專利名稱：一種雙鏈rna及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種雙鏈RNA及其抗腫瘤用途。具體涉及一種21-nt雙鏈RNA及其在抑制非小細胞肺癌細胞株表皮生長因子受體表達的用途。
目前，抗腫瘤藥物的研制主要針對治療靶標的高通量藥物篩選和針對治療靶標的理性化藥物設計。近年來受到廣泛重視的反義核酸技術是后者的一個重要代表，通過設計和靶標蛋白基因的反義核酸，導入到細胞中，對靶標蛋白的表達進行抑制，達到殺死和治療腫瘤的目的。反義核酸由于其作用靶點序列清楚、易設計制備，被認為是極具潛力的腫瘤治療藥物，但在實際應用中，存在抑制效率低，專一性差，較大的毒性以及用藥量較大和成本高等缺陷。
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引發的序列依賴性的轉錄后基因沉默機制(posttranscriptional genesilencing，PTGS)。在哺乳動物細胞中，21-23nt dsRNA進入細胞后，能以其為模板，降解與之序列相應的mRNA，從而達到專一性抑制特定基因的蛋白生成。RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉座子活動、調控基因表達的監控機制。在藥物開發方面，RNAi除了具有和反義核酸相同的優點外，還具有針對靶點抑制的專一性高，用量少，藥物毒性小的特點。目前將RNAi技術用于抗病毒(如HIV病毒)和細胞信號傳遞系統的研究方興未艾，但用于腫瘤治療未見報道。
本發明的進一步目的是提供新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤藥物。
本發明選定哺乳動物腫瘤細胞表皮生長因子受體(EGFR)作為腫瘤治療靶點，采用RNA干擾(RNAi)技術，體外合成與EGFR cDNA序列互補的21nt雙鏈RNA，與非病毒載體和/或病毒載體結合導入哺乳動物腫瘤細胞，抑制表皮生長因子受體的表達，從而改變NSCLC細胞生物學特性，增加放化療敏感性。
本發明所述哺乳動物腫瘤細胞表皮生長因子受體(epidermal growthfactor receptor，EGFR)是一分子量為170KD的跨膜糖蛋白，可調控細胞周期，調節細胞增生、存活、粘附、遷移和分化，促進損傷修復。EGFR在包括非小細胞肺癌(non-small-cell-lung cancer，NSCLC)在內的多種上皮源性腫瘤中過度表達，與腫瘤增生、轉移、放化療敏感性下降關系密切。
本發明按下述方法和步驟進行，1、測定EGFR受體(1)選用EGFR陽性的細胞株A549、SPC-A-1，通過免疫組化法和免疫熒光法對EGFR定性、定位。
免疫組化設低倍鏡、高倍鏡陰性對照和陽性對照。免疫組化結果陽性對照在細胞膜，細胞漿和細胞核顯示棕色顆粒，陰性對照未見特異性著色。
上述方法所用一抗為鼠抗人EGFR單克隆抗體，由中科院細胞生物所提供，二抗為SABC標記的兔抗鼠IgG。
所述細胞株由中科院上海細胞生物學研究所細胞庫提供。
免疫熒光法設陰性和陽性對照熒光照片。試驗結果同免疫組化染色。所述二抗采用FITC標記的兔抗鼠IgG。
(2).測定受體數量采用流式細胞儀測定受體數量，結果為A549％gated78.58％；mean54.51，SPC-A-1％gated98.89％mean103.79，H69％gated0.67％mean67.54。
2、篩選EGFR高表達細胞株取細胞株A549，SPC-A-1，ECV，HFL，H7402，BEL7402、SKOV3和H69進行篩選，結果表明A549，SPC-A-1為EGFR高表達細胞株，ECV、HFL、H7402、BEL7402、SKOV3細胞株EGFR表達較低。H69細胞株無EGFR表達。設H69細胞株為陰性對照。
所述細胞株由中科院上海細胞生物學研究所細胞庫提供。
3、按下述原則設計ssRNA，1)EGFR的cDNA啟動子AUG下游75堿基處，2)找到第一個AA二聚體，3)記錄AA下游19個核苷酸(siRNA-EGFR)，其核苷酸序列為5’AAGGAGCUGCCCAUGAGAAAU……mRNA4)計算嘌呤和嘧啶的百分比(G/C)，G/C比值為30％至70％，50％最佳。
4、按已知的體外化學合成方法合成siRNA-EGFR，其核苷酸序列為GGAGCUGCCCAUGAGAAAUdTdT……siRNAAUUUCUCAUGGGCAGCUCCdTdT……siRNA complement5、擬和(annealing)siRNA雙鏈1)獨立分裝上述化學合成的RNA單鏈，用無RNase水稀釋，2)正義、反義RNA混合，加入擬和緩沖液，
3)90℃孵育，離心，收集管底液體。
4)37℃孵育1小時。
5)擬和的雙鏈RNA的終濃度為20uM。形成的雙鏈具有如下序列。GGAGCUGCCCAUGAGAAAUdTdT……siRNAAUUUCUCAUGGGCAGCUCCdTdT……siRNA complement6、sRNA-unrelated的設計、合成以及擬和同dsRNA-EGFR。序列為5’-GAACUUCAGGGUCAGCUUGCCUU-3’——dsRNA-unrelated5’-GGCAAGCUGACCCUGAAGUUCUU-3’——unrelated completement7、15％PAGE-SDS電泳鑒定擬和的雙鏈，擬和完全，雙鏈片段大小正確。
8、篩選陽離子脂質體取陽離子脂質體TKO，Oligofectamine，LipofectamineTM2000進行篩選，采用高轉導效率的LipofectamineTM2000用于dsRNA的轉導。
9、RNA干擾技術用于腫瘤細胞1)制備貼壁細胞，2)制備dsRNA-Lipofectamine復合物，3)流式細胞儀檢測EGFR受體數目。
實驗結果證實，A549細胞株EGFR表達降低了73.23％，SPC-A-1細胞株受體表達降低了76.01％。本發明將體外合成的dsRNA借助陽離子脂質體導入哺乳動物腫瘤細胞，能抑制表皮生長因子受體的表達，從而改變NSCLC細胞生物學特性，增加哺乳動物腫瘤細胞對放化療的敏感性，獲得肯定的RNAi效果。
本發明雙鏈RNA可與非病毒載體和/或病毒載體結合，制備新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤藥物，行瘤體內直接注射或靜脈給藥有效抑制腫瘤生長。
其中1分子量標準，2正義RNA-EGFR，3反義RNA-EGFR，
4雙鏈RNA-EGFR，5非特異雙鏈RNA圖2是RNAi對SPC-A-1細胞EGFR的抑制作用。
按已知體外化學合成方法合成siRNA-EGFR，其序列為5’AAGGAGCUGCCCAUGAGAAAU……mRNA，GGAGCUGCCCAUGAGAAAUdTdT……siRNA，長度21，分子量6732.9(g/mole)，ODU26031.9(ug/ODU260)，數量50nmol/管×2管，AUUUCUCAUGGGCAGCUCCdTdT……siRNA complement長度21，分子量6583.7(g/mole)，ODU26033.4(ug/ODU260)，數量50nmol/管×2管，上述合成的每條RNA單鏈獨立分裝，RNase滅活的水稀釋成50uM，正義RNA30ul與反義RNA30ul混合，加入15ul 5×擬和緩沖液，終體積為75ul，90℃孵育1分鐘，離心15秒，收集管底液體，37℃孵育1小時，dsRNA雙鏈終濃度為20uM。擬和緩沖液的組成為100mMKOAc，30mMHEPES-KOHpH7.4，2mM MgOAc。經15％PAGE-SDS電泳，結果表明擬和的雙鏈擬和完全，雙鏈片段大小正確。
實施例2 RNA干擾技術用于非小細胞肺癌細胞制備貼壁細胞轉染前一天接種A549或SPC-A-1細胞于12孔培養板，使得次日轉染的時候細胞密度達40-50％(0.5-2×105細胞/孔/12孔培養板)，更換培養液(DMEM+10％FBS)，體積1ml。
制備dsRNA-Lipofectamine復合物1)將dsRNA稀釋于100ul無血清DMEM，混勻。
2)Lipofectamine使用前混勻，然后4ul Lipofectamine與100ul無血清DMEM混勻。室溫孵育5min。
3)將dsRNA稀釋液與Lipofectamine稀釋液混勻，總體積200ul，室溫孵育20min，室溫保存。
4)加入12孔培養板，混勻，培養箱內孵育24-48小時。
流式細胞儀檢測受體數目，結果為A549細胞株EGFR表達降低了73.23％(dsRNA-EGFR16ul/lipofectamine2000 4ul/12孔培養板)。SPC-A-1細胞株受體表達降低了76.01％(dsRNA-EGFR16 ul/lipofectamine 2000 4ul/12孔培養板)。
結果證實，本發明dsRNA能抑制表皮生長因子受體的表達，改變NSCLC細胞生物學特性，增加哺乳動物腫瘤細胞對放化療的敏感性，獲得肯定的RNAi效果。
權利要求
1.一種雙鏈RNA，其特征是具有如下序列的21-nt雙鏈RNA。GGAGCUGCCCAUGAGAAAUdTdT……siRNAAUUUCUCAUGGGCAGCUCCdTdT……siRNA complement
2.按權利要求1所述的雙鏈RNA，其特征是所述的雙鏈RNA是體外合成。
3.按權利要求1和2所述的雙鏈RNA，其特征是所述雙鏈RNA與非病毒載體和/或病毒載體結合導入腫瘤細胞，制備抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤藥物。
4.按權利要求3所述的雙鏈RNA，其特征是所述非病毒載體是陽離子脂質體。
5.按權利要求4所述的雙鏈RNA，其特征是所述陽離子脂質體是Lipofecta-mineTM2000。
6.按權利要求3所述的雙鏈RNA，其特征是所述腫瘤細胞是哺乳動物腫瘤細胞。
7.按權利要求3所述的雙鏈RNA，其特征是所述腫瘤細胞是非小細胞肺癌細胞。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，涉及一種雙鏈RNA及其抑制哺乳動物腫瘤細胞的用途。本發明采用RNA干擾技術，將體外合成的雙鏈RNA通過非病毒載體和/或病毒載體結合導入哺乳動物腫瘤細胞，能抑制表皮生長因子受體的表達，從而改變NSCLC細胞生物學特性，增加哺乳動物腫瘤細胞對放化療的敏感性。本發明雙鏈RNA可制備新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤藥物，行瘤體內直接注射或靜脈給藥有效抑制腫瘤生長。
文檔編號C07H21/02GK1434054SQ03115489
公開日2003年8月6日 申請日期2003年2月21日 優先權日2003年2月21日
發明者白春學, 張新, 張敏, 陳杰 申請人:復旦大學附屬中山醫院