專利名稱：新的糖脂及其作為有效成分的用于自體免疫疾病的藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的糖脂及其作為有效成分的用于自體免疫疾病的藥物。
背景技術：
活體具有預防和抑制自體免疫疾病發生的功能，且這種功能稱為“免疫調節功能”。NKT細胞近來作為一種具有“免疫調節功能”的淋巴細胞引起關注(Saishin Igaku Vol.55，No.4，pp.858-863)。本發明的發明人已致力于開發作用于NKT細胞的藥物(適宜地刺激NKT細胞并有效地表達它們的免疫調節功能的藥物)。
自體免疫疾病的常規治療方法主要集中在涉及糖皮質激素和免疫抑制劑的“非特異性免疫抑制治療”。“非特異性免疫抑制治療”指抑制免疫細胞的多種生物功能且沒有特定的選擇性和差別的治療方法。因此，這些治療方法抑制誘導和加重疾病的生物反應，但它們也抑制活體所需的生物反應(副作用)。因此，特異性免疫抑制劑(僅抑制誘導和加重疾病的生物反應的藥物試劑)的開發是迫切需要的。近來意在實現此目標地測定了自體抗原肽治療。但是，由于肽表現為具有個體差異的主要組織相容性基因復合體(MHC)分子，因此效力上的差別隨個體變化而發生巨大變化，而且變態反應也造成問題。
α-半乳糖神經酰胺已被其它研究者鑒定為一種能夠刺激NKT細胞的物質[Science，Vol.278，pp.1626-1629(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.95，pp.5690-5693(1998)，J.Med.Chem.1995，38，pp.2176-2187，特開平5-9193，特開平5-59081，特許第3088461號和美國專利5936076]。本發明的發明人將這些出版物所述的α-半乳糖神經酰胺給予如多發性硬化、實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)和膠原誘導的關節炎的動物模型、類風濕性關節炎動物模型以治療自體免疫疾病。但是，這種α-半乳糖神經酰胺誘導IL-4，一種抑制自體免疫疾病的細胞因子，和IFN-γ，一種加重自體免疫疾病的細胞因子。因此，發現這種α-半乳糖神經酰胺對自體免疫疾病的抑制或治療完全無效。(American Immunology Society Journal，the Journal of Immunology，2001年1月1日，第166卷，第662-669頁)。也就是說，常規的α-半乳糖神經酰胺不是一種適宜的用于自體免疫疾病的藥物，因為它誘導同時表現出NKT細胞的沖突功能(抑制疾病的功能和加重疾病的功能)。
本發明要解決的問題本發明的目的是提供用于治療自體免疫疾病的糖脂。雖然以前為這種目的的研究中清楚地確認α-半乳糖神經酰胺具有刺激NKT細胞的能力，但它的作用是非特異性的，且它還加重自體免疫疾病。因此，它作為這樣一種藥物是非常不令人滿意的。但是，本發明的糖脂誘導抑制自體免疫疾病的特異性細胞因子，且不誘導其它加重自體免疫疾病的因子。因此，它們極有效地治療自體免疫疾病。
解決問題的手段本發明合成了多種糖脂，它們是常規α-半乳糖神經酰胺的衍生物，并測定了它們的生物活性。結果是，本發明的發明人發現，通過修飾這些糖脂以縮短鞘氨醇堿基中碳鏈的長度而獲得的物質表現出僅誘導用于抑制自體免疫疾病的功能(產生IL-4)的能力，它與NKT細胞所具有的能力相同。給予該衍生物以治療EAE，多發性硬化的動物模型，并證明其對EAE具有預防和治療作用。
也就是說，本發明提供一種由以下所示的式(I)代表的糖脂。
在此式中，R1為吡喃醛糖基。作為這種吡喃醛糖基，可以提及α-D-糖基、α-D-半乳糖基、α-D-甘露糖基、β-D-葡糖基、3-D-半乳糖基、β-D-甘露糖基、2-去氧-2-氨基-α-D-半乳糖基、2-去氧-2-氨基-β-D-半乳糖基、2-去氧-2-乙酰氨基-α-D-半乳糖基、2-去氧-2-乙酰氨基-β-D-半乳糖基、β-D-阿洛吡喃糖基、β-D-altropyranosyl、β-D-艾杜糖基等等，而α-異構體更有效地作為本發明的糖脂。其中，下式代表的α-D-吡喃半乳糖基優選作為R1。
R2代表氫原子或羥基，并優選氫原子。
R3代表-CH2-、-CH(OH)-CH2-或-CH＝CH-，優選-CH2-或-CH(OH)-CH2-，最優選-CH(OH)-CH2-。
R4代表氫原子或CH3，優選氫原子。
x為0-35，優選0-26，更優選11-26，進一步更優選11-23，最優選18-23。
y和z代表滿足y+z＝0-3的整數。這里，-(CH2)y(CH(CH3))z-不意指(CH2)和(CH(CH3))以此順序排列，而僅指簡單的數量關系。例如，-(CH2)y(CH(CH3))z-代表-CH(CH3)CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-或-CH2CH2CH(CH3)-中的一種，其中y＝2和z＝1。此外，y和z優選z＝0而y＝0-3，更優選z＝0而y＝1-3。
本發明提供包含這些糖脂作為有效成分的用于治療自體免疫疾病的藥物。此外，它提供包含這些糖脂作為有效成分的用于治療Th1/Th2免疫平衡偏向Th1的疾病或Th1細胞加重病癥的疾病的藥物。而且，本發明提供包含這些糖脂作為有效成分的選擇性IL-4產生誘導劑。
附圖的簡要說明

圖1和2顯示本發明的糖脂[式(I)]的制備方法的一個實例。在此圖中，R1代表吡喃醛糖基，R2代表氫原子或羥基，R3代表-CH2-、-CH(OH)-CH2-或-CH＝CH-，R4代表氫原子或甲基，x代表0-35的整數，y+z為0-3的整數，R5代表氫原子、甲基或-(CH2)y’(CH(CH3))z’-CH(R4)2(其中y’+z’為0-2的整數)，R6代表氫原子或甲基，而R7代表吡喃醛糖，其中的官能基如羥基和氨基被適宜地保護。
圖3為表示實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)抑制研究的結果的圖。
圖4為表示膠原誘導的關節炎(CIA)抑制研究的結果的圖。
圖5表示NOD小鼠的糖尿病發作抑制試驗結果。
圖6為表示血清細胞因子測定結果的圖。
圖7為表示脾細胞增殖反應測定結果的圖。
圖8為表示脾細胞細胞因子產生測定結果的圖。柱形圖的右坐標軸代表IL-4，而左坐標軸代表IFN-γ。
圖9表示脾細胞增殖反應測定和細胞因子測定的結果。
圖10為表示血清抗MOG抗體測定結果的圖。該圖的右坐標軸代表IgG1，而左坐標軸代表IgG2a。
發明的詳細描述自體免疫疾病可以分成全身自體免疫疾病和器官特異性自體免疫疾病。其中器官特異性自體免疫疾病導致特定器官或組織(腦、肝、眼和關節)的慢性炎癥，其原因歸結于對各器官特異性的針對自身抗原的免疫反應(自體免疫反應)。多發性硬化(影響腦和脊索)和類風濕性關節炎(影響關節)是典型的該疾病的實例。這些疾病具有許多共同的特征，雖然受影響的器官不同，且其治療方法也包含基本共同特性。在它們中的許多中，產生IFN-γ的T細胞起重要的作用。
NKT細胞是具有NK和T細胞性質的淋巴細胞，并識別通過T細胞抗原受體結合于CD1d分子的糖脂。
NKT細胞表達生理功能，如(a)抗腫瘤活性(腫瘤細胞消除作用)，(b)IFN-γ產生和(c)IL-4產生，以及(d)加強NK細胞活性的功能，和(e)活化巨噬細胞的功能。(d)和(e)均由產生的IFN-γ誘導。也就是說，(a)、(b)和(c)是NKT細胞的直接作用，而(d)和(e)是通過(b)誘導的間接作用。
常規的α-半乳糖神經酰胺是非常有力的活化NKT細胞并誘導所有作用(a)至(e)的免疫刺激劑。這里，常規的α-半乳糖神經酰胺指其鞘氨醇堿基中具有比本發明的糖脂更長的碳鏈的物質。例如，它指在后面所述的實施例中用作對比的糖脂以及在以下文獻中所述的糖脂Science，Vol.278，pp.1626-1629(1 997)，Proc.National AcademyScience USA Vol.95，pp.5690-5693(1998)，特開平5-9193，特開平5-59081和美國專利5936076。在所誘導的性質中，(c)IL-4產生有效地抑制自體免疫疾病，但(b)IFN-γ產生加重自體免疫疾病，因而彼此抵消并使之對自體免疫疾病的治療無效。此外，對應的由常規α-半乳糖神經酰胺刺激的NKT細胞的數目通過細胞凋亡而立即消失。相反，本發明的糖脂具有比常規的α-半乳糖神經酰胺更弱的免疫活性化作用，并選擇性誘導NKT細胞功能的(c)IL-4產生。由于避免了IFN-γ衍生，本發明的糖脂可以產生抑制和治療器官特異性自體免疫疾病的作用。此外，本發明的糖脂的優越之處是它們不誘導NKT細胞凋亡。
近年來正進行關于NKT細胞抗原受體、糖脂和CD1d分子之間的相互作用的研究。(參見Immunological Review Journal，1999，Vol.172，pp.285-296)。目前，認為由糖脂的鞘氨醇堿基和脂肪酸衍生的兩個疏水碳鏈片段深深地鉆入CD1d分子中的兩個溝(袋)內以建立連接，且認為親水糖基片段與NKT細胞抗原受體結合。本發明的糖脂的鞘氨醇堿基中的碳鏈比常規的α-半乳糖神經酰胺的碳鏈短，且與CD1d分子的結合更弱。結果是，糖基片段穩定性降低，而傳遞至抗原受體的信號的性質改變。另一個誘導的結果是選擇性IL-4產生。本發明的糖脂的作用不對應于任何劑量的α-半乳糖神經酰胺的作用，且推斷它們是實質上不同的配體。[參考后文中所述的實施例和公開的論文(Nature，Vol.413，No.6855，pp.531-534(2001)]本發明的糖脂由上式(I)代表。例如可以提及(1)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-三十烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(2)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十九烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(3)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十八烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(4)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十七烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(5)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(6)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十五烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(7)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(8)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十三烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(9)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十二烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(10)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十一烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(11)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(12)(2S，3S，4R)-1-0-(α-D-半乳糖基)-2-(N-十九烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇、(13)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-三十烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(14)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十九烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(15)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十八烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(16)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十七烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(17)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(18)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十五烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(19)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(20)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十三烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(21)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十二烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(22)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十一烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(23)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(24)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-十九烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇、(25)(2S，3 S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-三十烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(26)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十九烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(27)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十八烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(28)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十七烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(29)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(30)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十五烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(31)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(32)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十三烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(33)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十二烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(34)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十一烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(35)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(36)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-十九烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇、(37)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-三十烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇、(38)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十九烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇、(39)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十八烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇、(40)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十七烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇、(41)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇、(42)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十五烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇、(43)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇、(44)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十三烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇、(45)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十二烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇、(46)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十一烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇、(47)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇和(48)(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-十九烷酰氨基)-1，3，4-己烷三醇。其中優選(3)-(9)、(15)-(21)、(27)-(33)和(39)-(45)。
本發明的糖脂可以使用各種方法制備，但它們可以根據諸如下述的方法制備。制備方法如圖1和2所示。也就是說，化合物(IIa)、(IIb)和(IIc)根據出版物(M.Morita等人，J.Med.Chem.，1995，38，2176等等)中公開的方法獲得，而將(IIa)和(IIb)的雙鍵部分還原以將它們轉化成化合物(IIIa)和(IIIb)。在將化合物(IIIa)、(IIIb)和(IIc)的仲羥基甲磺酰化或甲苯磺酰化之后，在將它們轉化成疊氮基時得到化合物(IV)，并通過將疊氮基選擇性還原成氨基然后進行酰胺形成反應而獲得化合物(V)。通過同時將化合物(V)中存在的作為仲羥基的保護基的芐基轉化成酰基如苯甲酰基和乙酰基，并從伯羥基中除去保護而獲得化合物(VI)。將化合物(VI)糖基化得到化合物(VII)，并可以通過除去殘留的保護基而獲得目標化合物(I)。
本發明的糖脂可以用作用于自體免疫疾病的藥物、用于Th1/Th2免疫平衡偏向Th1的疾病的藥物，或用于Th1細胞加重病癥的疾病的藥物、還作為選擇性IL-4產生誘導劑。這里自體免疫疾病意指多發性硬化、類風濕性關節炎、銀屑病、克羅恩氏病、尋常性白斑、白塞病、膠原病、I型糖尿病、葡萄膜炎、干燥綜合征、自體免疫型心肌炎、自體免疫肝病、自體免疫胃炎、天皰瘡、吉-巴綜合征、HTLV-1相關的脊髓病等等。此外、Th1/Th2免疫平衡偏向Th1的疾病指自體免疫疾病如多發性硬化、類風濕性關節炎、銀屑病、I型糖尿病、葡萄膜炎、干燥綜合征等以及與細胞免疫有關的疾病如急性肝炎、移植排斥、由細胞內感染性病體導致的感染等。
本發明的糖脂[(式(I)]具有低毒性。例如10組5周齡大的小鼠全部存活，這些小鼠在四個月的實驗中每周接受兩次300μg/kg化合物25的腹膜內給藥。本發明的糖脂(I)可以單獨給藥，但如果需要的話它們可以與配方中的通常藥理學上耐受的己知的載體一起給藥，其目的是改善和治療由自體免疫疾病或Th1/Th2免疫平衡偏向Th1的疾病或Th1細胞加重病癥的疾病的癥狀。例如，有效成分本身可以口服或非口服給藥，或者在適宜地形成膠囊、片劑或注射劑時與常用的賦形劑一起給藥。例如，通過將原料粉末與賦形劑如乳糖、淀粉或其衍生物、纖維素衍生物等混合并裝入明膠膠囊中而制備膠囊。除了上述賦形劑之外，將粘合劑如羧甲基纖維素鈉鹽、海藻酸、阿拉伯膠等和水加到有效成分中，捏合混合物并在需要時制粒，然后加入潤滑劑如滑石和硬脂酸，并使用常規的沖壓機形成片劑。對于注射劑，當應用注射的非口服給藥時，將有效成分與溶解助劑一起溶于無菌蒸餾水或無菌的生理鹽水溶液中，并密封在安瓿中以得到注射配方。如果需要的話可以存在穩定劑和緩沖物質。
本發明的醫藥、自體免疫疾病或Th1/Th2免疫平衡偏向Th1的疾病的改善、藥物和IL-4誘導劑的劑量取決于多種因素，例如患者的癥狀和年齡、給藥途徑、配方類型和給藥次數。但是，通常0.001mg-5000mg/日/人是合適的，優選0.01mg-500mg/日/人，更優選0.5mg-100mg/日/人。
發明效果本發明的糖脂是通過有效地刺激NKT細胞的免疫調節能力而治療自體免疫疾病的第一種藥物。此外，本發明的糖脂是證明具有自體免疫疾病抑制作用的第一種糖脂。而且，本發明的糖脂由于它們僅選擇性誘導NKT細胞的自體免疫疾病治療功能，因而是極具革命性的藥物。
本發明的糖脂可以即時用作用于可以通過IL-4水平抑制的自體免疫疾病的藥物。此外，IL-4用于促進抗體產生，并可以用作在疫苗治療中的助劑。而且，認為本發明的糖脂在與例如肝炎病毒疫苗一起給予在升高它們的抗體水平方面有困難的患者時是有效的。本發明的糖脂還可以用于NKT細胞功能受到抑制的疾病。
使用以下所示的實施例例示本發明，但這些實施例不意在限制本發明。
參考例1合成(2R，3S，4R)-1，3，4-三-O-芐基-5-辛烯-1，2，3，4-三醇(化合物1 )0℃下將NaIO4(760mg)加到在乙醇/水(4/1，12.5ml)中的3，4，6-三-O-芐基-D-半乳糖(0.99g)的溶液中。將所得的混合物在室溫下攪拌6小時。用二氯甲烷稀釋混合物，并加入水以分離溶液。用二氯甲烷將水層萃取兩次。用MgSO4干燥有機層，并在減壓下除去溶劑。在-10℃下將在THF(6ml)中的粗油的溶液滴加到分別制備的在THF-己烷(11.2ml)中的亞丙基(三苯基)正膦(5毫摩爾)的溶液中，并在室溫下將所得的混合物攪拌22小時。加入MeOH/H2O(4/1，50ml)的混合溶劑，并用己烷萃取4次，用Na2SO4干燥有機相，并在減壓下除去溶劑。用硅膠柱純化所得的油，得到270mg標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.92(t，J＝8Hz，3H)，1.85-2.05(m，2H)，2.97(d，J＝5Hz，1H)，3.51(d，J＝6Hz，2H)，3.55-3.60(m，1H)，4.05-4.10(m，1H)，4.35(d，J＝12Hz，1H)，4.40-4.50(m，1H)，4.50-4.55(m，3H)，4.60(d，J＝12Hz，1H)，4.69(d，J＝12Hz，1H)，5.44(t，J＝10Hz，1H)，5.70-5.80(m，1H)，7.2-7.4(m，15H)。
參考例2合成(2R，3S，4R)-1，3，4-三-O-芐基-5-庚烯-1，2，3，4-三醇(化合物2)在合成化合物1的相同方法中使用3，4，6-三-O-芐基-D-半乳糖和亞乙基(三苯基)正膦獲得標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)1.57(dd，J＝7Hz和2Hz，3H)，2.95(d，J＝5Hz，1H)，3.52(d，J＝6Hz，2H)，3.55-3.60(m，1H)，4.05-4.10(m，1H)，4.35(d，J＝12Hz，1H)，4.40-4.55(m，3H)，4.60(d，J＝12Hz，1H)，4.69(d，J＝12Hz，1H)，5.51(t，J＝10Hz，1H)，5.80-5.90(m，1H)，7.2-7.4(m，15H)。
參考例3合成(2R，3S，4R)-1，3，4-三-O-芐基-5-壬烯-1，2，3，4-三醇(化合物3)在用于合成化合物1的相同方法中使用3，4，6-三-O-芐基-D-半乳糖和亞丁基(三苯基)正膦獲得標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.90(t，J＝7Hz，3H)，1.35-1.42(m，2H)，1.87-2.04(m，2H)，3.05(d，J＝5Hz，1H)，3.55(d，J＝6Hz，2H)，3.60-3.62(m，1H)，4.10-4.12(m，1H)，4.38(d，J＝12Hz，1H)，4.45-4.56(m，4H)，4.64(d，J＝12Hz，1H)，4.72(d，J＝12Hz，1H)，5.51(t，J＝10Hz)，7.26-7.36(m，15H)。
參考例4合成(2R，3S，4R)-1，3，4-三-O-芐基-1，2，3，4-辛烷四醇(化合物4)往在THF(3ml)中的化合物1(270mg)的溶液中加入10％Pd-C(30mg)，并將所得的混合物于室溫和氫氣氛下攪拌1小時。通過過濾除去催化劑并除去溶劑而得到標題化合物(262mg)。
1H-NMR(CDCl3)0.88(t，J＝3Hz，3H)，1.25-1.75(m，6H)，3.15(d，J＝5Hz，1H)，3.5-3.7(m，4H)，4.05-4.10(m，1H)，4.50-4.75(m，6H)，7.25-7.40(m，15H)。
參考例5合成(2S，3S，4R)-2-疊氮化物-1，3，4-三-O-芐基-1，3，4-辛烷四醇(化合物5)室溫下將三乙胺(240μl)和甲磺酰氯(108μl)連續加到在吡啶中的化合物4(262mg)的溶液中，然后將混合物于室溫下攪拌1小時。用乙醚萃取混合物，在用飽和硫酸氫鉀、水、碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌有機層后用無水硫酸鈉干燥。在減壓下蒸發溶劑，得到282mg殘余物。將殘余物溶于DMF(2ml)中，并加入NaN3(0.3g)。將混合物于100℃下攪拌24小時，并用乙酸乙酯稀釋。用水洗滌有機層，并用無水硫酸鈉干燥。蒸發溶劑，并用閃蒸色譜法(己烷/乙酸乙酯＝100/0-90/10)將殘余物純化得到200mg標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.89(t，J＝7Hz，3H)，1.25-1.80(m，6H)，3.60-3.85(m，5H)，4.45-4.75(m，6H)，7.25-7.40(m，15H)。
參考例6合成(2S，3S，4R)-2-疊氮化物-1，3，4-三-O-芐基-1，3，4-庚烷四醇(化合物6)在將化合物2用于與合成化合物4相同的方法之后，隨后在與合成化合物5相同的方法中得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.90(t，J＝7Hz，3H)，1.30-1.75(m，4H)，3.60-3.85(m，5H)，4.50-4.75(m，6H)，7.25-7.40(m，15H)。
參考例7合成(2S，3S，4R)-2-疊氮化物-1，3，4-三-O-芐基-1，3，4-壬烷四醇(化合物7)在將化合物3用于與合成化合物4相同的方法之后，隨后在與合成化合物5相同的方法中得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.88(t，J＝7Hz，3H)，1.20-1.72(m，8H)，3.59-3.72(m，5H)，4.50-4.80(m，6H)，7.27-7.36(m，15H)。
參考例8合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-三-O-芐基-1，3，4-辛烷三醇(化合物8)往在THF(7ml)中的化合物5(200mg)的溶液中加入10％Pd-C(20mg)。將所得的混合物于室溫和氫氣氛下攪拌14小時。用膜濾器過濾催化劑，并在減壓下除去溶劑。將殘余物溶于二氯甲烷(5ml)中，并連續地加入二十四烷酸、1-甲基2-氯吡啶鎓碘化物(252mg)和三丁胺(136μl)。將所得的混合物攪拌2.5小時同時加熱。在將乙酸乙酯加到反應混合物中之后，用5％硫代硫酸鈉水溶液和飽和硫酸氫鉀水溶液洗滌混合物。用硫酸鈉干燥有機層，然后用閃蒸色譜法(丙酮/己烷＝4/96-1/4)純化以得到213mg標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.80(m，6H)，1.20-1.75(m，48H)，2.0-2.1(m，2H)，3.45-3.55(m，2H)，3.75-3.85(m，2H)，4.20-4.30(m，1H)，4.44(s，2H)，4.45-4.60(m，3H)，4.82(d，J＝11Hz，1H)，5.78(d，J＝9Hz，1H)，7.25-7.40(m，15H)。
參考例9合成(2S，3S，4R)-2(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-三-O-芐基-1，3，4-庚烷三醇(化合物9)將化合物6用于與合成化合物8相同的方法之后，得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.85-0.95(m，6H)，1.20-1.75(m，46H)，2.0-2.1(m，2H)，3.50-3.55(m，2H)，3.80-3.85(m，2H)，4.20-4.30(m，1H)，4.46(s，2H)，4.50-4.65(m，3H)，4.83(d，J＝11Hz，1H)，5.77(d，J＝9Hz，1H)，7.25-7.40(m，15H)。
參考例10合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-三-O-芐基-1，3，4-庚烷三醇(化合物10)將化合物7用于與合成化合物8相同的方法，得到標題化合物。1H-NMR(CDCl3)0.85-0.95(m，6H)，1.26-1.70(m，50H)，2.00-2.05(m，2H)，3.49-3.54(m，2H)，3.79-3.83(m，2H)，4.22-4.28(m，2H)，4.45(s，1H)，4.49-4.54(m，2H)，4.59(d，J＝12Hz，1H)，4.82(d，J＝12Hz，1H)，5.76(d，J＝9Hz，1H)，7.26-7.34(m，15H)。
參考例11合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-3，4-二-O-苯甲酰基-1-O-三苯基甲基-1，3，4-辛烷三醇(化合物11)將在乙酸乙酯(10ml)中的化合物8(210mg)、Pd-C(10％，60mg)和PdCl2(30mg)的混合物于室溫和氫氣氛下攪拌30分鐘。加入THF-EtOH(1/1；25ml)，并在除去催化劑后蒸發溶劑。將三苯基甲基氯(587mg)和二甲基氨基吡啶(20mg)加到在吡啶(1.7ml)中的殘余物中，并將混合物于40℃下攪拌9小時。在減壓下除去吡啶，并通過閃蒸色譜法(二氯甲烷/丙酮＝100/0-50/1)純化殘余物得到含有二醇的部分。除去溶劑并往殘余物中加入吡啶(2ml)、二甲基氨基吡啶(25mg)和苯甲酰氯(200μl)。將混合物于40℃下攪拌66小時。在減壓下除去溶劑，并通過閃蒸色譜法(己烷/乙酸乙酯＝98/2-80/20)純化殘余物得到128mg標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.80-0.95(m，6H)，1.20-1.45(m，44H)，1.5-2.0(m，4H)，2.1-2.3(m，2H)，3.25-3.35(m，2H)，4.5-4.65(m，1H)，5.30-5.35(m，1H)，5.79(dd，J＝2Hz和9Hz，1H)，5.99(d，J＝9Hz，1H)，7.05-7.35(m，15H)，7.35-7.60(m，6H)，7.88(d，J＝7Hz，2H)，7.95-8.0(m，2H)。
參考例12合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-3，4-二-O-苯甲酰基-1-O-三苯基甲基-1，3，4-庚烷三醇(化合物12)將化合物9用于與合成化合物11相同的方法，得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.85-0.95(m，6H)，1.20-1.50(m，42H)，1.55-1.75(m，2H)，1.80-1.95(m，2H)，2.1-2.3(m，2H)，3.30-3.40(m，2H)，4.55-4.65(m，1H)，5.35-5.40(m，1H)，5.82(dd，J＝2Hz和9Hz，1H)，6.13(d，J＝9Hz，1H)，7.05-7.65(m，21H)，7.89(d，J＝8Hz，2H)，7.89(d，J＝8Hz，2H)，7.96(d，J＝8Hz，2H)。
參考例13合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-3，4-二-O-苯甲酰基-1-O-三苯基甲基-1，3，4-壬烷三醇(化合物13)將化合物10用于與合成化合物11相同的方法，得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.82-0.90(m，6H)，1.26-1.41(m，46H)，1.60-1.65(m，2H)，1.74-1.89(m，2H)，2.14-2.24(m，2H)，3.27-3.35(m，2H)，4.56-4.60(m，1H)，5.34-5.40(m，1H)，5.79(dd，J＝3Hz和9Hz，1H)，5.99(d，J＝9Hz，1H)，7.11-7.69(m，21H)，7.89(d，J＝8Hz，2H)，7.96(d，J＝7Hz，2H)。
參考例14合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-3，4-二-O-苯甲酰基-1，3，4-辛烷三醇(化合物14)將對甲苯磺酸一水合物(14mg)加到在二氯甲烷/甲醇(2/1)(1.8ml)中的化合物11(128mg)的溶液中，并將所得的混合物在30℃下攪拌2小時。在減壓下除去溶劑，并通過閃蒸色譜法(己烷/乙酸乙酯＝85/15-50/50)純化殘余物，以得到54mg標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.85-0.95(m，6H)，1.20-1.50(m，44H)，1.60-1.75(m，2H)，1.95-2.10(m，2H)，2.29(t，J＝8Hz，2H)2.70-2.75(m，1H)，3.6-3.7(m，2H)，4.35-4.45(m，1H)，5.35-5.45(m，2H)，6.33(d，J＝9Hz，1H)，7.38(t，J＝8Hz，2H)，7.50-7.60(m，3H)，7.64(t，J＝7Hz，1H)，7.95-8.00(m，2H)，8.05-8.10(m，2H)。
參考例15合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-3，4-二-O-苯甲酰基-1，3，4-庚烷三醇(化合物15)將化合物12用于與合成化合物14相同的方法，得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.88(t，J＝7Hz，3H)，0.97(t，J＝7Hz，3H)，1.20-1.75(m，44H)，2.0-2.1(m，2H)，2.30(t，J＝8Hz，2H)，3.6-3.7(m，2H)，4.35-4.45(m，1H)，5.35-5.45(m，2H)，6.38(d，J＝9Hz，1H)，7.38(t，J＝8Hz，2H)，7.45-7.70(m，3H)，7.95(d，J＝7Hz，2H)，8.05-8.10(m，2H)。
參考例16合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-3，4-二-O-苯甲酰基-1，3，4-壬烷三醇(化合物16)將化合物13用于與合成化合物14相同的方法，得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.85-0.90(m，6H)，1.26-1.48(m，46H)，1.65-1.72(m，2H)，1.89-2.10(m，2H)，2.29(t，J＝8 Hz，2H)，2.74-2.77(m，1H)，3.58-3.68(m，2H)，4.36-4.41(m，1H)，5.36-5.43(m，2H)， 6.34(d，J＝9Hz，1H)，7.38(t，J＝7Hz，2H)，7.48-7.55(m，3H)，7.64(t，J＝7Hz，1H)，7.95(d，J＝7Hz，2H)，8.06(d，J＝7Hz，2H)。
參考例17合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-3，4-二-O-苯甲酰基-1-O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-半乳糖基)-1，3，4-辛烷三醇(化合物17)將在THF(2ml)中的化合物14(54mg)、氯化錫(38mg)、高氯酸銀(46mg)和分子篩(4A，270mg)的混合物于室溫下攪拌1小時。將四-O-芐基半乳糖基氟化物(70mg)加到混合物中，并將所得的混合物攪拌2.5小時。將乙酸乙酯和鹽水加到反應混合物中，并分離溶液層。用無水硫酸鈉干燥有機層。在減壓下蒸發溶劑，并通過閃蒸色譜法(己烷/乙酸乙酯＝95/5-75/25)純化殘余物，以得到45mg標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.75-0.90(m，6H)，1.15-1.45(m，44H)，1.55-1.70(m，2H)，1.80-1.85(m，2H)，2.16(t，J＝7Hz，2H)，3.30-3.35(m，1H)，3.50-3.55(m，1H)，3.6-3.65(m，1H)，3.8-4.1(m，5H)，4.40-4.90(m，10H)，5.35-5.45(m，1H)，5.70(dd，J＝10Hz和3Hz，1H)，7.01(d，J＝9Hz，1H)，7.15-7.60(m，26H)，7.90-7.95(m，2H)，8.00-8.05(m，2H)。
參考例18合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-3，4-二-O-苯甲酰基-1-O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-半乳糖基)-1，3，4-庚烷三醇(化合物18)將化合物15用于與合成化合物17相同的方法，得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.85-0.90(m，6H)，1.15-1.50(m，42H)，1.55-1.70(m，2H)，1.80-1.90(m，2H)，2.15(t，J＝7Hz，2H)，3.30-3.35(m，1H)，3.50-3.55(m，1H)，3.6-3.65(m，1H)，3.8-3.9(m，2H)，3.95-4.05(m，2H)，4.05-4.15(m，1H)，4.40-4.90(m，10H)，5.40-5.45(m，1H)，5.69(dd，J＝10Hz和3Hz，1H)，6.93(d，J＝9Hz，1H)，7.15-7.65(m，26H)，7.92(d，J＝7Hz，2H)，8.03(d，J＝7Hz，2H)。
參考例19合成(2S，3S，4R)-2-(N-二十四烷酰氨基)-3，4-二-O-苯甲酰基-1-O-(2，3，4，6-四-O-芐基-α-D-半乳糖基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物19)將化合物16用于與合成化合物17相同的方法，得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.87-0.90(m，6H)，1.25-1.37(m，46H)，1.61-1.64(m，2H)，1.78-1.91(m，2H)，2.16(t，J＝7Hz，2H)，3.30-3.35(m，1H)，3.45-3.54(m，1H)，3.60-3.64(m，1H)，3.82-3.87(m，2H)，3.94-4.10(m，3H)，4.35-4.93(m，10H)，5.39-5.43(m，1H)，5.70(dd，J＝9Hz和3Hz，1H)，7.01(d，J＝9Hz，1H)，7.16-7.38(m，22H)，7.45(t，J＝7Hz，2H)，7.52(t，J＝7Hz，1H)，7.60(t，J＝7Hz，1H)，7.93(d，J＝7Hz，2H)，8.03(d，J＝7Hz，2H)。
參考例20合成(2S，3S，4R)-3，4-二-O-苯甲酰基-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇(化合物20)將在乙酸乙酯(3ml)中的化合物17(45mg)、Pd-C(10％，12mg)和PdCl2(12mg)的混合物于室溫和氫氣氛下攪拌1.5小時。過濾催化劑，并在減壓下除去溶劑。通過閃蒸色譜法(丙酮/己烷＝2/3)純化殘余物，得到24mg標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.80-0.90(m，6H)，1.20-1.50(m，44H)，1.60-1.75(m，2H)，1.90-2.00(m，2H)，2.25-2.35(m，3H)，2.68(s，1H)，2.88(s，1H)，3.43(br t，1H)，3.65-4.05(m，8H)，4.60(br t，，1H)，4.79(d，J＝4Hz，1H)，5.20-5.25(m，1H)，5.77(dd，J＝10Hz和3Hz，1H)，7.35-7.65(m，7H)，7.90-7.95(m，2H)，8.00-8.05(m，2H)。
參考例21合成(2S，3S，4R)-3，4-二-O-苯甲酰基-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇(化合物21)將化合物18用于與合成化合物20相同的方法，得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.88(t，J＝7Hz，3H)，0.93(t，J＝7Hz，3H)，1.20-1.40(m，41H)，1.4-1.55(m，1H)，1.60-1.75(m，2H)，1.85-2.00(m，2H)，2.11(d，J＝10Hz，1H)，2.32(t，J＝8Hz，2H)，2.52(s，1H)，2.64(s，1H)，3.44(br t，1H)，3.65-4.05(m，8H)，4.60(br t，1H)，4.80(d，J＝4Hz，1H)，5.25-5.30(m，1H)，5.77(dd，J＝10Hz和3Hz，1H)，7.35-7.65(m，7H)，7.90-7.95(m，2H)，8.00-8.05(m，2H)。
參考例22合成(2S，3S，4R)-3，4-二-O-苯甲酰基-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物22)將化合物19用于與合成化合物20相同的方法，得到標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)0.88-0.90(m，6H)，1.25-1.32(m，46H)，1.68-1.73(m，2H)，2.27-2.47(m，3H)，2.67(s，1H)，2.87(s，1H)，3.43(t，J＝7Hz，1H)，3.66-4.01(m，8H)，4.59(t，J＝10Hz，1H)，4.79(d，J＝4Hz，1H)，5.21-5.25(m，1H)，5.77(dd，J＝3Hz和10Hz，1H)，7.37-7.65(m，7H)，7.91(d，J＝7Hz，1H)，8.01(d，J＝7Hz，1H)。
實施例1合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(二十四烷酰氨基)-1，3，4-辛烷三醇(化合物23)室溫下將在甲醇溶液(250μl)中的1M甲醇鈉加到在MeOH-THF(1/1，1.8ml)中的化合物20的溶液中，并將所得的混合物攪拌30分鐘。將AG 50Wx8(H+型)(430mg)加到混合物中，并將所得的混合物攪拌10分鐘，然后過濾樹脂。除去溶劑，用少量的MeOH洗滌殘余物。將氮氣流用于干燥產物以得到15mg標題化合物。
1H-NMR(吡啶-d5)0.80-0.90(m，6H)，1.15-1.45(m，42H)，1.55-1.70(m，1H)，1.75-1.90(m，4H)，2.20-2.30(m，1H)，2.42(t，J＝7Hz，2H)，3.20(br t，1H)，4.30(brs，1H)，4.35-4.50(m，4H)，4.50-4.60(m，2H)，4.60-4.70(m，2H)，5.20-5.30(m，1H)，5.57(d，J＝4Hz 1H)，6.00-6.10(m，1H)，6.3(brs，1H)，6.4(bfd，1H)，6.55(brs，1H)，6.65(br s，1H)，6.95(brs，1H)，8.43(d，J＝8Hz，1H)；MS(ESI)m/z690.5(M+H+)。
實施例2合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(二十四烷酰氨基)-1，3，4-庚烷三醇(化合物24)使用化合物21和與合成化合物23相同的方法，得到標題化合物。
1H-NMR(吡啶-d5)0.87(t，J＝7Hz，3H)，0.95(t，J＝7Hz，3H)，1.15-1.40(m，40H)，1.57-1.75(m，1H)，1.75-1.90(m，4H)，2.15-2.25(m，1H)，2.42(t，J＝7Hz，2H)，4.30(brs，2H)，4.35-4.45(m，4H)，4.45-4.57(m，2H)，4.57-4.70(m，2H)，5.20-5.30(m，1H)，5.56(d，J＝4Hz 1H)，6.00-6.05(m，1H)，6.25(brs，1H)，6.4(bfd，1H)，6.5(br s，1H)，6.6(br s，1H)，6.9(br s，1H)，8.38(d，J＝8Hz，1H)；MS(ESI)m/z676.4(M+H+)。
實施例3合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(二十四烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物25)使用化合物22和與合成化合物23相同的方法，得到化合物25(由以下的結構式表示)。
TLCRf＝0.54(CHCl3∶MeOH＝3∶1)；1H-NMR(吡啶-d5)0.80(t，J＝7Hz，3H)，0.86(t，J＝7Hz，3H)，1.22-1.31(m，44H)，1.58-1.69(m，1H)，1.79-1.84(m，4H)，2.20-2.30(m，1H)，2.43(t，J＝7Hz，2H)，4.29(br s，2H)，4.36-4.45(m，4H)，4.50-4.55(m，2H)，4.62-4.69(m，2H)，5.26(d，J＝5Hz 1H)，5.57(d，J＝4Hz，1H)，6.04(br s，1H)，6.29(br s，1H)，6.39(d，J＝5Hz，1H)，6.51(br s，1H)，6.60(br s，1H)，6.93(br s，1H)，8.43(d，J＝9Hz，1H)；MS(ESI)m/z704.5(M+H+)。
實施例4合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十九烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物26)使用化合物7和二十九烷酸，通過與合成化合物8、14、17、20和23相同的方法得到標題化合物。
TLCRf＝0.24(CH2Cl2∶MeOH＝3∶1)；1H-NMR(CDCl3∶CD3OD＝3∶1)7.34(br s，1H)，4.91(d，1H，J＝3.5Hz)，4.17(m，1H)，3.95-3.88(m，2H)，3.80-3.68(m，6H)，3.67-3.55(m，2H)，2.21(t，2H，J＝7Hz)，1.67-1.26(m，60H)，0.91-0.87(m，6H)；MS(FAB)m/z774(M+)。實施例5合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十八烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物27)使用化合物7和二十八烷酸，通過與合成化合物8、14、17、20和23相同的方法得到標題化合物。
TLCRf＝0.24(CH2Cl2∶MeOH＝3∶1)；1H-NMR(CDCl3∶CD3OD＝3∶1)4.92(d，1H，J＝3.7Hz)，4.20-4.19(m，1H)，3.96-3.88(m，2H)，3.81-3.67(m，6H)，3.56-3.50(m，2H)，2.20(t，2H，J＝7Hz)，1.67-1.26(m，58H)，0.91-0.86(m，6H)；MS(FAB)m/z760(M+)。
實施例6合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十七烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物28)使用化合物7和二十七烷酸，通過與合成化合物8、14、17、20和23相同的方法得到標題化合物。
TLCRf＝0.25(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)；1H-NMR(吡啶-d5)8.43(d，1H，J＝8.5Hz)，5.56(d，1H，J＝3.7Hz)，5.25(m，1H)，4.7-4.6(m，2H)，4.54(d，1H，J＝3.0Hz)，4.50(t，1H，J＝6.0Hz)，4.45-4.3(m，4H)，4.3-4.2(m，2H)，2.42(t，2H，J＝7.4Hz)，2.3-2.15(m，1H)，1.9-1.75(m，4H)，1.7-1.55(m，1H)，1.4-1.15(m，56H)，0.85(t，3H，J＝6.7Hz)，0.78(t，3H，J＝7.1Hz)；MS(FAB)m/z747(M+H+)。
實施例7合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物29)使用化合物7和蠟酸，通過與合成化合物8、14、17、20和23相同的方法得到標題化合物。
TLCRf＝0.20(CH2Cl2∶MeOH＝6∶1)；1H-NMR(吡啶-d5)8.44(d，1H，J＝8.4Hz)，5.56(d，1H，J＝3.7Hz)，5.50-5.19(m，1H)，4.69-4.61(m，2H)，4.54(d，1H，J＝3.1H)，4.52-4.47(m，1H)，4.45-4.34(m，4H)，4.31-4.23(m，2H)，2.43(t，2H，J＝7.4Hz)，2.28-2.17(m，1H)，1.92-1.73(m，4H)，1.70-1.53(m，1H)，1.38-1.15(m，54H)，0.85(t，3H，J＝6.7Hz)，0.73(t，3H，J＝7.0Hz)；MS(FAB)m/z732(M+)。
實施例8合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十五烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物30)使用化合物7和二十五烷酸，通過與合成化合物8、14、17、20和23相同的方法得到標題化合物。
TLCRf＝0.53(CH2Cl2∶MeOH＝6∶1)；1H-NMR(CDCl3∶CD3OD＝3∶1)4.92(d，1H，J＝3.3Hz)，4.20-4.15(m，1H)，3.96-3.93(m，1H)，3.92-3.85(m，1H)，3.82-3.65(m，6H)，3.60-3.52(m，2H)，2.21(t，2H，J＝7.6Hz)，1.62-1.26(m，52H)，0.90-0.85(m，6H)；MS(FAB)m/z719(M+H+)。
實施例9合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十三烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物31)使用化合物7和二十三烷酸，通過與合成化合物8、14、17、20和23相同的方法得到標題化合物。
TLCRf＝0.51(CHCl3∶MeOH＝4∶1)；1H-NMR(CDCl3∶CD3OD＝3∶1)4.91(d，1H，J＝3.1Hz)，4.23-4.15(m，1H)，3.95-3.85(m，2H)，3.81-3.63(m，6H)，3.59-3.51(m，2H)，2.21(t，2H，J＝7.5Hz)，1.61-1.25(m，48H)，0.90-0.85(m，6H)；MS(FAB)m/z690(M+)。
實施例10合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十二烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物32)使用化合物7和二十二烷酸，通過與合成化合物8、14、17、20和23相同的方法得到標題化合物。
TLCRf＝0.47(CH2Cl2∶MeOH＝5∶1)；1H-NMR(CDCl3∶CD3OD＝3∶1)4.90(d，1H，J＝3.0Hz)，4.27-4.20(m，1H)，3.96-3.92(m，1H)，3.91(dd，1H，J＝10.5Hz和4.0Hz)，3.82-3.65(m，6H)，3.58-3.51(m，2H)，2.22(t，2H，J＝7.6Hz)，1.70-1.21(m，46H)，0.90-0.85(m，6H)；MS(FAB)m/z676(M+)。
實施例11合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十一烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物33)使用化合物7和二十一烷酸，通過與合成化合物8、14、17、20和23相同的方法得到標題化合物。
TLCRf＝0.33(CH2Cl2∶MeOH＝6∶1)；1H-NMR(CDCl3∶CD3OD＝3∶1)8.05(d，1H，J＝7.9Hz)，4.92(d，1H，J＝3.3Hz)，4.22(m，1H)，3.96(m，1H)，3.90(dd，1H，J＝10.5Hz和4.1Hz)，3.81-3.69(m，6H)，3.55(m，2H)，2.22(t，2H，J＝7.6Hz)，1.68-1.62(m，4H)，1.31-1.27(m，40H)，0.90-0.87(m，6H)；MS(FAB)m/z662(M+H+)。
實施例12合成(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十烷酰氨基)-1，3，4-壬烷三醇(化合物34)使用化合物7和花生四烯酸，通過與合成化合物8、14、17、20和23相同的方法得到標題化合物。
TLCRf＝0.33(CH2Cl2∶MeOH＝6∶1)；1H-NMR(CDCl3∶CD3OD＝3∶1)4.86(d，1H，J＝3.4Hz)，4.16(m，1H)，3.90(m，1H)，3.85(dd，1H，J＝10.5Hz和4.6Hz)，3.74-3.61(m，6H)，3.50(m，2H)，2.17(t，2H，J＝7.9Hz)，1.62-1.56(m，4H)，1.25-1.21(m，38H)，0.85-0.81(m，6H)；MS(FAB)m/z648(M+H+)。
此外，根據實施例中所述的合成方法合成α-半乳糖神經酰胺(α-GC)、NH和3，4D，將它們用作生物活性評價比較的參比物質。這里α-GC指(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-十八烷三醇，NH指(2S，3S，4R)-1-O-(2-氨基-2-去氧-α-D-半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-十八烷三醇，而3，4D指(2S)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1-十八醇。這些化合物的結構式和光譜數據如以下所示。
比較例1(2S，3S，4R)-1-O-(2-去氧-2-氨基-2-去氧-α-D-半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-十八烷三醇(化合物35NH)TLCRf＝0.67(t-BuOH∶CH3OH∶H2O＝4∶1∶1)；1H-NMR(CDCl3∶CD3OD∶D2O＝3∶1∶0.1)5.10(d，1H，J＝3.5Hz)，3.47-3.94(m，11H)，2.24(t，2H，J＝7.3Hz)，1.26-1.54(m，72H)，0.88(m，6H)；MS(ESI)m/z857.7(M+H+)。
比較例2(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-1，3，4-十八烷三醇(化合物36α-GC)TLCRf＝0.75(CHCl3∶MeOH＝3∶1)；1H-NMR(CDCl3∶CD3OD＝3∶1)4.90(d，1H，J＝3.6Hz)，3.56-3.90(m，11H)，2.21(t，2H，J＝7.4Hz)，1.27-1.61(m，72H)，0.89(m，6H)；MS(ESI)m/z880.7(M+H+)。
比較例3(2S)-1-O-(α-D-半乳糖基)-2-(N-二十四烷酰氨基)-1，3，4-十八醇(化合物373，4D)TLCRf＝0.48(CHCl3∶MeOH＝7∶1)；1H-NMR(CDCl3∶CD3OD＝3∶1)4.90(d，1H，J＝3.3Hz)，3.42-3.95(m，9H)，2.19(t，2H，J＝7.6Hz)，1.27-1.62(m，72H)，0.89(m，6H)；MS(MALDI)m/z820.74(M+Na+)。
生物活性評價使用下述的方法評價如上述合成的化合物的生物活性。
首先，使用合成的糖脂[化合物25和α-GC(化合物36)]，并進行實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)的抑制研究。
在6-8周齡的雌性C57BL6J(B6)小鼠尾根部使用100μg對應于髓磷脂少突膠質細胞糖蛋白(MOG)的35-55氨基酸殘基的肽(序列號1)與被殺死的肺結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(H37Ra)的乳液免疫之。在同一日通過尾靜脈給予200ng百日咳毒素，并在接種48小時后腹膜內給予200ng百日咳毒素以誘導EAE。進行臨床觀察和病理學研究。口服給予合成糖脂(400ng/kg)。將DMSO(二甲亞砜)單獨給予對照組。
結果如表1所示。將下述的臨床和病理得分用于評價中。
臨床得分0正常，1尾緊張性降低，2尾下垂和步行不穩定，3中度后肢無力，4后肢完全無力，5四肢麻痹，6死亡。
病理得分0正常，1柔腦脊膜和相鄰軟膜下細胞浸潤，2中度血管周圍細胞浸潤，3高度血管周圍細胞浸潤，4腦實質細胞浸潤。
表1A)B6小鼠，第0天口服給藥最大得分 發作 發病率 總得分 病理得分DMSO2.75±0.38 12.00±0.9112/12 25.19±4.031.92±0.24α-Gc 2.41±0.37 14.27±0.9812/12 20.32±4.071.79±0.38化合物251.42±0.33 14.80±1.2210/12 10.71±3.231.00±0.13B)B6小鼠，第8天口服給藥最大得分 發作 發病率 總得分DMSO3.30±0.26 12.60±1.837/722.70±3.12α-GC 3.00±0.29 13.86±0.997/717.50±2.74化合物252.25±0.51 16.43±1.956/710.94±3.40C)NKT剔除小鼠，第0天口服給藥最大得分發作 發病率 總得分DMSO 4.00±0.11 11.29±0.976/635.79±4.73α-GC 3.67±0.42 13.33±1.416/632.25±6.66化合物25 3.64±0.28 12.43±0.536/634.36±4.15在用化合物25治療的組中觀察到EAE抑制作用，但在α-GC治療的組中沒有觀察到抑制作用。在化合物25治療的組中即使在病理試驗中也觀察到抑制作用。由于化合物25導致的EAE抑制作用不可能在NKT剔除小鼠(TCR J alpha 281剔除小鼠)中觀察到，因此認為在此作用中涉及NKT細胞。
接著，使用上述自體免疫腦脊髓炎(EAE)抑制試驗中所述的方法誘導EAE，并研究化合物25(100(g/kg)的腹膜內給藥的EAE抑制作用。結果如圖3所示。該結果表明腹膜內給藥具有與口服治療類似的EAE抑制作用。
接著，將合成糖脂(化合物25和α-GC)和DMSO用于研究實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)抑制的機理。
使用上述的方法誘導EAE，并研究IL-4在與化合物25給藥相關的EAE抑制作用中的作用。同時腹膜內給予抗IL-4抗體(1mg/ml)。結果如表2所示。
表2最大得分發作 發病率 總得分抗-IL-4(-)DMSO3.78±0.24 9.67±0.9710/10 39.94±3.65α-GC 4.00±0.25 9.10±0.8410/10 45.00±3.87化合物252.75±0.37 11.00±0.78 9/10 26.05±4.16抗-IL-4(+)DMSO4.00±0.29 8.57±0.8410/10 42.50±3.40α-GC 3.79±0.29 11.29±1.58 10/10 37.00±5.02化合物253.50±0.15 9.43±0.9010/10 38.79±2.94當給予抗IL-4抗體時化合物25給藥所實現的EAE抑制作用消失，表明IL-4在EAE抑制中是重要的。
接著，進行膠原關節炎(CIA)抑制試驗。結果如圖4所示。
A)在6-8周齡的雄性C57BL6小鼠尾根部使用100μg tri II型膠原與被殺死的肺結核分枝桿菌(H37Ra)的乳液免疫之。在第21天，使用相同的乳液追加免疫小鼠并觀察臨床癥狀。從追加免疫之時起每周兩次腹膜內給予合成的糖脂(500μg/kg)。對照組僅接受DMSO。
臨床得分0無癥狀，1在一個小關節如指關節處觀察到腫脹和發紅，2在至少兩個小關節或相對大的關節如腕和踝處觀察到腫脹和發紅，3在一整只手或足中觀察到腫脹和發紅，4一整只手或足的最大腫脹。得分代表雙手和雙足的總分。在有膠原誘導的關節炎的B6小鼠中在給予化合物25時觀察到抑制作用。
B)在6-8周齡雄性SJL小鼠的尾根部使用200μg牛II型膠原與被殺死的肺結核分枝桿菌(H37Ra)的乳液免疫之。在第21天，使用相同的乳液追加免疫小鼠并觀察臨床癥狀。從追加免疫之時起每周兩次腹膜內給予合成的糖脂(500μg/kg)。對照組僅接受DMSO。在給予化合物25時有效地抑制SJL小鼠的膠原誘導的關節炎。
C)在6-8周齡雄性SJL小鼠的尾根部使用200μg牛II型膠原與被殺死的肺結核分枝桿菌(H37Ra)的乳液免疫之。在第21天，使用相同的乳液追加免疫小鼠并觀察臨床癥狀。從追加免疫之時起或從癥狀出現第28天起每周兩次腹膜內給予合成的糖脂(500μg/kg)。對照組僅接受DMSO。在癥狀出現后給予化合物25時有效地抑制膠原誘導的關節炎。
接著，使用NOD小鼠進行糖尿病發病率的抑制試驗。結果如圖5所示。觀察到通過兩次腹膜內給予4周齡的NOD小鼠化合物25(100μg/kg)顯著地抑制糖尿病的發病率。
接著，測定血液中的細胞因子，結果如圖6所示。已知在NKT細胞受到刺激時大量的細胞因子在短時間內釋放進入血液中。因此，在將合成糖脂給予小鼠時使用ELISA方法測定隨時間消逝的血清INF-γ和IL-4水平。如前面報道，α-GC給藥時主要形成INF-γ，但在化合物25給藥時主要形成IL-4。
接著，測定脾細胞增殖反應，結果如圖7所示。分離鼠脾細胞，并使用引入細胞內的胸苷作為指示劑測定合成糖脂的增殖反應。脾細胞對化合物25表現出顯著的增殖反應。
接著，進行脾細胞細胞因子測定，其結果如圖8所示。分離鼠脾細胞，并使用ELISA法測定由合成糖脂導致的INF-γ和IL-4形成的水平。在治療的小鼠中觀察到，在給予α-GC時主要形成INF-γ，但在給予化合物25時主要形成IL-4。
接著進行脾細胞增殖反應和細胞因子測定，結果如圖9所示。分離鼠脾細胞，并使用引入細胞內的胸苷作為指示劑測定合成糖脂的增殖反應。化合物23、24和25表現出顯著的脾細胞增殖反應。分離鼠脾細胞，并使用ELISA法測定由合成糖脂導致的INF-γ和IL-4形成的水平。在給予α-GC時主要形成INF-γ，但在給予化合物23、24和25時I主要形成L-4。
接著進行血清抗-MOG抗體測定，其結果如圖10所示。在使用合成糖脂治療的組中用ELISA法測定抗MOG抗體和它的同型的水平。使用化合物25治療的組的抗MOG抗體水平升高。就同型而言，IgG1水平顯著升高，表明與MOG的反應偏向Th2。
序列表<110>獨立行政法人 科學技術振興機構<120>新的糖脂及其作為有效成分的用于自體免疫疾病的藥物<130>FS02-278PCT<160>1<210>1<211>21<212>PRT<213>人工序列<400>1Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu1 5 10 15Tyr Arg Asn Gly Lys20
權利要求
1.下式(I)代表的糖脂 式中，R1為吡喃醛糖基，R2為氫原子或羥基，R3為-CH2-、-CH(OH)-CH2-或-CH＝CH-，R4為氫原子或CH3，x為0-35，y和z代表滿足y+z＝0-3的整數。
2.如權利要求1的糖脂，其中R1為α-D-吡喃半乳糖基。
3.如權利要求2的糖脂，其中R3為-CH2-或-CH(OH)-CH2-，而x為10-32。
4.如權利要求3的糖脂，其中R3為-CH(OH)-CH2-。
5.如權利要求1-4之任一項的糖脂，其中R2和R4為氫原子，x為11-23，而z為0。
6.用于自體免疫疾病的藥物，所述藥物含有作為有效成分的如權利要求1-5之任一項的糖脂。
7.用于Th1/Th2免疫平衡偏向Th1的疾病或Th1細胞加重病癥的疾病的藥物，所述藥物含有作為有效成分的權利要求1-5之任一項的糖脂。
8.含有作為有效成分的權利要求1-5之任一項的糖脂的選擇性IL-4產生誘導劑。
全文摘要
本發明的目的是提供用于治療自體免疫疾病的糖脂及其作為有效成分的用于自體免疫疾病的藥物。也就是說，本發明提供下式(I)代表的糖脂(見式1)在該式中，R
文檔編號A61P37/06GK1568328SQ0282036
公開日2005年1月19日 申請日期2002年8月14日 優先權日2001年8月16日
發明者山村隆, 三宅幸子 申請人:第一三德利制藥株式會社, 國立精神·神經中心總長代表的日本國