到更少。
樣本可以先被處理，以去除不需要的成分和/或處理在樣本中的異源雙螺旋種類，去掉不需要的ssRNA突出端區域，如用RNA酶進行處理。當然，由于通過電泳或質譜來測定異源雙螺旋是根據其在分離中分子的大小來進行的，去掉突出端就特別地重要。
可以使用多種方法從樣本中去掉不需要的成分。例如，由于異源雙螺旋帶凈負電荷，電泳或離子交換技術就可以用來將異源雙螺旋從中性或陽性物質中分離出來。樣本也可以和帶有表面結合抗體或其它能特異性結合異源雙螺旋物質的固體柱接觸。在洗脫掉立柱上未發生結合的物質后，異源雙螺旋就能以充分的純化形式釋放，以備通過電泳、質譜分析或免疫測定進行進一步的分析。
實施例以下例子說明但并不打算在任何方面限制該發明。
材料與方法標準重組DNA技術被用于所有的構建當中，這些技術在以下文獻中有詳細說明(Ausubel，FM et al.，in CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley and Sons，Inc.，Media，Pa.，1992and Sambrook，J.et al.，in MOLECULAR CLONINGA LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，Vol.2，1989)。
實施例1反義物在體外抑制小RNA病毒(人鼻病毒)與鼻病毒翻譯開始區域14序列相對應的二氨基磷酸嗎啉代寡聚物(PMO)對鼻病毒16的抑制效果被用于評價。按Summerton andWeller，1997所描述的方式，二氨基磷酸嗎啉代寡聚物(PMO)由AVIBioPharma(Corvallis，Oreg.)合成。全長的寡聚物純度超過90％，用反相高壓液體色譜法和MALDI TOF質譜法測定。在用于細胞培養前，將凍干的PMOs溶于消毒過的0.9％NaCl溶液中，并且通過0.2μm的Acrodisc過濾器(Gelman Sciences，Ann Arbor，Mich.)過濾。
PMO包含有以鼻病毒14為靶標的核酸序列，并且，相對于鼻病毒16的靶序列存在3個錯配。靶序列(GenBank NC001752 618-637；SEQ IDNO5)，和目標序列(序列識別號18)如下HRV-16TTGTTATCATGGGCGCTCAA序列識別號5HRV-14反義物GACACTAGTACCCGCGAGTC序列識別號18在此，粗體密碼是開始密碼子，錯配用下劃線表示。
將已培養了24小時的HeLa細胞在六孔平板上再生長24小時。在處理前，用沒有加血清的基本培養基(MEM)清洗單層細胞兩次，然后將成片單層細胞在加了5％牛血清、L-谷氨酸鹽、抗生素和重碳酸鈉的基本培養基中培養，溫度為37℃，5％的CO2和帶濕度的空氣。
將PMOs通過″scrape-loading″方法導入培養細胞，已知這種方法能運輸PMOs到80-90％的培養細胞中(Partridge et al.，1996)。用沒有血清的MEM將寡聚物稀釋到終濃度為20μm，在培養物中加入0.5ml的寡聚物-MEM溶液，在室溫下1分鐘后，用橡皮細胞刮棒刮去細胞。將細胞放回CO2恒溫箱中培養10分鐘，然后，加入8ml帶有小牛血清的MEM，并將其分散到已加入到96孔板中，其內已含有對數期生長的鼻病毒16的稀釋物(每份稀釋物8個孔)，每個孔0.1ml。平板在CO2培養箱中37度培養72小時，然后，用Olympus CK光學顯微鏡檢查是否存在細胞病理學影響。病毒滴度用Spearman-Karber方法檢測。不同處理組的病毒滴度表示在下面的表6，并以圖5表示。
表.6

結果表明，當用PMO反義物處理HRV-14時，有超過75％的HRV-16病毒滴度被抑制，正如以前研究所證實的那樣，這個效果低于針對鼻病毒16的感染的以鼻病毒16為靶序列的效果，符合三個錯配堿基對的期望結果，研究證實了與HRV-16基因組翻譯開始區域完全互補的PMOs的抗病毒效果。
實施例2反義物阻斷從豬腎(PK-15)和非洲綠猴腎(Vero)組織培養的病毒杯狀病毒囊病毒PCV Pan-1株和SMSV-13株評估了三個二氨基磷酸嗎啉代寡聚物(PMO)的抗病毒效果，它們針對杯狀病毒科囊病毒屬株系Pan-1和SMSV-13中的ORF1翻譯開始區域。PMOs通過scrape-loaded到兩種宿主細胞中，即豬腎細胞(PK-15)(ATCC No.CCL33)和非洲綠猴腎細胞(ATCC No.CCL81)(Vero)，如上所述。宿主細胞隨后暴露在囊病毒Pan-1和SMSV-13中。病毒載荷的測量和培養按照例1的步驟進行。
對于這三條PMOs，每一條都包括與Pan-1序列(GenBank登記號.AF091736)ORF1起始區域互補的序列。PMOs在沒有血清的培養基中濃度為20.μm。一個鹽空白和序列雜亂的PMO被用于作為對照實驗。PMO序列被確定為ORF1.1(序列識別號27)，ORF1.2(序列識別號28)，和ORF1.3(序列識別號29)，靶點位置列在下面的表7當中。
表7.寡聚體序列和靶位點

表8展示了PMOs對病毒株系SMSV-13和Pan-1在PK-15和Vero細胞內的滴度的抑制效果。當兩種細胞類型用于檢測給定的病毒株時，給出了一個簡單的抑制平均百分數。
表8.反義PMOs對囊病毒SMSV-13株和PVC Pan-1株在PK-15和Vero宿主細胞中的病毒滴度的影響

在兩種細胞系和對兩種病毒血清型中，均發現以ORF1為靶的PMOs具有顯著的抑制作用，″ORF1.1″最有效。而作為對照的，序列雜亂的PMO則沒有抑制效果。
在劑量效應研究中，Vero細胞中加入了含有以ORF1.1和ORF1.3為靶的PMO序列，隨后將其暴露在囊病毒株SMSV-13里，接下來的步驟按例1所描述的方法進行。用ORF1.1 PMO處理都在濃度為0.2和1.0μm下沒有抑制作用，在濃度為2.0μm時被中度抑制，在20μm時被高度抑制。而ORF1.3 PMO在濃度為0.2μm時對SMSV-13的病毒濃度沒有抑制作用，但在濃度為1.0μm時表現出有高的抑制作用；在濃度為210，and 20μm時沒有觀察到抑制作用的加強。
實施例3PMO反義物對貓科動物杯狀病毒的作用貓科動物的杯狀病毒成為貓出血病毒。病毒被分離，并在細胞培養物上繁殖。細胞培養物被暴露于病毒中，接著按例1所描述的步驟進行檢測，反義PMO有下列的靶序列CAG AGT TTG AGA CAT TGT CTC(序列識別號32)。在細胞培養物中觀察到一個對數級病毒滴度的減少。
實施例4反義PMO在三聯小鼠(trimera mice)中針對HCV病毒血癥的作用研究動物是從Harlan Inc.獲得的無菌雌性CB6F1和重度聯合免疫缺陷(SCID)/米色小鼠(在Weizmann學院動物飼養中心飼養和繁殖)。小鼠居住在特定的無菌環境中；在研究開始前允許給予經過消毒的食物和酸化的水。
CB6F1小鼠在7-9周時做去除胸腺手術。試驗在CB6F1小鼠12-18周(19-25g/每只)大時進行。在異體移植前，CB6F1小鼠接受一份劑量的gamma射線的全身照射(4Gy一天后11Gy)(戈瑞Gy＝100rad.)，射線由150-A60Co產生(加拿大原子能)，放射率為0.7Gy/分鐘。在第一次照射后，ciprofloxacin(20μg/ml；Bayer)加入飲用水中7-10天。在第二次放射劑量后，立刻給小鼠靜脈注射4-6×106的6-10周大的SCID/米色小鼠的骨髓細胞(在0.2ml磷酸緩沖鹽溶液中)。
CB6F1用10mg/只的2，2，2三溴乙醇(Aldrich)麻醉，進行剖腹手術。在體外被感染了丙型肝炎病毒(HCV)的人肝碎片移植到耳翼后。傷口用9毫米的自動傷口夾封閉。
小鼠用PMO反義物處理，該反義物有相對于HCV核酸序列中從AUG起始位點到第一開放閱讀框的目標序列GTG CTC ATG GTG CAG GGT C(序列識別號35)。在移植后的第10-第17天，用反義物或鹽進行處理(總共7天)，小鼠分為4個組，每個組大約為17只。PMO的劑量分別為0.01，0.03和0.1mg/只/天。在第16天(處理完成后的一天)和第21天取血，對血清進行分析。
結果總結在表9中，并用圖表示在圖6中。病毒載荷＝平均病毒載荷±標準差(HCV-RNA份/ml血清)。對照組和處理組中，小鼠的HCV感染陽性的百分比用卡方進行比較分析。對照組和試驗組小鼠中病毒載荷的差異用非參數Mann-Whitney U對比檢測。
表9.體內反義物劑量—效應研究

如前所述，在此描述的本發明的特定具體化是為了更好地闡述發明，但在不偏離本發明的精神和范圍內可以進行多種修改。因此，除非權利要求提及，本發明在權利要求范圍內不被限制。
表10.序列列表


序列表<110>AVI生物制藥公司<120>用于治療單鏈RNA病毒感染的抗病毒反義核酸的試劑和方法<130>504508046W00<140>Not Yet Assigned<141>Filed Herewith<150>US 60/329,815<151>2001-10-16<160>36<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>20<212>DNA<213>脊髓灰質炎病毒Mahoney株<400>1gtatcataat gggtgctcag20<210>2<211>20<212>DNA<213>脊髓灰質炎病毒Sabin株<400>2gtatcataat gggtgctcag20<210>3<211>24<212>DNA<213>甲肝病毒<400>3aataatgaac atgtctagac aagg 24
<210>4<211>20<212>DNA<213>鼻病毒14<400>4ctgtgatcat gggcgctcag 20<210>5<211>20<212>DNA<213>鼻病毒16<400>5ttgttatcat gggcgctcaa 20<210>6<211>20<212>DNA<213>鼻病毒1B<400>6ttggcatcat gggtgcccag 20<210>7<211>22<212>DNA<213>口瘡病毒<400>7caatgagcac aactgactgt tt 22<210>8<211>26<212>DNA<213>口瘡病毒<400>8gaccctatga atacaactga ctgttt 26<210>9<211>20<212>DNA<213>柯薩奇病毒
<400>9caacaaaatg ggggctcaag 20<210>10<211>34<212>DNA<213>囊病毒(Pan-1)<400>10gtaaatgaga atttgagcta tggctcaaac gctc 34<210>11<211>20<212>DNA<213>豬腸道杯狀病毒<400>11cgtgatggct aattgccgtc 20<210>12<211>19<212>DNA<213>諾沃克病毒<400>12gtgaatgatg atggcgtcg 19<210>13<211>24<212>DNA<213>戊肝病毒<400>13tggaggccca tcagtttatt aagg24<210>14<211>18<212>DNA<213>丙肝病毒<400>14gccatggagg cccatcag 18
<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>15gaccgtgcac catgagcac 19<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>16cctgagcacc cattatgata c21<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>17ccttgtctag acatgttcat tatt 24<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>18ctgagcgccc atgatcacag 20
<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>19ttgagcgccc atgataacaa 20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>20ctgggcaccc atgatgccaa 20<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>21aaacagtcag ttgtgctcat tg 22<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>22aaacagtcag ttgtattcat ag 22
<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>23cttgagctcc cattttgctg 20<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>24cttgagcccc catttttgtt g 21<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>25cctgtgctcc catcttgatg 20<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>26tgggtgggat caacccacag gctgttttaa 30
<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>27gagccatagc tcaaattctc20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>28tagctcaaat tctcatttac20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>29gagcgtttga gccatagctc20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>30gacggcaatt agccatcacg20
<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>31cgacgccatc atcattcac 19<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>32cagagtttga gacattgtct c 21<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>33ccttaataaa ctgatgggcc tcc23<210>34<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>34ctgatgggcc tccatggc 18
<210>35<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的反義寡聚體<400>35gtgctcatgg tgcacggtc 19<210>36<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>混合對照序列<400>36gacatatcta atcatatac19
權利要求
1.一種針對來源于小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒科的RNA病毒抗病毒化合物，所述的病毒有單鏈、少于12kb的正義基因組，和一個編碼含多種功能蛋白質的多蛋白的第一開放閱讀框，所述的化合物含有有(a)一條12-40個嗎啉代亞基的序列，負載一個目標堿基序列與跨越所述的第一開放閱讀框的翻譯開始區域的病毒靶序列基本互補，和(b)一條基本不帶電荷的主鏈的嗎啉代寡聚物。
2.權利要求1的化合物，其中的亞基是通過不帶電荷的、含磷的亞基間鍵合將一個亞基的嗎啉代的氮與相鄰亞基的5’外環碳連接起來的。
3.權利要求2的化合物，其中所述的亞基間鍵合是二氨基磷酸鹽連接。
4.權利要求3的化合物，其中所述的嗎啉代亞基是根據下面的結構通過二氨基磷酸鹽鍵合連接的 其中Y1＝O，Z＝O，Pj是通過堿基特異性氫鍵有效地與多核苷酸中的一個堿基相結合的嘌呤或嘧啶堿基對部分，X是烷基、烷氧基、硫代烷氧基或烷基氨。
5.權利要求4的化合物，其中X＝NR2，其中每一R是獨立的氫或甲基。
6.權利要求1的化合物，其中所述的寡聚物在與所述的病毒靶序列結合后的Tm超過50℃，且所述的化合物被哺乳動物細胞主動吸收。
7.權利要求1的化合物，直接針對小RNA病毒，具有一條至少與序列組中選出的序列有至少90％的同源性的目標序列，這個組包括(i)對脊髓灰質炎病毒的Mahoney和Sabin株的序列識別號16，(ii)對甲型肝炎病毒的序列識別號17，(iii)對鼻病毒14的序列識別號18，(iv)對鼻病毒16的序列識別號19，(v)對鼻病毒1B的序列識別號20，(vi)對口瘡病毒的序列識別號21和22，和(vii)對柯薩奇病毒的序列識別號23、24和25。
8.權利要求7的化合物，直接針對人鼻病毒16，具有序列識別號18或19表示的目標序列。
9.權利要求1的化合物，直接針對杯狀病毒，具有一條至少與序列組中選出的序列有90％的同源性的目標序列，這個組包括(i)對囊病毒的Pan-1血清型的序列識別號27、28和29，(ii)對豬的囊病毒的序列識別號30，(iii)對諾沃克病毒的序列識別號31，和(iv)對貓的囊病毒的序列識別號32。
10.權利要求9的化合物，直接針對囊病毒的Pan-1血清型，其中寡聚物是二氨基磷酸鹽鍵合的嗎啉代寡聚物，有一條是從序列識別號27，28和29組成的序列組中選出的目標序列。
11.權利要求9的化合物，直接針對貓的囊病毒，其中寡聚物是二氨基磷酸鹽鍵合的嗎啉代寡聚物，目標序列的序列識別號為32。
12.權利要求1的化合物，直接針對戊型肝炎病毒，有一條至少與選自序列識別號33和34的序列有90％的同源性的目標序列。
13.權利要求12的化合物，其中寡聚物是二氨基磷酸鹽鍵合的嗎啉代寡聚物，具有一條選自序列識別號33和34的目標序列。
14.權利要求1的化合物，直接針對丙型肝炎黃病毒，有一條至少與序列識別號為35的序列有90％的同源性的目標序列。
15.權利要求14的化合物，其中寡聚物是二氨基磷酸鹽鍵合的目標序列序列識別號為35的嗎啉代寡聚物。
16.權利要求1的化合物，其中所述的寡聚物能以由寡聚物與所述的RNA病毒的病毒基因組的互補部分組成的異源雙螺旋形式，其可以在給予所述的受試者寡聚物的幾小時后在受試哺乳動物的血清或尿中發現。
17.一種抑制來源于小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒科的RNA病毒復制的方法，所述的病毒有單鏈、少于12kb的正義基因組，和一個編碼含多種功能蛋白質的多蛋白的第一開放閱讀框，該方法包括將所述的病毒暴露在嗎啉代寡聚物中，嗎啉代寡聚物有(a)一條12-40個嗎啉代亞基的序列，其負載與跨越所述的第一開放閱讀框的翻譯開始區域的病毒靶序列基本互補的目標堿基序列，和(b)一條基本不帶電荷的主鏈。
18.權利要求17的方法，其中所述的寡聚物被給予所說病毒感染過的受試哺乳動物。
19.權利要求17的方法，其中所述的寡聚物能以由寡聚物與所述的RNA病毒的病毒基因組的互補部分組成的異源雙螺旋形式，在受試哺乳動物的血清或尿中發現，在寡聚物被給予所述的受試者幾小時后。
20.權利要求17的方法，其中的寡聚物有不帶電荷的、含磷的亞基間鍵合，其將一個亞基的嗎啉代的氮與相鄰亞基的5’外環碳連接起來。
21.權利要求20的方法，其中所述的亞基間鍵合是二氨基磷酸鹽鍵合。
22.權利要求21的方法，其中所述的嗎啉代亞基是按照下面的結構通過二氨基磷酸鹽鍵合連接的 其中Y1＝O，Z＝O，Pj是通過堿基特異性氫鍵有效地與多核苷酸中的一個堿基相結合的嘌呤或嘧啶堿基對部分，X是烷基、烷氧基、硫代烷氧基或烷基氨。
23.權利要求22的方法，其中X＝NR2，這里每個R獨立為氫或甲基。
24.權利要求17的方法，其用于抑制小RNA病毒的復制，其中所述的目標序列至少與由以下組成的組中選擇的一條序列有90％的同源性，這個組包括(i)序列識別號16，對脊髓灰質炎病毒的Mahoney and Sabin株，(ii)對甲型肝炎病毒的序列識別號17，(iii)對鼻病毒14的序列識別號18，(iv)對鼻病毒16的序列識別號19，(v)對鼻病毒1B的序列識別號20，(vi)對口瘡病毒的序列識別號21和22，和(vii)對柯薩奇病毒的序列識別號23、24和25。
25.權利要求24的方法，其用于抑制人鼻病毒16的復制，其中所述的目標序列是序列識別號18或19，并且寡聚物是二氨基磷酸鹽連接的嗎啉代寡聚物。
26.權利要求17的方法，其用于抑制杯狀病毒的復制，其中所述的目標序列至少與序列組中選出的一條序列有90％的同源性，這個組包括(i)對囊病毒的Pan-1血清型的序列識別號27、28和29，(ii)對豬的囊病毒的序列識別號30，(iii)對諾沃克病毒的序列識別號31，和(iv)對貓的囊病毒的序列識別號32。
27.權利要求26的方法，其用于抑制囊病毒的Pan-1血清型復制，其中目標序列選自序列識別號27，28和29，并且寡聚物是二氨基磷酸鹽鍵合的嗎啉代寡聚物。
28.權利要求26的方法，其用于抑制貓的囊病毒復制，其中目標序列為序列識別號32，且寡聚物是二氨基磷酸鹽鍵合的嗎啉代寡聚物。
29.權利要求17的方法，其用于抑制戊型肝炎病毒復制，其中目標序列至少與選自序列識別號33和34的序列有90％的同源性，且寡聚物是二氨基磷酸鹽鍵合的嗎啉代寡聚物。
30.權利要求17的方法，其用于抑制丙型肝炎黃病毒的復制，其中目標序列至少與序列識別號為35的序列有90％的同源性，且寡聚物是二氨基磷酸鹽鍵合的嗎啉代寡聚物。
31.權利要求17的方法，其中所述的寡聚物在與所述的病毒靶序列結合后的Tm超過50℃，且能被哺乳動物細胞主動吸收。
32.一種證實感染了受試哺乳動物的小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒和針對感染病毒的反義寡聚物間存在有效的相互作用的方法，包括(a)將所述的寡聚物給予受試者，其中所述的寡聚物有一條12-40個嗎啉代亞基的序列，其負載一個與跨越所述的感染病毒的第一開放閱讀框的翻譯開始區域的病毒靶序列基本互補的目標堿基序列，(b)在所述的給予后一個選定的時間，獲取受試者的體液樣本；并且(c)化驗樣本中是否存在含有反義寡聚物和所說病毒靶序列的互補部分的核酸酶耐受的異源雙螺旋。
33.權利要求32的方法，其中寡聚物有不帶電荷的、含磷的亞基間鍵合，其將一個亞基的嗎啉代的氮與相鄰亞基的5’外環碳連接起來。
34.權利要求33的方法，其中的鍵合是二氨基磷酸鹽連接。
35.權利要求32的方法，其用于確定通過給予所述的寡聚物確定治療小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒感染的效果，其中所述的給予、獲取和化驗在整個治療期間是以周期性的間隔來操作的。
36.一種確定感染小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒的科或屬的方法，該方法包括(a)提供各種反義寡聚物，每個所述的寡聚物都有一個與多種已知病毒的病毒靶序列基本互補的堿基序列，所述的多種已知病毒選自小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒，其中每個所述的病毒靶序列是(i)對一個病毒科或屬是共同的，和(ii)沒有在人類中發現；(b)將多種寡聚物中的至少一種給予受試者，(c)在所述的給予后一個選定的時間，從受試者身上獲取體液樣本；(d)分析樣本中是否存在含有反義寡聚物和病毒靶序列的互補部分的能抵抗核酸酶的異源雙螺旋，和(e)根據含有給予的反義寡聚物和所述的病毒靶堿基序列的互補部分的異源雙螺旋的存在或缺如，確定感染病毒的科或屬。
37.權利要求36的方法，其用于確定特異的感染的小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒或黃病毒，更進一步包括(a)提供第二類的反義寡聚物，每個所述的寡聚物都有一個與步驟(e)中確定的科或屬的多種已知病毒中的一種的病毒靶序列基本互補的堿基序列，其中每個所述的病毒靶序列是(i)對一種所述的已知病毒是特異性的，和(ii)沒有在人類中發現；(b)將多種寡聚物中的至少一種給予受試者，(c)在所述的給予后一個選定的時間，從受試者獲取體液樣本；(d)分析樣本中是否存在含有反義寡聚物和病毒靶序列的互補部分的能抵抗核酸酶的異源雙螺旋，和(e)根據含有給予的反義寡聚物和所述的病毒靶堿基序列的互補部分的異源雙螺旋的存在或缺如，確定感染的病毒。
全文摘要
本發明提供了一種反義抗病毒化合物和方法，在處理病毒感染時，用于抑制來源于小RNA病毒、杯狀病毒、外衣病毒、黃病毒科的病毒的生長。這種反義抗病毒化合物是基本不帶電荷的寡聚物，有與跨越了病毒基因組第一開放閱讀框的AUG起始位點的病毒靶序列基本互補的目標堿基序列。
文檔編號A61K38/00GK1604906SQ02820560
公開日2005年4月6日 申請日期2002年10月16日 優先權日2001年10月16日
發明者D·A·斯坦, D·E·斯基林, P·L·艾弗森, A·W·史密斯 申請人:Avi生物制藥公司