專利名稱：共價結合的寡核苷酸和小溝結合劑的軛合物的制作方法
1.發明領域本發明涉及新的寡核苷酸衍生物。具體地講，本發明涉及一個或多個小溝結合劑與寡核苷酸共價結合的寡核苷酸衍生物。這種寡核苷酸-小溝結合劑共軛物(以后稱ODN-MGB)有較強的雜交能力，與單鏈或雙鏈核酸的互補序列的結合力也較強。因此可用作序列特異的探針，并作為反義核酸和反義基因(anti-gene)治療藥物。
2.現有技術的簡述與雙鏈DNA的小溝通過非共價鍵結合的小溝結合劑在本領域是已知的。能與雙鏈DNA或RNA以非共價鍵結合的嵌入劑也是熟知的。這些嵌入劑一般屬于平面芳香族化合物，它們嵌入(置身于)雙鏈DNA或RNA的嘌呤和嘧啶堿基對之間。美國專利US 4835263描述了一種與嵌入基共價結合的寡核苷酸。這種攜帶有嵌入基的寡核苷酸可用作雜交探針。
本發明概述本發明涉及寡核苷酸與小溝結合基共價結合的結合物。該結合物包括具有多個核苷酸單位、一個3′端、一個5′端的寡核苷酸和與至少一個所述的核苷酸共價結合的小溝結合基。小溝結合劑一般通過一條含有不超過15個原子的鏈即連接基與寡核苷酸相結合。小溝結合基是分子量為約150-2000道爾頓的分子基團，與雙鏈DNA、RNA或雜合體的小溝以非嵌入方式連接，其締合常數大于103M-1。
另一方面，本發明還涉及某些共價結合的寡核苷酸-小溝結合劑結合物的合成方法，以及該結合物用作核酸探針的方式及為有關分析和診斷以及治療目的(作為反義核酸和反義基因)用的方式。
附圖的簡要描述

圖1所示的是狹縫印跡雜交分析的結果本發明的詳細描述總的實施方案本發明新結合物的顯著特征是小溝結合劑與寡核苷酸共價結合，本專利申請的引言部分已經指出小溝結合劑是結合在雙鏈DNA的小溝內的分子。但由于這類化合物的結構變化大，不能用一般通式來表示所有已知小溝結合劑的化學結構。能與DNA小溝結合的化合物一般都有月牙形的三維結構。現有技術中的大多數小溝結合劑都優先與B型雙鏈DNA的A-T富含區結合。小溝結合劑或更準確地說本發明寡核苷酸-小溝結合劑軛合物的基團當然也優先與雙鏈DNA的A-T富含區結合(本發明的寡核苷酸-小溝結合劑軛合物在下文中存時也稱為ODN-MGB)。然而，優先與C-G(胞嘧啶和鳥嘌呤)富含區結合的在理論上也是可能存在的。因此含有這樣的優先與C-G富含區結合的小溝結合基的ODN-MBG亦屬本發明的范疇。已有的小溝結合劑優先與A-T區結合，可解釋為鳥嘌呤(G)的2-位氨基與某些已知的小溝結合劑之間存在立體位阻。從下文的詳述中可明顯看出，在本發明的ODN-MBG中鳥嘌呤(G)被6-羥基嘌呤取代后，上述不利的立體位阻不復存在，ODN-MGB與互補鏈的結合力可能增強。
一般地講，現有技術中已知的小溝結合劑一般不與雙鏈RNA或DNA和RNA的雙鏈雜合體結合。然而本發明的ODN-MGB卻能夠與單鏈RNA結合，上述性質是本發明的另一有趣的新方面。
根據本發明，能與ODN共價結合形成ODN-MGB軛合物的現有的小溝結合劑是一些天然產物如紡錘菌素、偏端霉素和lexitropsin、光輝霉素、色霉素A3、橄欖霉素、氨菌霉素、西伯利亞霉素和有關抗生素與合成衍生物。另一些雙季銨雜環化合物、二芳基脒如戊烷脒、芪脒和berenil、cc-1065與有的吡咯并吲哚和吲哚多肽、Hoechst 33258、4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)及許多由天然氨基酸或合成氨基酸構成的寡肽也是小溝結合劑。下列化合物的結構如下

偏端霉素
芪脒
甲基綠就本發明目的而言，如果一個分子能與雙鏈DNA的小溝結合，其間的締合常數為103M-1或更高，則該化合物就是小溝結合劑。這種結合可通過現有的光譜分析法如紫外光譜(U.V.)、核磁共振光譜(nmr)進行檢測，還可利用凝膠電泳法。紫外光譜在有小溝結合劑連接時吸收峰移動，以及利用“奧佛赫塞”(NOSEY)效應的核磁共振光譜均是實現此目的有用技術。凝膠電泳則檢測小溝結合劑與雙鏈DNA或其片段的結合，因為該結合使雙鏈DNA的遷移率發生了變化。
嵌入分子或嵌入劑易于與小溝結合劑區別開，嵌入劑為平面芳香族(優選多環)分子，而小溝結合劑(MGB)則為月牙形或類似幾何結構的分子。此外二者還可通過核磁共振光譜(nmr)中的“奧佛赫塞”(NOSEY)效應進行實驗區別。
如上所述，就本發明目的而言，如果一個分子與雙鏈DNA的小溝相結合的締合常數等于或大于103M-1，則該分子就是小溝結合劑。然而，某些小溝結合劑與雙鏈DNA的高親和部位相結合，締合常數可高達107-109M-1。
根據本發明，小溝結合劑經修飾則本質上成為小溝結合基，與適當的共價結構或原子鏈連接，小溝結合劑通過所述共價結構或原子鏈與寡核苷酸(ODN)相連。在某種意義上這種原子鏈可作為并有時被認為是小溝結合劑的一部分，因為這種連接并不影響ODN-MGB分子的小溝結合性能。然而，從概念上將小溝結合劑與將它與ODN共價連接的基團區別開更適于本發明的描述。這個由小溝結合劑衍生形成的基團在下文稱為“小溝結合基”。而連接小溝結合基與ODN的共價結構(不超過15個原子)則稱為“連接基”。這里先描述本發明的ODN-MGB軛合物的寡核苷酸部分，然后再詳細描述根據本發明的小溝結合基的優選實施方案。
從廣義上講，本發明的ODN-MGB軛合物的寡核苷酸含有約3-100個核苷酸單位。根據本發明，這些可形成ODN的核苷酸單位包括天然核酸中存在的主要雜環堿基(U、C、T、A、G)、這些堿基的天然與化學修飾物和這些堿基的類似物如6-羥基嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-N4亞乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶和6-氨基-4-羥基-[3，4-d]嘧啶。5-N4亞乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶和6-氨基-4-羥基[3，4-d]嘧啶的2-脫氧核苷的各自結構如下
2-脫氧5-N4-亞乙烯基胞苷 2-脫氧4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶核苷 2-脫氧6-氨基-4-羥基吡唑-[3，4-d]嘧啶核苷R＝2-脫氧-β-D-呋喃糖基此外，摻入本發明ODN-MGB軛合物中的ODN中的核苷酸單位可以具有交聯官能團(烷化劑)，它通過連接臂與一個或多個堿基共價結合。因這類結合有交聯劑的ODN-MGB軛合物構成了本發明優選實施方案中的重要一類，在下文下面將對這些結構進行更詳細的描述。
本發明ODN-MGB中的糖基或糖苷部分可以是脫氧核糖、核糖、2-氟核糖、2-O-烷基或鏈烯基核糖，其中所述的烷基可有1-6個碳原子，鏈烯基可有2-6個碳原子。在天然核苷酸及本文所述的修飾物和其類似物中，脫氧核糖和核糖部分形成呋喃糖環，糖苷鍵為β-構型，且嘌呤堿基通過9-位、嘧啶通過1-位以及吡唑并嘧啶通過1-位分別與糖環相連。根據本發明，寡脫氧核糖核酸為優選的，因此2-脫氧核糖為優選的糖。ODN的核苷酸單位通過磷酸酯骨架相互連接，這一點是本領域人員所熟知的。本發明ODN-MGB軛合物的ODN中除了可包含天然磷酸二酯鍵外，此外還可包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯連接。
本發明的ODN-MGB軛合物的寡核苷酸部分還可含有與寡核苷酸的3′-端或5′-端相連的較小分子量的“末端基”。在本文的上下文中應將末端基與小溝結合基加以區別，小溝結合基也同樣優選與ODN的3′-端或5′-端或兩者連接。這樣，末端基如果存在的話，則與不帶有小溝結合基的寡核苷酸的末端相連。例如，末端分子可以是磷酸鹽、磷酸酯、烷基、氨基烷基或親脂基。
關于本發明ODN-MGB的ODN中的核苷酸單位、磷酸酯骨架和末端的可能變化，請記住下文。本發明的ODN-MGB軛合物的主要用途在于該軛合物中的ODN能與單鏈DNA、RNA、雙鏈DNA及DNA-RNA雜合體的互補序列結合，小溝結合基摻入新形成的“雙鏈螺旋體”中，由此則增強了該“雙鏈螺旋體”的結合力，也就是增高了新形成的雙鏈螺旋體的熔化溫度(增大了締合常數)。此外，本發明優選的帶有“交聯劑”的ODN-MGB軛合物還使ODN-MGB與互補DNA或RNA鏈永久地共價結合，形成永久鍵合形式。根據上文所述，本領域的熟練技術人員容易理解，本發明ODN-MGB軛合物中的ODN的各部分的一級結構限制僅在于ODN部分與任何特異的靶序列形成互補鏈的能力；而且就其本身而論，本領域已知的大量的結構修飾有可能存在于這些結構中。而且一般說來，制備各種雜環堿基、核苷、核苷酸和構成本發明ODN-MGB軛合物的ODN部分的寡核苷酸的方法已經建立起來，并為本領域所熟悉。N4，N4-亞乙基-5-甲基脫氧胞嘧啶及其核苷、核苷酸或含有該堿基的寡核苷酸可按文獻的教導進行合成(Webb，T.R.；Matteucci，M.D.核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1986，14，7661-7674，Webb，T.R.；Mattencci，M.D.美國化學會志(J.Am.Chem.Soc.)，1986，1082764)。4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶、6-氨基-4-羥基吡唑并[3，4-d]嘧啶、及其核苷、核苷酸和含有該堿基的寡核苷酸則可按有關文獻教導進行合成(Kazimierczuk et al.J.Am.Chem.Soc.，1984，106，6379-6382)。為了制備特定的已知序列的ODN以便與靶序列互補，可按本領域的技術狀況進行寡聚核苷酸的合成，下文將對優選的方法進行描述。優選的方法描述于1993年7月12日申請、申請號為08/090,408的申請(該申請已被授權并且公開費已繳)中。將該08/090,408申請的說明書內容引入本文作參考。
所謂“連接基”是共價連結軛合物的寡核苷酸部分與小溝結合基的一種基團。優選地，該連接基是通過含有不超過15個原子的鏈進行連接的結構。根據本發明，小溝結合基也優選與寡核苷酸的3′或5′-端共價結合。然而，與中間位置的核苷酸、尤其與中間位置的核苷酸的堿基相連也屬于本發明的范圍。一般而言，連接基是雙官能分子衍生物，以便一個官能團如氨基可與例如ODN5′-端磷酸酯相連，另一官能團如羰基(CO)可與小溝結合基的氨基相連。此外，連接基也可以是氨基醇類衍生物，使羥基例如可與ODN3′端磷酸酯相連，而氨基則與小溝結合基的羰基相連。連接基的另一方案包括與氨基酸相連的氨基醇(通過酯鍵與3′端磷酸酯連接)，而所述的氨基酸則通過肽鍵與小溝結合劑的羰基相接。這樣，連接基的優選方案為具有下列通式的結構-HN(CH2)mCO、O(CH2)mCO和(CH2)mCH(OH)(CH2)mNHCO(CH2)mNH，其中m值應滿足使小溝結合基與ODN之間相隔不超過約15個原子。連接基的優選結構是-O(CH2)6NH、-OCH2CH(OH)CH2NHCOCH2CH2NH和-HN(CH2)5CO。正如上面已指出的那樣，連接基也可被認為是小溝結合基的一部分，在那種情況下，可以認為小溝結合劑直接與ODN相連。
小溝結合基結構的基本限制在上面已經指出，而且其尚難由特定的化學結構定義。小溝結合基上除了有可與小溝結合的分子結構外，還可有另外的官能團，只要這些官能團不干擾小溝的結合能力。例如，可使信息基團與小溝結合基共價結合，所述信息基團可使小溝結合劑易于通過顏色、紫外光譜或其它可見的物理或化學性質被檢測出來。該信息基團的例子是偶氨苯官能基，在優選實施方案的實例中它通過-HN(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)m-橋與小溝結合基的羰基相連。另外，小溝結合基帶有的信息基團或其它基團也可看成小溝結合基本身的一部分。
優選的ODN-MGB軛合物可用下文所列的結構式1來定義其結構，該定義包括根據本發明的優選的小溝結合基，同樣也可包括部分或全部的連接基及其它輔助基團如上面討論的信息基團。
結構式1這里X為O或S；q為3至100之間的整數；R8是H、OH、具有1-6個碳原子的烷氧基、O-C2-C6鏈烯基或F；B是糖苷配基，選自存在于核酸內的天然雜環堿基和6-羥基嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-N4-亞乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡咯并[3，4-d]嘧啶、6-氨基-4-羥基吡咯并[3，4-d]嘧啶；W1是H、PO(OH)2或其鹽，或者是與所述的寡核苷酸3′-或5′-端相連的小溝結合基，該W1包括通過不超過15個原子共價連接小溝結合基和寡核苷酸的連接基；W2是無或與一個糖苷配基B相連的小溝結合基，該W2包括將小溝結合基共價連接到所述糖苷配基B上的連接基，或者W2是含有連接臂的交聯官能團，該連接臂使所述的交聯官能團與所述的糖苷配基共價連結。
其中小溝結合基是分子量為150-2000道爾頓、以非嵌入方式與雙鏈DNA、RNA或雜合體的小溝相結合的、其締合常數大于約103的分子基團，條件是所述的W1和W2至少一個為小溝結合基；包含有連接基的小溝結合基具有選自(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的通式R1-(HN-Y1-CO)n-R2(a)其中Y1表示含有兩個雙鍵和0-3個雜原子(選自N、S、O)的五元環，NH和CO分別與同環的兩個碳原子相連，這兩個碳原子被一個原子隔開，這個原子未被取代或僅被H取代，環上的其余的原子可被1、2或3個R3基任意取代；R1-(R6N-Y2-CO)n-R2(b)其中Y2是六元芳香環與含有一個雙鍵的五元環縮合成的稠合環，該稠合環含有0-3個雜原子(所述雜原子選自氮、硫、氧)，R6N和CO分別與稠合環的兩個不同環上的碳原子相連，這兩個碳原子從一個共同橋頭原子算起，CO和NR6之間在稠合環的一邊有兩個非橋頭環原子而在另一邊有三個非橋頭環原子，所述的稠合環一邊的兩個非橋頭環原子可被R7任意取代，另一邊的三個非橋頭環原子可被R3任意取代；R1-(CO-Y3-NH)n-R2(c)其中Y3是含有0-3個N雜原子的六元芳香環，CO和NH分別與環上相對處于1、4位的兩個碳原子相連，六元環被連有CO或NH的兩個碳原子分成兩邊，一邊未與CO或NH基團相連的兩個環原子被R3任意取代，另一邊未與CO或NH基團相連的兩個環原子被R7任意取代；
R1-(NH-Y4-NH-CO-Y4-CO)p-R2(d)其中Y4是含有0-3個N雜原子的6元芳香環，NH、CO分別與環上相對處于1、4位的兩個碳原子相連，該六元環被環上連有CO或NH的兩個碳原子分成兩邊，一邊未與CO或NH相連的兩個環原子可被R3任意取代，另一邊未與CO或NH基團相連的兩個環原子可被R7任意取代；R1-(Y5)n-R2(e)其中Y5是六元芳香環與含有一個雙鍵的五元環的稠合環，該稠合環有0-3個雜原子，所述雜原子選自N、S、O，R1和R2分別與稠合環的不同環上的環碳原子相連，它們從共同的橋頭原子算起均是第二個環原子，在R1和R2之間該稠合環的一邊有兩個非橋頭環原子而在另一邊則有三個非橋頭環原子，所述的稠合環一邊的兩個非橋頭環原子可被R7任意取代，另一邊的三個非橋頭環原子可被R3任意取代；這里R1、R2獨立地為H、F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3+、OH、-O-、-S-、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2、R4、H2N(CH2)mCO、CONH2、CONHR4、H2N(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4、-HN(CH2)mCO、-CONH-、-CONR4、-HN(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4和-(CH2)mCH(OH)(CH2)mNHCO(CH2)mNH-，或者R1和R2中有一個基團下存在；R3為選自下列基團的基團F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3+、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2和R4，或者R3是可形成與Y1環成稠合環的3、4、5或6元環的基團；R4是含有1-20個碳原子的烷基或環烷基、含有1-20個碳原子和1-3個雙鍵的鏈烯基或環烯基、含有不超過25個碳原子的碳環芳基、含有不超過25個碳原子的雜環芳基、含有不多于25個碳原子的碳環或雜環芳烷基，其中R4可被1、2或3個F、Cl、Br、I、NH2、NHR5、N(R5)2、N(R5)3+、OH、OR5、SH、SR5、COR5、CONHR5、CON(R5)2或R5基團任意取代；
R5是具有1-6個碳原子的烷基，R6是H、具有1-5個碳原子的烷基，或者R6和R7共同形成一個4、5或6元環，任意-O-、-S-、-NH-、-NCH3-或N-低級烷基是上述環的一部分；R7是F、CH3-或-CH2CH3；-CH2-或-CH2CH2-；m是1-10之間的整數n是1-10之間的整數，以及P是1-5之間的整數。
本發明更為優選的ODN-MGB軛合物是其中的小溝結合基定義如下的那些軛合物(1)小溝結合基由上面的通式(a)表示，并且其五元環的結構為 結構式2(2)小溝結合基由通式(a)表示，其中的五元環的結構為 結構式3(3)小溝結合基由通式(b)表示，且其中稠合環的結構為 結構式4含交聯基的實施方案本發明優選的一類ODN-MGB軛合物還包括一個或多個“交聯基”，在ODN-MGB軛合物與互補DNA、RNA或其片斷的靶序列結合后，所述的交聯基即與靶序列進行不可逆的反應，形成共價鍵。這種與靶序列的共價結合可用用分析、診斷如用作雜交探針，還可用于治療用途(用作反義核酸、反義基團)。小溝結合基與ODN的共價結合增強了ODN-MGB軛合物與靶序列間初始的非共價結合力，因而有利于隨后的通過交聯基的共價結合。就摻入到這類ODN-MGB軛合物中的交聯基而言，應考慮下列情況。
本發明的交聯基與ODN-MGB軛合物的某一部位共價結合。其長度和立體取向應符合這樣的要求，即在ODN-MGB軛合物與靶序列雜交后，該交聯基應到達靶DNA或RNA內的適當的反應位點。就定義而言，交聯基(劑)具有與靶DNA或RNA序列的活性基團反應的活性基團。該交聯基(劑)可與ODN-MGB軛合物的一個或多個雜環堿基、與糖基或修飾的糖基、磷酸酯基或修飾的磷酸酯共價結合。交聯基也可與小溝結合基相連，只要不影響它與小溝的結合能力。最好交聯基(劑)與一個雜環堿基相連。
簡單而言，交聯劑從概念上可分成兩個基團或部分，即反應活性基和臂(A)，所述的反應活性基一般是而且最好是親電離去基(L)，所述的臂將離去基連接到ODN-MGB上的各自位點上。這些離去基例如可以選自Cl、Br、I、SO2R、或S+RR′，其中R、R′互不相干地為(C1-C6)烷基或芳基，或者R′或R′一起形成C1-6亞烴基橋。其中以Cl、Br、I為最佳。在這些基團中，鹵乙酰基如-COCH2I和雙官能“氮芥”如-N-[(CH2)2-Cl]2是優選的。各離去基由于其離去能力(不同)而會有所變化。依據各離去基的內在性質和反應活性來選擇在每種情況下要用的離去基以得到所需的不可逆結合探針的特異性。
雖然上面已指出，“臂/(或連接臂)A從概念上可被認為是一個實體，即使ODN-MGB與離去基共價結合的實體，使離去基相對于ODN-MGB保持期望的距離和立體位置。實際上臂A可在合成方案中構建出來，其中在小溝結合基與ODN-MGB或ODN連接前，雙官能分子通過其第一官能團與ODN-MGB軛合物或ODN共價結合(例如通過磷酸酯鍵連于ODN的3′或5′-端、通過C-C鍵與雜環堿基相連，或通過C-N鍵與氨基取代的雜環堿基相連)，并通過其第二官能團(如-NH2)與烴基橋(烷基橋、烷基芳基橋或芳基橋等)連接，而這些橋上攜帶有離去基。
交聯基的一般通式為-A-L或A-L2，L為上面定義的離去基，A是與ODN-MGB共價結合的部分。臂A本身在ODN-MGB與靶序列雜交的條件下應無反應活性(只有通過離去基才表現反應活性)，并應使離去基與希望的反應位點如靶序列中鳥嘌呤(G)的N-7位保持所需的立體位置與距離。通常A的長度與約有2-20個碳原子的正烷基鏈長相當。
一類優選交聯基的較為具體的示例性的通式是-(CH2)q-Y-(CH2)m-L，其中L是離去基(定義如上)，m和q各自獨立地為0-8(包括0和8)，而Y定義為“官能連接基”為了清楚描述起見，該官能連接基應與連接小溝結合基和寡核苷酸(ODN)的“連接基”區別開來，盡管此處所述的連接交聯基的“官能連接基”也可用來使小溝結合基與ODN的任何一端或與ODN的中間位置的核苷酸相連。“官能連接基”是有兩個官能團如-HN2和OH、或COOH和OH、或COOH和NH2的基團，它們能連接(CH2)q和(CH2)m成橋。末端炔基(HC≡C-)基也是Y的一個恰當的官能團，因為它能與某些雜環偶聯，如下文所述。
一類優選交聯基的其它示例性的且較為具體的通式為-(CH2)q-NH-CO-(CH2)m-(X)n-N(R1)-(CH2)p-L和-(CH2)q′-O-(CH2)q″-NH-CO-(CH2)m-(X)n-N(R1)-(CH2)p-L這里q、m、L的定義同上文描述交聯基時所述的定義。q′為3-7(包括3和7)，q″為1-7(包括1和7)，X為苯基或簡單取代的苯基(如Cl、Br、低級烷基或低級烷氧基取代的苯基)，n為0或1，p為1-6的整數，R1為H、低級烷基或(CH2)p-L。p優選為2。本領域的專業人員都清楚-N(R1)-(CH2)2-L描述的是氮芥的結構，后者是一類潛在的烷化劑。在ODN-MGB軛合物中，那些其中的交聯劑含有-N(R1)-(CH2)2-L這樣的官能團的是特別優選的，其中L是鹵素，最好為Cl；更為優選的是其中的交聯劑含有N-[(CH2)2-L]2(雙官能氮芥)這樣基團的那些。交聯劑的部分結構最好含有基團-CO-(CH2)3-C6H4-N[(CH2)2Cl]2
在一個最優實施方案中，剛才提到的交聯基與ODN的5′和3′-端帶有N-正己基氨基的尾巴相連，結構如下R1-O-(CH2)6-NH-CO-(CH2)3-C6H4-N-[(CH2)2Cl]2其中R′表示ODN的5′或3′-端磷酸酯基。另一末端或中間的核苷酸與小溝結合基相結合。
根據本發明的其它的優選實施方案，交聯基與雜環堿基如與ODN-MGB軛合物中的2-脫氧尿核苷酸的尿嘧啶共價結合。這種結合可通過氨基進行，亦即可使”臂-離去基結合體”(A-L)與ODN的5-氨基-2′-脫氧尿苷酸相連。在另一優選實施方案中，“A-L”通過碳-碳鍵與ODN的2′-脫氧尿苷酸的5-位相連。一般而言，5-取代的2′-脫氧尿苷可通過改進的Robins等人的方法(Can.J.Chem，60554(1982)；J.Org.Chem.481854(1983)進行合成。根據該改進的方法，在鈀催化下，取代的1-炔烴與5-碘-2′-脫氧尿苷偶聯反應得到乙炔偶合產物。該乙炔脫氧尿苷類似物用例如蘭尼鎳還原，得飽和化合物，然后使后者直接轉化為用于自動DNA合成儀的試劑。可按照該方法與5-磺-2′-脫氧尿苷進行偶聯反應的其它試劑是HC≡CCH2OCH2CH2N(CO)2C6H4(苯二甲酰亞氨基乙氧基丙炔-1)和HC≡CCH2OCH2CH2NHCOCF3(三氟乙酰氨基乙氧基丙炔-1)。
本這些實施例中，將按上述路線合成的核苷引入ODN，并僅在除去了各自的苯二甲酰基或三氟乙酰基等保護基后，使交聯劑的烷化部分與末端氨基結合。其中交聯劑與雜環堿基相連的其它核苷酸的例子是2′-脫氧-4-氨基吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物。這些化合物可根據已公開的PCT申請WO90/03370(1990年4月5日公開)的方法制備。
在對本發明修飾的ODN的結構進行一般討論時，發現以球-棍模型和高分辨率計算機圖形學對雙鏈DNA的研究表明嘌呤的7-位和嘧啶的5′-位位于雙鏈核酸B型螺旋體的大溝上。這些位置可用較大體積的側鏈取代，而不影響堿基的雜交性質。這些側鏈可通過脫氧胸苷(dThd)或脫氧胸苷(dCyd)衍化引入或通過雜環堿基的直接全合成然后再進行糖基化而引入。這些修飾的核苷可被轉化為用自動DNA合成儀引入到寡核酸中的適當活化的核苷酸。吡唑并[3，4-d]嘧啶是腺嘌呤類似物，交聯臂與其3-位(相當于嘌呤的7-位)相連。
該交聯側鏈(臂＝A)應有足夠的長度，使其能從嘌呤的7-或8-位、嘧啶的5-位、吡咯并嘧啶的5-位或吡唑并嘧啶的3-位穿過大溝與嘌呤(最好為鳥嘌呤)的N-7位反應，這個嘌呤位于含有該被修飾類似物的堿基對的上方(在寡聚物的3′端)。在該雙鏈復合體內，當堿基與另一堿基配對時，該交聯側鏈(臂＝A)使官能團離開這個已配對的堿基。象上面所指出的那樣，廣義上講，臂A的長度應與含2-20碳的正烷基鏈長相當。最好臂A為含有1-12碳原子的亞烷基、含有2-12碳原子且1或2個烯鍵的鏈烯基、含有2-12碳原子且1或2個炔鍵的炔基，或者其末端用親核基如O、S、氨基取代的基團或被保護的其衍生物(例如三氟乙酰氨基、苯二甲酰亞氨基、CONR′、NR′CO、SO2NR′(這里R′＝H或C1-6烷基)取代的基團)。這些官能團包括脂肪胺或芳香胺)表現出親核性且能與下面這些基團相連-(CH2)m-L和-CO-(CH2)m-(X)n-N(R1)-(CH2)p-L如上文所述，這些基團是示例性交聯官能基的一部分。
在連有交聯基(A-L)或其適當的前體如-(CH2)q-NH2或-(CH2)q-Y，其中Y以親核基團如NH2為末端)的核苷或核苷酸合成后，本發明的修飾的寡核苷酸的進一步合成可根據本領域現有的方法進行。因此，為合成寡核苷酸，在核苷或核苷酸上引入保護基并使這些化合物活化以用于寡核苷酸的合成。向被保護的、活化型核苷(酸)的轉化可參考有關2′-脫氧核苷的幾篇綜述(見Sonveaux，生物有機化學(Bioorganic Chemistry)14274-325(1986)；Jones，寡核苷酸的合成-一種實際的途徑(“Oligonucleotide Synthesis，aPractical Approach”)，M.J.Gait，編輯，IRL出版，23-34頁(1984))。
將活化核苷酸引入寡核苷酸的方法與DNA和RNA的合成相似，即將正確的核苷酸逐步連接成一條與靶DNA或RNA的核苷酸序列互補的核苷酸鏈。核苷酸的引入可采用酶法或化學合成法。可將核苷酸修飾成其相應的5′-O-二甲氧基三苯甲基-3′-(N，N-二異丙基)亞磷酰胺氰乙酯衍生物，再按(Oligonucleotide SynthesisAPractical Approach)文中的方法摻入合成的寡核苷酸。然后，N-保護基與其它保護基分別用氨解和本領域已知的常規方法脫去。
在一個優選實施方案中，活化核苷酸可根據使用的合成儀的使用方法和操作規程直接用于自動DNA合成儀。采用標準經濟的亞磷酰胺或H-磷酸酯合成化學法，該寡核苷酸可在合成儀上制備。
在寡核苷酸合成及除去任何保護基后，可將含離去基如鹵乙酰基或-CO-(CH2)m-(X)n-N(R1)-(CH2)p-L(最好是CO-(CH2)3-C6H4-N[CH2CH2Cl]2)基團加到末端氨基烷基或類似末尾(-(CH2)q-Y)上。
如果交聯劑(A-L)通過例如烷基氨基(其通式為-(CH2)q-L，其中Y以氨基為末端)與寡核苷酸的3′端或5′-端相連，在這種情況下應先合成帶有氨基烷基末端的寡核苷酸，然后再將烷化基如上面提到的鹵酰基或-CO-(CH2)m-(X)n-N(R1)-(CH2)p-L引入其中，來進行寡核苷酸的合成。
優選的示例性ODN-MGB軛合物的結構如下，該軛合物具有與核苷酸堿基之一相連的交聯劑5′-GGTTATTTTTGAAGATACGAATTTCUCCAGAGACACAGCAGGATTTGTCA-CDPI3其中符號“U”(該50聚核苷酸中的第26位核苷酸)表示5-(3-氨基丙基)-2′-脫氧尿苷，該尿苷具有與氨基相連的苯丁酸氮芥殘基。符號“CDPI3”表示小溝結合基(將結合反應路線1描述于下文)。通過采用5′-O-三苯甲基-5-三氟乙酰氨基丙基-2′-脫氧尿苷-3′-(N，N-二異丙基-氰乙基-亞磷酰胺，根據Gibson，K.J.和Benkovic，S.J.的方法將5-(3-氨基丙基)-2′-脫氧尿苷引入寡核苷酸中(Gibson，K.J.，& Benkovic，S.J.核酸研究(Nucleic AcidRes.)1987，156455)。ODN與苯丁酸氮芥殘基和小溝結合基的連接描述于下文的實驗部分。
小溝結合基和ODN-MGB軛合物的合成目前，最優選的本發明小溝結合基是從1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸和4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸衍生的寡肽。這些寡肽是合成肽，它們具有分別由結構式2和結構式4所示的重復單元，其中聚合度m值優選為3-5。對結構式2所示的肽，m值以5為最佳；對結構式4所示的肽，m值以3為最好。反應路線1是一個三肽(簡稱為CDPI3)的合成路線，該肽經修飾或不經修飾可直接與ODN相連，得到優選的本發明ODN-MGB軛合物。
反應路線1
在反應路線1中，起始原料為3-氨基甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸或3-叔丁氧羰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸，它們可按有關的化學文獻方法(D.L.Boger，R.S.Coleman和B.J.Invergo，有機化學雜志(J.Org.Che-m.)，1987，521521-1530)制備。起始原料以三氟乙酸四氟苯酯(TFP-TFA)處理，轉化成活性酯。在化合物1a中，R為CONH20在1b中，R為叔丁氧羰基(tBoc)。叔丁氧羰基(tBoc)是熟知的可用酸除去的用于保護氨基的保護基。使所得的活化酯1a和1b與1，2-二氫-3H-吡咯吲哚-7-羧酸甲酯(亦可根據文獻合成，參見D.L.Boger、R.S.Coleman和B.J.Invergo，J.Org.Chem.，1987，521521-1530)反應，得二肽2a和2c。再用堿處理去掉羧基官能團中的甲基以得到有游離羧基的二肽。該二肽用四氟苯酚再次活化得活化酯(當R＝CONH2，TFP-CDPI2時為2e；當R＝tBoc，TFP-tBoc-CDPI2時為2f)，在經TFP-TFA活化后，該二肽活化酯可與ODN結合形成ODN-MGB軛合物，其合成見三肽。該二肽的活化酯也可與另一分子1，2-二氫-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯反應，得到三肽(其羧基通過甲酯保護)3a(3-氨甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸甲酯三肽)。所述的甲基用堿水解除去，使所得的三肽3b經四氟苯酚活化得活化的四氟苯酯3c(3-氨甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸-2，3，5，6-四氟苯酯三聚體，TFP-CDDI3)。通過重復上述步驟，活化的四氟苯酯3c可用來進一步使肽鏈延長，即通過與1，2-二氫-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯反應，使所得的甲酯皂化，并如果需要再與TFP-TFA反應，得到摻入了4個CDP[的肽的活化四氟苯酯。因此，很容易理解，可進一步重復這些步驟，直至得到含有所需數目CDPI單體的寡肽。在本文所述的優選實施方案中，三肽3c的四氟苯基活化酯用來與ODN偶聯得ODN-MGB軛合物，或者在適當修飾的CPG(控制孔徑的玻璃)固相載體上合成ODN-MGB共軛物，這一過程結合反應路線4和5描述于下文。反應路線1表明其最后步驟是從三肽3c的四氟苯基活化酯(TFP-CDPI3)制備羥基丙基胺衍生物的步驟。三肽3d的羥基丙胺衍生物3d(3-氨基甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羰基-1-酰氨基-3-丙醇三聚體，CDPI3-3-羥基丙胺)可用來與ODN結合得到本發明的ODN-MGB。然而，該三肽3d還可作為游離的小溝結合劑在下文描述的某些結合研究中用作對照。

反應路線2反應路線2公開了另一優選的小溝結合劑(肽)的合成路線，其中的單體為4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基，而且這個肽含有信息基團/含苯偶氮基。這樣，在N，N-二環己基碳二亞胺存在下，6-[(叔丁氧基)甲酰氨基]己酸與2-[4-(苯偶氮基)-芐基硫]乙醇縮合得到化合物11(5-[(叔丁氧基)甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫)乙酯)。用三氟乙酸(TFA)將化合物11中的保護基tBoc脫去，所得的有游離氨基的化合物與受tBoc保護的4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸的活化酯反應。所述的活化酯化合物(1，2，3-苯并三唑-1-基1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基-吡咯-2-羧酸酯)可由1-甲基-4-[(叔丁氧基)甲酰氮基]吡咯-2-羧酸制得，后者可根據文獻方法(L.Grehn，V.Ragnarsson，J.Org.Chem.，1981，46，3492-3497)得到。反應得到的化合物12(5-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙酯)含有一個2-氨基-N-甲基吡咯羧酸殘基，該殘基上連有含有苯偶氮基的信息基團。用三氟乙酸除去保護基tBoc后，再與一分子或多分子的1-甲基-4-叔丁氧基甲酰氨基-吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯進行偶聯反應，直至得到含所需數目殘基的寡聚肽。這樣具有n個單體殘基及1個游離氨基的化合物在反應路線2中如圖16a所示。16a可與受tBoc保護的6-氨基己酸的活化酯(如1，2，3-苯并三唑-1基活化酯)反應，得到如反應路線2中以16b所示的寡肽。可在酸性條件下除去16b中的tBoc保護基，并可將所得的具游離氨基的衍生物，通過傳統合成方法與ODN的3′-磷或5′-磷酸相連。此外，具游離氨基的該衍生物還可通過雙官能連接基(如上文所述)與寡核苷酸的3′或5′-羥基相連。
反應路線3反應路線3描述的是以3′-氨基或5′-氨基為末端的寡核苷酸與四氟苯基(TFP)酯活化的小溝結合(寡)肽相偶聯的一般方法。雖然在該圖中顯示的是根據反應路線1得到的以TFP活化的小溝結合化合物的使用，但應記住這個一般方法也適用于其它的四氟苯基活化的小溝結合劑與ODN的偶連。反應路線3中的標號1a～3c指的是按反應路線1制備的示例化合物。
3′-或5′-端氨基為末端的寡核苷酸可通過常規方法合成；例如氨基己基通過可商購的N-甲氧基三苯甲基氨基己基亞磷酰胺與ODN的任何一端連接。此外，以氨基為末端的ODN也可根據1993年7月12日申請的申請號為08/090,408(已批準授權且公布費已付)所公開的方法合成。該專利申請的說明書的內容引入本文作參考。根據本合成路線，將以氨基為末端的ODN轉化為十六烷基三甲銨鹽，以使其可溶于有機溶劑，再使其與四氟苯基酯活化的小溝結合劑縮合，反應最好以DMSO為溶劑。
反應路線4反應路線4公開的是以5′-氨基為末端的寡核苷酸與小溝結合劑的活化酯偶聯的另一方法。該圖中的例子是自3-氨基甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸殘基衍生的三肽的四氟苯酯(TFP-CDPI3)，但應該明白這個結合本反應路線公開的一般原理也適用于其它小溝結合劑。在該方法中，ODN仍然與CPG載體相連，并且在其氨基末端有游離氨基。可通過上面提到的N-甲氧基三苯甲基氨基己基亞磷酰胺得到，在該磷酰胺偶合后，脫去其中的甲氧基三苯甲基以得到結合在CPG上以氨基為末端的ODN。此外，這個連有CPG的化合物還可按上文提到的專利申請No.08/090,408及其引用的文獻所公開的方法合成。順便總結一下，逐步合成與CPG載體偶聯的ODN，該ODN帶有末端氨基，該氨基是以9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)保護的。當所需的寡核苷酸合成完畢后，脫去Fmoc，這時ODN仍然與CPG載體相連。根據本發明的反應路線4，使帶有游離氨基結合在CPG上以氨基為末端的ODN與活化酯(TFP-CDPI3，3c)或類似的小溝結合劑活化酯縮合。此后通過常規方法(最經常用氨處理)，將ODN-MGB軛合物從CPG載體上脫下。
a試劑(a)TFD-TFA、三乙胺、CH2Cl2；(b)3-氨基-1，2-丙二醇、CH2Cl2；(c)DMTrCl、吡啶；(d)琥珀酸酐、N-甲基咪唑、CH2Cl2、TFP-TFA；(e)烷基胺CPG、吡啶；(f)哌啶、DMF；(g)TFP-CDPI3(反應路線1中的3c)、DMF反應路線5
反應路線5所示的是合成本發明的ODN-MGB軛合物的另一優選方法。具體地講，該法是先把連接分子與CPG載體相連，然后再把活化的小溝結合劑與連接分子相連，用自動ODN合成儀，以剛才述及的修飾的CPG為載體，逐步合成所需序列的寡核苷酸。僅當完成了所需序列的ODN部分的合成后，才從CPG載體上脫下ODN-MGB軛合物。這里的連接分子為三官能團，每個官能團具有不同的反應活性，一個與CPG載體相連，另一個與活化的小溝結合基反應，第三個則用于ODN的合成。有關這個合成方法和可用于該方法內的三官能連接分子的更一般的詳細描述見于申請號為08/090,408的申請中，但該申請未涉及小溝結合劑。在反應路線5所示的合成方法中，以β-丙氨酰基-3-氨基-1，2-丙二醇作為三官能連接分子，以TFP-CDPI3為活化的小溝結合劑。
這樣根據反應路線5，Fmoc保護的β-丙氨酸與三氟乙酸四氟苯酯(TFP-TFA)反應以得到3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)]氨基丙酸2，3，5，6-四氟苯酯(4)。活化酯4與3-氨基-1，2-丙二醇反應得到1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-(R，S)-2，3-丙二醇(5)。此后，化合物5的伯羥基用二甲氧基三苯甲基保護，得到1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-(R，S)-2-[[二(甲氧基苯基)苯基甲氧基]甲基]2-乙醇(6)。化合物6的仲羥基與琥珀酸酐反應，此后將所得化合物中的羧基轉化為活化酯1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-(R，S)-2-[[二(甲氧基苯基)苯基甲氧基]甲基]-2-乙基丁二酸2，3，5，6-四氟苯酯(7)。然后使化合物7與長鏈氨基烷基-CPG(LCAA-CPG或烷基氨基CPG)相連(后者可自市售購得并在申請號為08/090,408的專利申請中已有描述)。得到的“經修飾的CPG”以化合物8示于反應路線5中。用中性堿(溶于二甲基甲酰胺中的哌啶)脫去保護基Fmoc得到經修飾的CPG(9)，該化合物9含有作為連接劑的一部分的游離的伯胺基。下一步，使活化的小溝結合劑(這里為TFP-CDPI3，化合物3c)與化合物9的伯氨基反應，得修飾的CPG(10)，后者含有小溝結合基和用二甲氧基三苯甲基保護的連接基的伯羥基。在接下來的步驟中(雖然這些反應步驟未在反應路線5中示出)，二甲氧基三苯甲基被除去，ODN的合成用自動合成儀按現認為是本領域常規方法的方法進行。合成完畢后，用氨將ODN-MGB軛合物從CPG載體上脫下。這時連接3-氨基-1，2-丙二醇的仲羥基與CPG載體的鍵斷裂。
生物學試驗與結果討論
ODN-MGB軛合物能與單鏈DNA結合。在重組酶作用下它們也能與雙鏈DNA結合，并且在某些情況下還能與單鏈RNA及DNA和RNA的雜交體結合。但只有ODN與靶DNA或RNA的靶序列按Watson-Crick規則互補或基本上互補時，才發生這種結合。滿足這一條件后，ODN-MGB軛合物與靶序列的結合明顯強于無MGB與之結合的同樣的ODN與靶序列的結合。這些可用下面的生物學試驗來證實，這些使得本發明的ODN-MGB軛合物可作為靶DNA或RNA序列的分析和診斷雜交探針，也可用作反義核酸和反義基因治療劑。
表1(dAP)8+(dTp)8雙鏈螺旋體的熔化溫度(Tm)的數據a，表中雙鏈螺體寡核苷酸的3′端連有嵌入劑或寡聚(1-甲基-2-羧基-4-氨基)吡咯殘基。
a參數為至少三次實驗的平均值。雙鏈螺旋體在0.2M NaCl、0.1mM EDTA、0.01M(±0.1℃)Na2HPO4，pH7.0的緩沖液中熔化，(dTP)8·(dAP)8的濃度為2.5×10-5M。
b修飾和未修飾雙鏈螺旋體的熔化溫度的差值(ΔTm)c偏端霉素的濃度為2.5×10-5Md ODN的3′磷酸酯通過β-丙氨酸接頭與溴乙錠的8-氨基連接，方法參考文獻12。
表1列出了幾種互補寡核苷酸所形成的復合物的熔化溫度，所述的寡核苷酸連有小溝結合基，后者是自4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基衍生而來，該小溝結合基具體地以表1下面的結構式X表示。需要指出，X還包括自6-氨基己酸衍生的連接基。此處使用的寡核苷酸為八聚2′-脫氧腺苷酸和8-聚2′-脫氧胸苷酸。小溝結合基(X)與寡核苷酸3′-磷酸酯端相連，這些ODN的5′端無磷酸酯。關于這一點，須指出的是本表(包括其它表)中的寡核苷酸按本領域的習慣方式縮寫。基團Y表示通過“β-丙氨基”連接基與3′-磷酯相連的溴乙錠部分。Y代表嵌入基，作為與小溝結合基比較時的對照。m表示存在于表中的各ODN-MGB中的4-氨基-N-甲基-吡咯-2-羧酸殘基的數目。
正如本領域所公知的，寡核苷酸或多聚核苷酸雙鏈螺旋體的熔化溫度(Tm)定義為50％的寡核苷酸或多聚核苷酸自其雙鏈螺旋體(WatsonCrick氫鍵型)解離時的溫度。熔化溫度越高則意味著雙鏈螺旋體愈穩定。此外，還已知寡核苷酸和多聚核苷酸的Tm還依賴于寡核苷酸在測熔化溫度溶液中的濃度，濃度高，則測得的熔化溫度也高。這些表中所列的Tm是在表中或實驗部分所指出的條件下測定的。ΔTm表示修飾的雙鏈螺旋體的熔化溫度與未與小溝結合基結合的(dAp)8·(dTp)8復合物的熔化溫度的差值。
從表1可以發現，共價結合的小溝結合基顯著增加了雙鏈復合體的穩定性(熔化溫度Tm升高)，這里小溝結合基(X)與(dTp)8或(dAp)8寡核苷酸相連。這種情況下，當小溝結合基是5肽時，穩定程度達到最大(熔化溫度最高)。在比較試驗中，當嵌入基Y與(dAp)8寡核苷酸結合時，則穩定程度相對地小得多。在該試驗中，甚至當嵌入基Y與寡聚體的兩條鏈同時連接時，熔化溫度的增加也比連有5個4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基的小溝結合基要小。
表2由十六聚或八聚胸苷酸和帶有寡聚脫氧腺苷酸的寡聚(1-甲基-2-羧基-4-氨基)吡咯衍生物所形成的雙鏈螺旋體的熔化溫度(Tm)數據，該溫度是在0.2M NaCl、0.01M Na2HPO4、0.1MEDTA(pH7.0)中測定的。X的定義與表1中的相同。
表2公開信息的方式與表1類似。在本表報導的試驗中，使帶有小溝結合基(用X表示，同表1中的X)的16-聚胸苷酸與多聚脫氧腺苷酸形成復合物。作為對照，對在其3′-磷酸酯端與6-氨基己酸相連的16聚胸苷酸(dTp)16也進行了測驗。此外，還對8聚胸苷酸(dTp)8及其與具有不同長度肽鏈的小溝結合基所形成的軛合物進行了實驗。在這些實驗中，與ODN相連的小溝結合劑也顯著增加了ODN-MGB與互補DNA鏈所形成的復合物的穩定性。當小溝結合基內的4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基的數目為5個時，則復合物最穩定。相反，16聚ODN上的氨酸己酸尾巴，實際上不能增加復合物的穩定性。
表3由poly(Tp)8或poly(rA)與末端連有配體CDPI1-3或BocDPI1-2的(Tp)8所形成的雙鏈螺旋體的熔化溫度a。
a括號內的數據是帶有接頭L2的該衍生物測得的。
b沒觀察到熔化轉變。
L1＝-O(CH2)6NH-L2＝-OCH2CH(OH)CH2NHCOCH2CH2NH-
表3公開的是熔化溫度(Tm)和熔化溫度差值(ΔTm)，這里寡核苷酸是八聚胸苷酸，并有一個小溝結合基與它的5′-磷酸酯或3′-磷酸酯端相連(如表3所示)。此處小溝結合基用X表示，Y是基于1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸(CDPI或BocDPI)殘基的寡肽，其結構見表3。這些小溝連接肽(基)通過連接基“L1或L2”與ODN相連，L1和L2的結構見表下面。對該ODN-MGB軛合物與互補的均聚核苷酸或均聚脫氧核苷酸進行溫育。這樣對含有聚胸苷酸的ODN-MGB軛合物，使用聚腺苷酸或聚脫氧腺苷酸與之結合。熔化溫度的變化(ΔTm)是復合物的熔化溫度相對于在ODN的相應末端帶有連接基L1或L2但不含小溝結合基的相應的ODN的熔化溫度的差值。從表3可以發現，這些ODN-MGB復合物再次顯示出帶有互補的均聚脫氧核苷酸的復合物有顯著的穩定性。而且在這些實驗中，當小溝結合基具有3個CDPI單位時，形成的復合物最穩定。令人驚異的是甚至當ODN-MGB和能與之互補結合的均聚核苷酸保溫時，也發生復合物的穩定作用。這種吃驚是因為現有技術普遍認為游離小溝結合分子并不與DNA-RNA雜交體結合之故。
表4異源雙鏈螺旋體的熔化溫度(Tm)，其中ODN的連接骨架為磷酸二酯和硫代磷酸酯鏈，吡咯并吲哚甲酰胺寡肽殘基與ODN的不同部位連接a。
a ODN在140mM KCl、10mM MgCl2、20mM HEPES-HCl(pH7.2)熔化混合物中的濃度是2×10-6Mb ODN有游離3′-和5′-OHc PS為硫化磷酸酯連接
L1＝-O(CH2)6NH-L2＝-OCH2CH(OH)CH2NHCOCH2CH2NH-表4公開的是兩個互補的八聚體衍生物(CpApTpCpCpGpCpT和ApGpCpGpGpApTpG)之間形成雙鏈螺旋體的研究結果。每個八聚體均被修飾(如該表所示)以檢驗相應的寡聚脫氧核苷酸和有硫代磷酸酯骨架的寡聚脫氧核苷酸的雜交。該ODN仍然帶有基于1，2-二氫-3H-吡咯[3，2-e]吲哚-7-羧酸(CDPI)殘基的三肽(小溝結合基X)，該X通過結構為L1或L2的連接基與ODN的3′-或5′-端(如圖所示)相連，(X、L1、L2的結構同表3中的)。為了對照，還測定了其中的ODN僅與連接基結合的雙鏈螺旋體的熔化溫度，從表中可以發現，小溝結合基的存在使雙鏈螺旋體明顯得以穩定，而且如每條鏈均共價連有小溝結合基時，則雙鏈螺旋體更穩定。
表5帶有3′-寡聚吡咯并吲哚甲酰胺的寡肽殘基的異源雙鏈螺旋體的Tm。
L1＝-O(CH2)gNH-L2＝-OCH2CH(OH)CH2NHCOCH2CH2NH-
表5公開的是互補或大體互補的ODN進行溫育并檢驗雙鏈螺旋體形成時所獲得的熔化溫度。小溝結合基X和連接基L1和L2均示于該表中，而且它們均與表3、表4中的相同。象預料的那樣，如果沒有小溝結合基存在的話，當ODN鏈中的鳥嘌呤(G)被次黃嘌呤(I)取代時，雙鏈螺旋體的結合很弱(Tm約為0℃)。然而，當用I取代寡核苷酸中的G時，一個共價連接的小溝結合基X的存在則使雜交體的穩定性(Tm)增加至約50℃，而以相互平行方向存在的兩個小溝結合基，則使穩定性(Tm)增加至約63℃。而對含有鳥嘌呤的相同的鏈而言，一個小溝結合基使Tm增加15℃，兩個則增加近45℃。就本案發明人所知，八聚核苷酸的熔化溫度達到81℃是現有技術中從未有過的。
引物延長實驗ODN-MGB軛合物中的ODN部分與靶序列按Watson-Crick規則結合的序列特異性可通過引物延長實驗來證實。在這個實驗中，在T7DNA聚合酶的作用下，引物從模板的5′-端開始延長。將與模板鏈的靶序列按Watson-Crick互補的16聚核苷酸-小溝結合劑軛合物、T7DNA聚合酶和長的單鏈DNA模板一起溫度。當小溝結合基與上述16聚ODN的5′-端相連時，則會發現引物延長終止于ODN-MGB與模板的結合部位，所述的小溝結合劑為吡咯并吲哚的三肽，如表5所示。但當16聚核苷酸與靶序列有一個錯配堿基時，引物延長則不受阻礙。當小溝結合基與16聚ODN的3′-端相連時，也不影響引物延長。此外，在序列特異的16聚核苷酸、游離小溝結合劑(化合物3d，未與ODN共價結合)與酶和模板一起溫育時，引物延長也不受影響。這些實驗表明ODN-MGB的序列特異性對于形成穩定的雜交體是重要的，小溝結合基也不單單只作為所述ODN與另一鏈非特異性結合的穩定劑(anchor)。ODN-MGB軛合物抑制引物延長的能力表明該ODN-MGB軛合物可作為PCR終止劑而用于診斷(見核酸研究(Nucleic Acid Research)，1993，215332-5336)。
狹縫印跡雜交試驗本發明的ODN-MGB軛合物可作為雜交探針。這可用下面的實驗證實，實驗中使用32P標記的ODN-MGB軛合物作診斷探針。與沒有小溝結合基與之共價結合的同一ODN比較，該軛合物與互補鏈雜交的強度大，效率高，特異性高。狹縫印跡雜交試驗是一個廣泛應用的DNA探針診斷試驗。ODN-MGB軛合物的這些性質改善了該分析的性能。
具體地講，本文所述的實驗其實驗操作方法遵循標準的操作方法，如按Protoc als for Nucleic Acid Blotting and hybridization(1988，Amersham，United Kingdom)所述的方法進行。對與固定化質粒雜交的被標記的受試寡核苷酸(ODN)以每分鐘計數進行定量，對雜交溫度繪圖。實驗評價了四個與M13mp19 DNA(噬菌體DNA)互補的16聚寡核苷酸探針。其中的兩個探針與噬菌體DNA某部位完全互補；一個含有3′共價結合的CDPI3而另一個未被修飾。第二對探針也與M13mp19 DNA的同一部位配對，但各有一個錯誤配對的堿基(圖1中下劃線堿基)。同樣，一個ODN含有3′端結合的CDPI3，而另一個未被修飾。
狹縫雜交研究的結果如圖1所示。與未修飾但序列相同的16聚核苷酸比較，含CDPI3的探針形成的雜交體熔化溫度為50℃，不含CDPI3的則僅為33℃。這個較高的熔化溫度使完全配對的雜交體的產率增加1倍多。當探針中有錯誤配對的堿基時，則相應雜交體的穩定性降低。CDPI3修飾的探針在37-50℃之間表現出高的序列分辨能力。而且，在這些雜交條件下沒有證據表明CDPI3與靶M13mp19 DNA的預先已存在的雙鏈區結合，這意味著這些軛合物完全的非持異性結合是不存在的。
培養的人細胞中基因的序列特異性烷基化作用本發明的ODN-MGB軛合物(該軛合物上還共價連有烷化劑)可作為“反義基因”試劑，也就是如果ODN-MGB軛合物與靶基因內的靶序列互補，就可抑制非所需基因(致病基因)的表達。在這種情況下，MGB可提高ODN與雙鏈DNA(gene)的結合力(在重組酶存在下)，而烷化基則使ODN-MGB軛合物與靶序列形成持久共價結合。
在驗證性實驗中，上面提到的五十聚核苷酸(經氮芥基(苯丁酸氮芥)修飾且3′端與CDPI3結合)序列特異性地與靶基因內的預期部位交聯，這個靶基因(HLA DQ β10302等位基因)存在于活的人BSM細胞(一種人B-淋巴細胞系)中。把ODN-MGB軛合物加到BSM細胞懸浮液中，該軛合物最終濃度為1-50μM。3.5小時后，提取基因組DNA用熱四氫吡咯處理，以使任何烷基化部位產生缺口。在0302等位基因靶區域的下游通過LM-PCR(聚合酶介導的連接鏈反應)擴增，LM-PCR這項技術是可用來檢測斷裂事件、分辨率達一個堿基的技術。產物經測序凝膠電泳分析表明修飾的ODN已經與靶部位結合并烷化在一起。而無CDPI3的類似ODN對靶DNA的烷化效率很小。
在上面的實驗中，ODN-MGB軛合物對同源雙鏈DNA的識別和結合可能是在核重組酶的參與下進行的。在類似實驗和應用中，在其它活細胞中，內源性重組酶能催化ODN-CDPI3軛合物與雙鏈基因組DNA間的序列特異性的靶向結合。當這些ODN有與之相連的交聯劑時，它們能烷化靶DNA。在重組酶作用下，通過穩定所形成的D-環，CDPI3促進交聯反應。交聯是靶基因表達的強抑制劑。因此，交聯的ODN-CDPI3軛合物可用作反義基因試劑。
具體的實施方案與實驗部分材料與方法對空氣及水敏感的反應均在氬氣的微正壓下進行。無水溶劑購自Aldrich公司(Milwaukee，WI)。閃式柱層析使用硅膠(230-400目)。熔點未經校正并采用Mel-Temp熔點儀測定。元素分析由定量技術公司(Boundbrook，NJ)完成。在200-400nm范圍內的紫外-可見光吸收光譜用UV-2100(Shimadzu)或Lambda2(Perkin Elmer)分光光度計記錄。核磁共振氫譜(1H NMR)用Bruker WP-200型光譜儀或Varian XL-200型分光光度計在20℃下測定；化學位移在ppm低磁場下，以四甲基硅為內標進行測定。
3-氨基甲酰-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸2，3，5，6-四氟苯酯(1a)。將3-氨基甲酰-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸(1.4g，6.1mmol，D.L.Boger，R.S.Coleman，B.J.Invergo，J.Org.Chem.，1987，521521-1530)和三乙胺(1.4ml，10mmol)溶解在15ml無水DMF中。向該溶液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(2.6g，10mmol，H.B.Gamper，M.W.Reed，T.Cox，J.S.Virosco，A.D.Adams，A.A.Gall，J.K.Scholler和R.B.Meyer，Jr.，Nucleic Acids Res.，1993，21(1)145-150)。加畢，1小時后，減壓(0.2mm真空)濃縮反應混合物。殘留物用無水二氯甲烷2ml研制，加入50ml乙醚，混合物在0℃放置過夜，用多孔玻璃漏斗過濾收集沉淀，沉淀用50％乙醚/二氯甲烷(10ml)，乙醚(50ml)依次洗滌，真空干燥，得黃色固體1.8g(75％)
1H NMR(Me2SO-d6，200MHz，ppm)12.32(s，1H，NH)，8.13(d，1H，J＝9Hz，C4-H)，8.01(m，1H，C6F4H)，7.41(s，1H，C8-H)，7.26(d，1H，J＝9Hz，C5-H)，6.17(s，2H，CONH2)，3.99(t，2H，J＝9Hz，NCH2CH2)，3.30(t，2H，J＝9Hz，NCH2CH2).C18H11N3O3F4×2H2O的理論值C，50.3；H，3.52；N，9.7.實測值C，50.81；H，3.60；N，9.95.
3-叔丁氧基羰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸2，3，5，6-四氟苯酯(1b)。將3-叔丁氧基羰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸(1.0g，3.7mmol，D.L.Boger，R.S.Coleman和B.J.Invergo，J.Org.Chem.，1987，521521-1530)和三乙胺(1.5ml，10mmol)溶解在10ml無水二氯甲烷中。向該溶液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(2.6g，10mmol)。反應4小時，然后減壓蒸除CH2Cl2，殘留物經閃式柱層析(4×20cm，正己烷-乙酸乙酯1∶2)得黃色晶體(1b)1.25g(75％)1H NMR(Me2SO-d6，200MHz，ppm)12.39(d，1H，J＝1.4Hz，NH)，8.02(m，1H，C6F4H)，7.9(br s，1H，C4-H)，7.45(d，1H，J＝1.4Hz，C8-H)，7.33(d，1H，J＝9Hz，C5-H)，4.02(t，2H，J＝9Hz，NCH2CH2)，3.26(t，2H，J＝9Hz，NCH2CH2)，1.51(s，9H，C(CH3)3).C22H18N2O4F4的理論值C，58.67；H，4.03；N，6.22.FoundC，58.45；H，4.09；N，6.13.
3-氨基甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸二聚體甲酯(2a)。1，2-二氫-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯(0.6g，1.5mmol)、化合物1a(0.45g，2.25mmol)和三乙胺(0.2ml，1.4mmol)溶解在10ml DMF中。使該溶液于室溫反應24小時，然后在0℃反應12小時。過濾收集所得的不溶固體，并用DMF(10ml)、乙醚(20ml)洗滌，真空干燥得淺黃色固體2a(0.61g，91％)(1H NMR(Me2SO-d6，200MHz，ppm)12.00(d，1H，J＝1.8Hz，NH′)，11.54(s，1H，NH)，8.28(d，1H，J＝9Hz，C4′-H)，7.97(d，1H，J＝9Hz，C4-H)，7.33(d，1H，J＝9z，C5′-H)，7.22(d，1H，J＝9z，C5-H)，7.13(d，1H，J＝1.4Hz，C8′-H)，6.94(d，1H，J＝1.1Hz，C8-H)，6.01(s，2H，CONH2)，4.62(t，2H，J＝8Hz，(NH2CH2)′)，3.98(t，2H，J＝8Hz，NCH2CH2)，3.88(s，3H，CH3)，3.41(t，2H，J＝8Hz，(NCH2CH2)′)，3.29(t，2H，NCH2CH2，因水使之部分變模糊).C24H21N5O5×1H2O×1DMF的理論值C，58.69；H，5.84；N，15.21.FoundC，58.93；H，5.76；N，15.82.
3-叔丁氧基羰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸二聚體甲酯(2c)。將1，2-二氫-3H-吡咯吲哚-7-羧酸甲酯(0.5g，2.5mmol)、化合物1b(1.0g，2.2mmol)和三乙胺溶解在無水二甲基甲酰胺(DMF)中。使該溶液在室溫反應10小時，在0℃反應12小時。過濾收集所得的不溶固體，用DMF(5ml)、乙醚(40ml)洗滌之。真空干燥得灰白色的固體2c 0.81g(74％)。
1H NMR(Me2SO-d6，200MHz，ppm)12.01(s，1H，NH′)，11.64(s，1H，NH)，8.28(d，1H，J＝9Hz，C4′-H)，7.8(br s，1H，C4-H)，7.32(apparent t，2H，C5′-H+C5-H)，7.13(d，1H，J＝1.1Hz，C8′-H)，6.98(d，1H，J＝1.1Hz，C8-H)，4.62(t，2H，J＝8Hz，(NH2CH2)′)，4.02(t，2H，J＝8Hz，NCH2CH2)，3.88(s，3H，CH3)，3.41(t，2H，J＝8Hz，(NCH2CH2)′)，3.25(t，2H，NCH2CH2)，1.52(s，9H，C(CH3)).C28H28N4O5的理論值C，67.19；H，5.64；N，11.19.實測值66.72，H，5.69；N，11.31.
3-氨甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸二聚體2，3，5，6-四氟苯酯(2e)。將化合物2b(1.2g，2.8mmol，D.L.Boge-r，R.S.Coleman和B.J.Invergo，J.Org.Chem.，1987，521521-1530)加入15ml無水二甲基甲酰胺(DMF)中，得懸濁液。滴加三氟乙酸四氟苯酯(2.0g，10mmol)至該懸濁液中，接著加入三乙胺(1.4ml，10mmol)，對反應混合物攪拌3小時。用旋轉蒸發器減壓)(0.2mm真空)濃縮反應混合物。所得的殘留物用20ml無水二氯甲烷研制。所得的產物經過濾，依次用二氯甲烷(10ml)、乙醚(20ml)洗滌。真空干燥得黃色固體2e 1.5g(93％)(1HNMR(Me2SO-d6，200MHz，ppm)12.51(d，1H，J＝1.8Hz，NH′)，11.58(s，1H，NH)，8.39(d，1H，J＝8.9Hz，C4′-H)，8.04(m，1H，C6F4H)，7.98(d，1H，J＝8.8Hz，C4-H)，7.58(s，1H，C8′)，7.42(d，1H，J＝9Hz，C5′-H)，7.22(d，1H，J＝9Hz，C5-H)，6.98(s，1H，C8-H)，6.11(s，2H，CONH2)，4.66(t，2H，J＝7.8Hz，(NCH2CH2)′)，3.94(t，2H，J＝9.1Hz，NCH2CH2)，3.47(t，2H，J＝8Hz，(NCH2CH2)′)，3.29(t，2H，J＝9.1Hz，NCH2CH2).C29H19N5O4F4×1.5H2O的理論值C，57.62；H，3.67；N，11.59.實測值C，57.18；H，3.31；N，11.54.
3-叔丁氧基羰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸二聚體2，3，5，6-四氟苯酯(2f)。將化合物2d(0.25g，0.5mmol，D.C.Boger，R.S.Coleman和B.J.Invergo，J.Org.Chem.，1987，521521-1530)和三乙胺(0.5ml，3.5mmol)加入8ml無水二氯甲烷和2ml二甲基甲酰胺的混合物中，得懸浮液。向該懸浮液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(0.75g，2.9mmol)。對混合物攪拌20小時，所得透明溶液在真空中濃縮，并將殘余物滴加至40ml 1M乙酸鈉(pH7.5)中。對沉淀物離心，并依次用水(2×40ml)、10％甲醇/乙醚2×40ml)、乙醚(40ml)、正己烷(40ml)洗滌。最后真空干燥得淺黃色固體2f0.2g(91％)。
(1H NMR(Me2SO-d6，200MHz，ppm)12.51(s，1H，NH′)，11.66(s，1H，NH)，8.37(d，1H，J＝8.8Hz，C4′-H)，8.03(m，1H，C6F4H)，7.8(brs，1H，C4-H)，7.58(s，1H，C8′-H)，7.40(d，1H，J＝9.1Hz，C5′-H)，7.27(d，1H，J＝8.6Hz，C5-H)，7.1(s，1H，C8-H)，4.65(t，2H，J＝8Hz，(NCH2CH2)′)，4.02(t，2H，J＝9Hz，NCH2CH2)，3.46(t，2H，J＝8Hz，(NCH2CH2)′)，3.25(t，2H，J＝8.9Hz，NCH2CH2)，1.51(s，9H，C(CH3)3).
C33H26N4O5F4×0.5H2O的理論值C，61.59；H，4.23；N，8.71.實測值C，61.73；H，4.12；N，8.61.
3-氨基甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸三聚體甲酯(3a)。將1，2-二氫-3H-吡咯并吲哚-7-羧酸甲酯(1.0g，5mmol)、化合物2e(1.2g，2.1mmol)和三乙胺(0.1ml，mmol)溶于15ml無水DMF中。使該溶液于室溫反應24小時，在0℃反應12小時。過濾收集所得的不溶固體，并依次用DMF(10ml)、CH2Cl2(20ml)和乙醚(20ml)洗滌之。真空干燥得淺黃色固體3a1.1g(83％)。
(1H NMR(Me2SO-d6，200MHz，ppm)12.02(s，1H，NH″)，11.75(s，1H，NH′)，11.56(s，1H，NH)，8.28(apparent t，2H，J＝8.3Hz，C4-H″+C4′-H)，7.98(d，1H，J＝9.4Hz，C4-H)，7.98(d，1H，J＝9Hz，C4-H)，7.39-7.33(2d，2H，C5″-H+C5′-H)，7.23(d，1H，J＝8.7Hz，C5-H)，7.14(d，1H，J＝1.6Hz，C8″-H)，7.10(d，1H，J＝1Hz，C8′-H)，6.97(s，1H，C8-H)，6.11(s，2H，CONH2)，4.65(t，4H，(NCH2CH2)″+(NCH2CH2)′)，3.98(t，2H，J＝8.7Hz，NCH2CH2)，3.88(s，3H，CH3)，3.48-3.25(m，6H，(NCH2CH2)″+(NCH2CH2)′+NCH2CH2，因水使之部分變模糊).C35H29N7O5×4.5H2O的理論值C，59.32；H，5.0；N，13.03.實測值C，58.9；N，5.06；N，13.77.
3-氨基甲酰基-1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸三聚體2，3，5，6-四氟苯酯(3c)。化合物3b(1.1g，1.8mmol)在15ml無水MDF和三乙胺(1.4ml，10mmol)中形成懸浮液。向該懸浮液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(2.6g，10mmol)。對所得的混合物攪拌3小時。混合物減壓(0.2mm真空)濃縮。用無水二氯甲烷(20ml)和甲醇(2ml)的混合物研制所得的殘留物。過濾收集所得的產物，用CH2Cl2(20ml)、乙醚(20ml)洗滌之。真空干燥得黃綠色固體3c 1.3g(95％)。
(1H NMR(Me2SO-d6，200MHz，ppm)12.54(d，1H，J＝1Hz，NH″)，11.79(s，1H，NH′)，11.56(s，1H，NH)，8.41(d，1H，J＝9.3Hz，C4-H″)，8.27(d，1H，J＝9.4Hz，C4′-H)，8.03(m，1H，C6F4H)，7.98(d，1H，J＝9Hz，C4-H)，7.56(s，1H，C8″-H)，7.45-7.35(m，2H，C5″-H+C5′-H)，7.23(d，1H，J＝9.2Hz，C5-H)，7.13(s，1H，C8′-H)，6.97(s，1H，C8-H)，6.11(s，2H，CONH2)，4.65(m，4H，(NCH2CH2)″+NCH2CH2)′)，3.98(t，2H，J＝8.7Hz，NCH2CH2)，3.45(m，4H，(NCH2CH2)″+(NCH2CH2)′)，3.25(t，2H，J＝8.7Hz，NCH2CH2).C40H27N7O5F4×2H2O的理論值C，61.59；H，4.23；N，8.71.實測值C，61.73；H，4.12；N，8.61.吲哚-7-羰基]-1-酰氨基-3-丙醇三聚體(3d)。對3-氨基-1-丙醇(70μ1，1.4mmol)、化合物3c(75mg，0.1mmol)和三乙胺(0.1ml，mmol)溶于2.5ml無水DMF所得的溶液在室溫攪拌10小時。所得的不溶固體過濾取集，并依次用DMF(2ml)CH2Cl2(10ml)和乙醚(20ml)洗滌。真空干燥得淺黃色固體3d(55mg，89％)。
(1H NMR(Me2SO-d6，200MHz，ppm)11.76(s，1H，NH″)，11.65(s，1H，NH′)，11.57(s，1H，NH)，8.47(m，1H，C4-H)，8.24(m，1H，C4-H)，7.99(d，1H，J＝8.4Hz，C4-H)，7.40-7.32(2d，2H，C5″-H+C5′-H)，7.23(d，1H，J＝8.9Hz，C5-H)，7.12(s，1H，C8″-H)，7.10(s，1H，C8′-H)，6.99(s，1H，C8-H)，6.12(s，3H，CONH2+NHCO)，4.66(t，4H，(NCH2CH2)″+(NCH2CH2)′)，3.98(t，2H，J＝8.7Hz，NCH2CH2)，3.51-3.25(m，10H，(NCH2CH2)″+(NCH2CH2)′+NCH2CH2+NHCH2+CH2OH，因水使之部分變模糊)，1.70(p，2H，J＝6.6Hz，CH2CH2CH2).
3-[N-(9-芴基甲氧羰基)]氨基丙酸2，3，5，6-四氟苯酯(4)。Fmoc-丙氨酸(2.0g，6.4mmol)和三乙胺(1.0ml，7mmol)用20ml無水CH2Cl2溶解。向所得溶液中滴加三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(1.7g，6.5mmol)。1小時后，用旋轉蒸發器除去CH2Cl2，殘余物用30ml乙酸乙酯/正己烷(1∶1)重新溶解。用閃式柱層析(4×20cm，正乙烷/乙酸乙酯，31)得到白色固體狀的粗品4。該粗品用己烷/乙酸乙酯重結晶，得白色晶體4(2.3g，78％)。
1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm)7.73(d，2H，J＝7.1Hz，芳香質子)，7.75(d，2H，J＝7.7Hz，芳香質子)，7.24-7.42(m，4H，芳香質子)，7.01(m，1H，C6F4H)，5.21(br s，1H，-CONH-)，4.38(d，2H，J＝7.1Hz，-CH2OCO-)，4.20(m，1H，芐基質子)，3.58(m，2H，NCH2)，2.93(t，2H，J＝5.4Hz，-CH2CO-).
C24H17NO4F4的理論值C，62.75；H，3.73；N，3.05.實測值C，62.52；H，3.59；N，3.01.
1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-[R，S]-2，3-丙二醇(5)。3-氨基-1，2-丙二醇(0.6g)用10ml甲醇溶解，攪拌該溶液。向該攪拌過的溶液中加入化合物4(2.0g，4.35mmol)溶于無水CH2Cl2(20ml)所得的溶液。10分鐘后，加入乙酸(3ml)，蒸發濃縮至于。殘余物用100ml水研制，過濾收集所得的固體，并用水洗滌。在減壓下與甲苯共蒸發除水。然后用50ml乙酸乙酯洗滌，接著真空干燥過夜，得白色晶體5(1.65g，99％)。1H NMR(CDCl3+MeOD-d4，200MHz，ppm，Me4Si)7.77(d，2H，J＝7.7Hz，aromatic protons)，7.61(d，2H，J＝7.3Hz，芳香質子protons)，7.45-7.29(m，4H，aromatic protons)，4.35(d，2H，J＝7.1Hz，-CH2OCO-)，4.22(m，1H，芐基質子)，3.72(m，1H，-CH-來自NHCH2CHOHCH2OH)，3.52-3.27(m，6H，OCONHCH2+CH2CHOHCH2OH)，2.44(t，2H，J＝6.6Hz，-CH2CO-)；C21H24N2O5的理論值C，5.61；H，6.29；N，7.29％.實測值C，65.43；H，6.28；N，7.21.
1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-[R，S]-2-[[二(甲氧基苯基)苯基甲氧基]甲基-2-乙醇(6)。將化合物5(1.6g，4.2mmol)溶于30ml無水吡啶中，攪拌所得的溶液。向上述攪拌過的溶液中加入4，4′-二甲氨基三苯基甲基氯(DMTrCl)(1.6g，4.7mmol)。在氬氣保護下攪拌3小時后，將反應混合物蒸發至于，剩余的吡啶與甲苯共沸除去。殘余物用100ml CH2Cl2溶解，并用水(2×100ml)洗滌，以Na2SO4干燥，蒸發至于。以乙酸乙酯作洗脫劑，用閃式柱層析(4×20cm)純化所得的殘余物得無色泡沫6(1.9g，66％)。
1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm，Me4Si)7.72(d，2H，J＝7.2Hz，芳香質子)，7.56(d，2H，J＝7Hz，aromatic protons)，7.40-7.20(m，13H，芳香質子protons)，6.80(d，4H，J＝9Hz，DMTr質子)，5.76(brs，1H，NH)，5.42(br s，1H，NH)，4.35(d，2H，J＝6.6Hz，-CH2OCO-)，4.17(m，1H，芐基質子)，3.83(m，1H，-CH-from NHCH2CHOHCH2OH)，3.75(s，6H，OCH3)，3.60-3.30(m，4H，OCONHCH2+CH2CHOHCH2OH)，3.13(d，2H，J＝5.4Hz，CH2ODMTr)，2.30(t，2H，J＝5.4Hz，-CH2CO-)；C42H42N2O7的理論值C，73.45；H，6.16；N，4.08.實測值C，65.43；H，6.28；N，7.21.
1-[3-[N-(9-芴基甲氧基羰基)氨基]-1-氧丙基]氨基-[R，S]-2-[[二(甲氧基苯基)苯基甲氧基]甲基]-2-乙基丁二酸2，3，5，6-四氟苯酯(7)。將化合物6(1.2g，1.75mmol)、三乙胺(0.2g，2mmol)、1-甲基咪唑(20μl)溶于10ml無水CH2Cl2中，向該溶液中加入琥珀酸酐(0.2g，2mmol)。攪拌該溶液20小時。向該溶液中加入三乙胺(60μl)，接著加入三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯(0.6g，2.2mmol)。1小時后，用旋轉蒸發器在減壓下除去CH2Cl2，然后殘留物用15ml乙酸乙酯/己烷(1∶2)溶解。閃式柱層析((4×20cm)，正己烷/乙酸乙酯(2∶1)作洗脫劑))純化，得淺黃色泡沫1b(1.2g，73％)。1H NMR(CDCl3，300MHz，ppm，Me4Si)7.71(d，2H，J＝7.2Hz，芳香質子)，7.54(d，2H，J＝7Hz，芳香質子)，7.40-7.20(m，13H，芳香質子)，7.00(m，1H，C6F4H)，6.78(d，4H，J＝7Hz，DMTr質子)，5.71(br s，1H，NH)，5.42(br s，1H，NH)，5.15(m，1H，-CH-來自NHCH2CHOHCH2OH)，4.31(d，2H，J＝6.2Hz，-CH2OCO-)，4.16(d，5.5Hz，1H，芐基質子)，3.74(s，6H，OCH3)，3.60-3.30(m，4H，OCONHCH2+CH2CHOHCH2OH)，3.20(br s，2H，CH2ODMTr)，2.98(br s，2H，COCH2CH2CO)，2.72(br s，2H，COCH2CH2CO)，2.20(br s，2H，-CH2CO-)；C42H42N2O7的理論值C，66.80；H，4.96；N，3.00.實測值C，66.18；H，4.98；N，2.86.
CPG衍生物(8)的制備。將5.0g長鏈氨基烷基-CPG(LCAA-CPG)、0.5ml 1-甲基咪唑和溶于20ml無水吡啶的0.45g(0.5mmol)化合物7的混合物在100ml燒瓶中渦旋，3小時后，所述的CPG用多孔玻璃漏斗過濾，并依次用DMF、丙酮和乙醚各100ml洗滌。所述的CPG真空干燥，再用20ml吡啶、2ml乙酸酐和2ml的1-甲基咪唑的混合物處理。渦旋30分鐘后，依次用吡啶、甲醇、乙醚洗滌所述的CPG，然后真空干燥之。根據文獻方法(T.Atkinson和M.Smith.in M.Gait(ed.)，Oligo-nucleotide Synt-hesis，A Practical Approach，IRLPress，1984，Oxford，UK，pp.35-81)，發現其載容量為28μmol/g。
CPG衍生物(9)的制備。3.0g CPG衍生物(8)用溶于無水DMF中的20％哌啶溶液(20ml)處理兩次，每次5分鐘。該CPG依次用二甲基甲酰胺、甲醇和乙醚各100ml洗滌，然后真空干燥之。
CPG衍生物(10)的制備。將2.5g的化合物9、7.5ml三乙胺和溶于7.5ml無水DMSO中的0.38g(0.5mmol)化合物3c的混合物在50ml燒瓶(軌道混合器，150漏斗rpm)中渦旋。2天后，CPG用多孔玻璃漏斗過濾，并用DMSO、丙酮和乙醚各100ml洗滌，真空干燥所得的CPG，再用10ml吡啶、1ml乙酸酐和1ml 1-甲基咪唑的混合物處理。渦旋30分鐘后，CPG衍生物用DMSO、吡啶、甲醇和乙醚洗滌，然后真空干燥。
5-[(叔丁氧基)甲酰氨基]戊基羧酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙酯(11)。6-[(叔丁氧基)甲酰氨基]己酸(4.16g、18mmol)通過與無水DMF共蒸發(70℃)而干燥之。殘留物用無水DMF(25ml)重新溶解，在0℃下加入2-[4-(苯偶氮基)-·芐基硫]-乙醇(4.08g，15mmol)、N，N′-二環己基碳二亞胺(3.71g，18mmol)、4-二甲氨基吡啶(1.83g，15mmol)。在0℃攪拌2小時、20℃攪拌12小時后，反應混合物通過與乙酸丁酯共沸蒸餾至干。再加入乙酸乙酯(150ml)。所得溶液依次用0.7M HCl(1×30ml)、5％NaHCO3和H2O(2×50ml)萃取。有機層以Na2SO4干燥，并采用旋轉蒸發器濃縮。用20ml乙醚洗滌過濾得化合物11(6.91g，89％)。
1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm)7.91(m，4H)，7.52(m，5H)，4.48(t，2H)，4.34(s，2H)，3.20(t，2H)，3.08(m，2H)，2.35(t，2H)，1.64-1.2(m，7H)，1.41(s，9H).
1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基-吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯。將N，N′-二環己基碳二亞胺(1.1g，5.3mmol)加入1-甲基-4-[(叔丁氧基)甲酰氨基]吡咯-2-羧酸(1.2g，5.2mmol)和1-羥基苯并三唑(0.63g，4.7mmol)的混合物中。攪拌1小時后，該混合物用多孔玻璃漏斗過濾，分離析出的N，N′-二環己基碳二亞胺。將濾液蒸發至干，將殘留物再溶解在氯仿-戊烷(1∶1)的混合物中。將所得溶液上樣到硅膠柱上，合并含純產物的級分，并將之蒸發至干，得1.45g為白色固體的目的產物，產率為80％。
mp＝138-138.5℃；1H NMR(CDCl3，200MHz)8.04(d，1H)，7.49-7.40(m，4H)，7.09(d，1H)，3.87(s，3H)，1.50(s，9H).
5-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙酯(12)。在0℃下將三氟乙酸(5ml)加入化合物11(0.73g，1.5mmol)中。于0℃攪拌20分鐘后，使反應混合物與氯仿共蒸發至干，。將殘留物溶解在無水二氯甲烷(15ml)中，然后加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基-吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(0.59g，1.65mmol)和無水三乙胺(0.23g，2.3mmol)。于室溫攪拌15分鐘后，加入100ml氯仿。反應混合物用5％NaHCO3(2×20ml)、H2O(2×20ml)萃取。有機相以Na2SO4干燥，并用旋轉蒸發器濃縮。經硅膠柱層析(用CHCl3作洗脫劑)得12(0.88g，91.8％)。1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm)7.88(m，4H)，7.46(m，5H)，6.74(s，1H)，6.38(s，1H)，6.26(s，1H)，5.87(t，1H)，4.18(t，2H，J＝6Hz)，3.82(s，3H)，3.79(s，2H)，3.3(m，2H)，2.63(t，2H，J＝6Hz)，2.30(t，2H，J＝6Hz)，1.64-1.2(m，6H)，1.46(s，9H).
5-[1-甲基-4-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙酯(13)。化合物12(2.43g，4mmol)用CH2Cl2(8ml)溶解，使該溶液于0℃下，用三氟乙酸(4ml)處理。將所得溶液于室溫在燒瓶中放置1小時，然后使之在30ml 30％的K2CO3水溶液和30ml CH2Cl2之間分配。收集下層。水相用CH2Cl2(2×20ml)萃取，合并有機層。用水(1×20ml)洗滌后，以Na2SO4干燥，并濃縮。殘留物溶解在CH2Cl2(10ml)中，加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(1.43g，4mmol)和無水三乙胺(0.8g，8mmol)。室溫攪拌30分鐘后，加入100ml氯仿。該反應混合物用5％NaHCO3(2×20ml)、H2O(2×20ml)萃取。有機層以Na2SO4干燥，并用旋轉蒸發器濃縮。硅膠(100g)柱層析(以CHCl3作洗脫劑)后得13(1.95g，66.8％)。
1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm)7.87(m，4H)，7.46(m，5H)，7.04(d，1H，J＝1.5Hz)，6.77(br s，1H)，6.52(br s，1H)，6.50(d，1H，J＝1.5Hz)，6.31(br s，1H)，5.95(t，1H)，4.19(t，2H，J＝6Hz)，3.85(s，6H)，3.78(s，2H)，3.32(m，2H)，2.64(t，2H，J＝6Hz)，2.31(t，2H，J＝6Hz)，1.64-1.2(m，6H)，1.48(s，9H).
5-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙酯(14)。化合物13(1.90g，2.6mmol)溶于無水CH2Cl2(6ml)所得的溶液在0℃下用3ml三氟乙酸處理。將所得的溶液在燒瓶中于室溫放置1小時，然后使之在30％K2CO3(30ml)和CH2Cl2(30ml)之間分配。收集下層，水相用二氯甲烷(2×20ml)萃取，合并有機層并用水(1×20ml)洗滌。然后以Na2SO4干燥；并蒸發干燥。將殘留物溶在CH2Cl2(2.5ml)中，加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(1.4g，3.9mmol)、無水三乙胺(0.8g，8mmol)。室溫攪拌1小時后加入CHCl3100ml。反應混合物用5％NaHCO3(2×20ml)、H2O(2×20ml)萃取。有機層以Na2SO4干燥，并在旋轉蒸發器上濃縮。用硅膠(100g)柱層析(以0～1.5％甲醇的氯仿溶液作洗脫劑)得14(1.56g，70.5％)。1H NMR(CDCl3，200MHz，ppm)7.87(m，4H)，7.68(br s，1H)，7.60(br s，1H)，7.46(m，5H)，7.08(br s，2H)，6.78(br s，1H)，6.56(d，1H，J＝1.5Hz)，6.60(br s，1H)，6.55(d，1H，J＝1.5Hz)，6.03(t，1H)，4.18(t，2H，J＝6Hz)，3.86(m，9H)，3.78(s，2H)，3.32(m，2H)，2.63(t，2H，J＝6Hz)，2.30(t，2H，J＝6Hz)，1.64-1.2(m，6H)，1.48(s，9H).
2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙基-5-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸酯(15)。化合物14(0.32g，0.32mmol)溶于5ml無水CH2Cl2所得的溶液于0℃用2.5ml三氟乙酸處理。將所得的溶液在燒瓶中于室溫放置1小時，然后使之在30％K2CO3(30ml)和CH2Cl2(30ml)之間分配。收集下層水相用二氯甲烷(2×20ml)萃取，合并有機層并用水(1×20ml)洗滌。然后以Na2SO4干燥，并蒸發干燥。將殘留物溶在CH2Cl2(1ml)中，加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(0.11g，0.32mmol)、無水三乙胺(0.06g，0.03mmol)。室溫攪拌1.5小時后，加入CHCl3100ml。反應混合物用5％NaHCO3(2×20ml)、H2O(2×20ml)萃取。有機層以Na2SO4干燥，并在旋轉蒸發器上濃縮。用硅膠(100g)柱層析(以0～1.5％甲醇的氯仿溶液作洗脫劑)得0.25g化合物15(80％)。
1H NMR(CDC13，200MHz，ppm)8.17(br s，1H)，7.98(br s，)，7.96(br s，)，1H 7.85(m，4H)，7.44(m，5H)，7.09(brs，2H)，7.02(s，1H)，6.78(br s，1H)，6.74(br s，1H)，6.66(s，1H)，6.58(s，3H)，6.29(t，1H)，4.18(t，2H，J＝6Hz)，3.78(m，14M)，3.28(m，2H)，2.60(t，2H，J＝6Hz)，2.26(t，2H，J＝6Hz)，1.64-1.2(m，6H)，1.48(s，9H).
5-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-[1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]吡咯-2-甲酰氨基]戊酸2-[4-(苯偶氮基)芐基硫]乙酯(16)。化合物15(0.65g，0.67mmol)溶于無水CH2Cl2(10ml)所得的溶液在0℃下用5ml三氟乙酸處理。將所得的黃色溶液在燒瓶中于室溫放置1小時，然后使之在30％K2CO3(30ml)和CH2Cl2(30ml)之間分配。收集下層，水相用二氯甲烷(2×20ml)萃取，合并有機層并用水(1×20ml)洗滌。然后以Na2SO4干燥，并蒸發于燥。將殘留物溶在CH2Cl2(1ml)中，加入1-甲基-4-(叔丁氧基)甲酰氨基吡咯-2-羧酸1，2，3-苯并三唑-1-酯(0.24g，0.67mmol)、無水三乙胺(0.13g，0.67mmol)。室溫攪拌3小時后，反應混合物與乙酸丁酯共蒸發至干。將殘余物溶解在3ml2.5％DMF的CHCl3溶液中。用硅膠(100g)柱層析(以0～2.5％甲醇的氯仿溶液作洗脫劑)得0.67g化合物16(45％)。
4′-[二(2-氯乙基)氨基]苯基丁酸-2，3，5，6-四氟苯酯(苯丁酸氮芥2，3，5，6-四氟苯酯)。向苯丁酸氮芥0.25g(0.82mmol)(Fluka A.G.提供)、三氟乙酸2，3，5，6-四氟苯酯0.3g(1.1mmol)溶于5ml無水CH2Cl2所得的溶液中加入0.2ml無水三乙胺。在氬氣氛下，于室溫對反應混合物攪拌0.5小時，并蒸發之。殘留的油用硅膠柱層析，洗脫劑為正己烷/氯仿(2∶1)，得油狀的酯0.28g(75％)。硅膠薄層層析(CHCl3)，保留值(Rf)為0.6；IR(CHCl3)為3010、1780、1613、1521、1485cm-1。
苯丁酸氮芥基與寡核苷酸的伯氨基的連接寡核苷酸十六烷基三甲基銨鹽的制備將100μl寡核苷酸(50-500μg)水溶液(通常為三乙胺鹽)注射到Dowex 50wx8(十六烷基三甲銨型)柱表面(柱由50％乙醇水溶液預洗)，用50％乙醇水溶液洗脫(0.1ml/min)該柱。含有寡核苷酸的級分用speedvac干燥2小時，并直接用于下列反應。
將寡核苷酸十六烷基三甲銨鹽(50-100μg)的乙醇溶液(50μl)與0.08M 4′-[二(2-氯乙基)氨基]苯丁酸2，3，5，6-四氟苯酯的乙腈溶液(50μl)和3μl二異丙基乙胺混合。室溫振搖3小時后，產物用2％LiClO4的丙酮溶液(1.5ml)沉淀。產物用2％LiClO4的丙酮溶液從水中再沉淀3次。最后寡核苷酸苯丁酸氮芥衍生物用反相層析純化，產率為約50-80％。含產物的級分用丁醇濃縮。使分離得到的寡核苷酸苯丁酸氮芥衍生物在LiClO4的丙酮溶液中沉淀。用丙酮洗滌，在油泵產生的真空下干燥。所有涉及活潑寡核苷酸的操作要盡可能地快地進行，自收集層析組分后，將產物置于水浴溶液中。
寡核苷酸的合成所有寡核苷酸均用1μmol適當的CPG載體，在ABB394合成儀上制備，實驗操作按儀器制造商提供的實驗指南進行。氰乙基氨基亞磷酸酯偶合化學法的標準試劑從Glen Research購買。5′-氨基己基修飾通過N-MMT-己醇胺亞磷酰胺接頭(購自Glen Research)引入。3′-氨基己基修飾則用CPG載體引入，方法見以前的描述。(C.R.Petrie，Reed，A.D.Adams，R.B.Meyer，Jr.；Bioconjugate Chemistry，1992，3，85-87)。
軛合物的制備(反應路線3)向氨基己基修飾的寡苷酸十六烷基三甲基銨鹽(30-50nmol，Jost，J.-P.，Jiricny，J.，和Saluz，H.Quantitative Precipitation ofShort Oligonucleotides with 10w Concentrations ofCetyltrimethyl ammonium bromide.Nucleic Acids Res.1989，172143)和1.5μl N，N-二異丙基乙胺溶于40μl無水DMSO的溶液中，加入4mM TFP酯(1a，1b，2e，2f或3c)溶液(40μl)。反應混合物在室溫保溫12小時。通過加入2％LiClO4丙酮溶液(1.5ml)將寡核苷酸相關物質沉淀出來。沉淀用丙酮洗滌，真空干燥。沉淀重溶在50％DMF的水溶液(60μl)中，并按上述操作用2％的LiClO4丙酮溶液再沉淀。重復該操作兩次。在50mM LiClO4存在下，采用20-75％的乙腈溶液梯度，用HPLC(4.6×250mm，C-18，Dynamax-300A，Rainin)純化所得的殘留物。含有純產物的級分用speedvac真空干燥。將殘留物再溶于60-80μl H2O中，再用2％LiClO4丙酮溶液(1.5ml)沉淀。用丙酮洗滌(2×1.5ml)后，真空干燥，將產物溶于100μl H2O中，終產物的產率為20-50％。
用Godovikova等的改進方法(T.S.Godovikova，V.F.Za-rytova，T.V.Maltzeva，L.M.Khalimskaya，Bioorgan.Khim.，1989，151246-1259)合成帶有4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基的寡核苷酸軛合物。使含3′-磷酸酯的寡核苷酸十六烷基三甲基銨鹽(50-100nmol)、三苯膦(10mg)、2，2′-二吡啶基二硫醚(10mg)、N，N-二甲氨基吡啶(10mg)和一種選白化合物11-16的化合物溶于100μl無水DMF中，所得溶液在室溫反應20分鐘。寡核苷酸類物質通過加入2％LiClO4丙酮溶液而沉淀出來。沉淀用丙酮洗滌，真空干燥。在50mM LiClO4存在下，采用20-75％乙腈溶液梯度，用HPLC純化所得的殘留物。含純產物的級分用speedvac真空干燥。將殘留物再溶于60-80μl H2O中，并用2％LiClO4丙酮溶液(1.5ml)沉淀。用丙酮(2×1.5ml)洗滌后，真空干燥。最后，將殘留物溶于100μl H2O中，最終產率為30-50％。
軛合物的制備(反應路線4)含5′-氨基己基的CPG-寡核苷酸衍生物自1μmol規模合成實驗得到。用2％二氯乙酸的二氯甲烷溶液處理之，以從氨基上脫除保護基9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)，然后用乙腈洗滌，用氬氣流干燥。將CPG-寡核苷酸轉入1.5ml塑料試管中，再加入50mM四氟苯酯的無水DMSO溶液(100μl)。振蕩試管24小時，然后用DMSO(3×1.5ml)、丙酮(2×1.5ml)洗滌，再真空干燥。采用標準的條件，CPG載體-寡核苷酸用濃氨水處理以使寡核苷酸去保護。所得的反應混合物采用上文所述的反相HPLC分離，一般產率為約50％。
熱變性研究帶有4-氨基-N-甲基吡咯-2-羧酸殘基的寡核苷酸復合物的光學熔化曲線是在200nM NaCl、10nM Na2HPO4、0.1MM EDTA(pH7.0)溶液中，用Milichrom液相色譜的紫外檢測器檢測，在專為此目的而設計的熱控槽中測得的。采集數據并按S.G.Lokhov等人的文獻方法用計算機處理(S.G.Lokhov，M.A.Podyminogin，D.S.Sergeev，V.N.Silnikov，I.V.Kutyavin，G.V.Shishkin，V.F.Zarytova，Bioconjugate Chem.1992，3414)。
帶有1，2-二氫-3H-吡咯并[3，2-e]吲哚-7-羧酸(CDPI)殘基的寡核苷酸復合物在140mM KCl、10mM MgCl2、20mMHEPES-HCl(pH7.2)溶液中熔化，用帶有PTP-6自動多池溫度控制程序的Lambda2(Perkin Elmer)分光光度計測定得到熔化溫度。復合物的熔化溫度(Tm)由得到的最大值確定。
引物延長反應引物延長反應按Lee等描述的方法進行(Biochemistry，1994，336024-6030)，模板、引物和被保護的寡核苷酸的最后濃度分別為5×10-10M、4×10-8M和10-9M。在45℃引物延長15分鐘，參考Lee等的文獻，產物用凝膠電泳分析。
如無任何被保護的寡核苷酸存在，引物延長反應產生出高分子量的產物，該產物在測序膠上顯示為不可分辨的帶。對應于暫停位點或自發終止事件的弱帶在所有反應混合物中均可反復觀察到。與靶完全互補的未修飾的十六聚和三十二聚核苷酸不阻止引物延長。3′端連有CDPI3、與靶序列互補的八聚和十六聚核苷酸同樣也無抑制活性。只有與靶序列完全互補且5′端連有CDPI3的十六聚核苷酸可抑制引物在T7DNA聚合酶作用下的延長。相應的5′端連有CDPI3的八聚核苷酸僅產生痕量的抑制產物。對照寡核苷酸證實引物延長的抑制需要互補的寡核苷酸和與之共價連接的MGB。有一個錯誤配對堿基且5′端連有CDPI3的兩個十六聚核苷酸與完全互補的ODN-MGB軛合物比較，其抑制活性要低得多。同時加入未修飾的十六聚核苷酸與等摩爾量的游離的CDPI3，不影響引物延長，這突出表明MGB與ODN共價結合對其抑制引物延長具有重要意義。當與靶序列完全互補的十六聚寡核苷酸5′連有吖啶基而不是MGB時，則觀察到抑制活性喪失。
細胞培養交聯實驗ODN-MGB軛合物與DQβ1等位基因模板鏈的第815-864位核苷酸互補(Proc.Natl.Acad.Sci，USA(1983)，807313-7317)，這里使用的人BSM B細胞對該等位基因是純合的并能組成性地表達它。在加ODN之前，BSM細胞在25ml燒瓶中培養至密度為4.5×106細胞/ml培養基。對于每次處理，將2ml培養液中的細胞離心后重新懸浮在無血清的培養基中，所述培養基含有與苯丁酸氮芥連接的五十聚核苷酸(濃度為0、1、10或50μM)(同樣濃度的兩份血清中，一份ODN的3′端與CDPI3相連，另一份則不與CDPI3相連)。每個試樣在37℃與5％CO2中，用48-孔微滴定板培養3.5小時。然后把細胞轉至0.5ml Eppendorf離心管中，以2000rpm離心5分鐘，用500μl磷酸鹽(PBS)緩沖液洗二次，于37℃用蛋白酶K/SDS脫蛋白一晚上。苯酚/氯抽提和RnaseA消化后，DNA在90℃用1M四氫吡咯處理30分鐘。四氫吡咯通過乙醇沉淀除去，LM-PCR按Lee等的方法進行(Biochemistry，1994，336024-6030)。擴增的DNA用測序膠分析，以觀察序列特異性的任何缺裂，所述缺裂可能是由含苯丁酸氮芥的ODN對靶DNA的烷化產生的。結果表明靶中核苷酸斷裂發生在ODN的交聯基附近；此外，含CDPI3的五十聚核苷酸在序列特異性地烷化0302等位基因方面較無MGB的同一ODN強10倍。
由下列各組分制備完全培養基(無血清培養基不含HI-FCS)500ml含L-谷氨酸(2mM)的RPMI 1640(Gibco BRLCat.No.11875-036)50ml HI-FCS(Gibco BRL Cat.No.26140，55℃熱滅活30分鐘)50ml 100×青霉素/鏈霉素(Gibco BRL Cat.No.15070-022)5ml 200mM L-谷氨酸(Gibco BRL Cat.No25030-024)
5ml 100×丙酮酸鈉(11mg/ml；從Gibco BRL Cat.No.11840-030制得)5ml 1M HEPES，pH7.3(Gibco BRL Cat No.15630-023)序列表(1)總的資料(i)申請人Microprobe Corporation，BothellWA98021(ii)發明的題目共價結合的寡核苷酸和小溝結合劑的軛合物(iii)序列數目2(iv)通信地址(A)收信人Klin & Szekeres(B)街道4199 Campus Drive，Suite 700(C)城市歐文(D)州加利福尼亞(E)國家美國(F)郵政編碼92715(v)計算機可讀形式(A)工具類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patent In Release #1.0，#1.25版(vi)當前申請資料(A)申請號美國08/415,370(B)遞交日期1995年4月3日(C)特征(viii)代理人/代理機構資料(A)姓名Szekeres，Fabor L，(B)登記號28,675(C)檔案號491-09-pa8(ix)電訊資料(A)電話714-854-5502(B)電傳714-854-5502
(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(xi)序列描述SEQ ID NO1GGTTATTTTT GAAGATACGA ATTTCUCCAG AGACACAGCA GGATTTGTCA50(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度16個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2TTTTTTTTTTT TTTTT
權利要求
1.一種寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，包括含有多個核苷酸單位、一個3′端和一個5′端的寡核苷酸和通過連接基與至少一個所述的核苷酸共價結合的小溝結合基，所述的連接基通過不超過15個的原子將小溝結合基與寡核苷酸共價連接起來，其中所述的小溝結合基是分子量為約150-2000道爾頓以非嵌入方式與雙鏈DNA、RNA或雜合體的小溝結合的分子基團，其締合常數大于103M-1。
2.根據權利要求1的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中包含有連接基的小溝結合基具有選自(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的通式R1-(HN-Y1-CO)n-R2(a)其中Y1表示含有兩個雙鍵和0-3個選自N、S、O雜原子的五元環，NH和CO分別與環上的兩個碳原子相連，這兩個碳原子被一個環原子隔開，當這兩個碳原子之間的這個環原子是碳或氮時它僅被H取代，而當這個環原子是氧或硫時它則不被取代，環上的其余原子可被1、2或3個R3基任意取代；R1-(R6N-Y2-CO)n-R2(b)其中Y2是六元芳香環與含有一個雙鍵的五元環縮合成的稠合環，該稠合環有0-3個選自N、S、O的雜原子，R6N和CO基團分別與稠合環的兩個不同環上的碳原子相連，這兩個碳原子從一個共同橋頭原子算起，在兩個環上都是第二位原子，在CO和NR6之間稠合環的一邊有兩個非橋頭環原子而在另一邊有三個非橋頭環原子，所述的稠合環一邊的兩個非橋頭環原子可被R7任意取代，另一邊的三個非橋頭0原子可被R3任意取代；R1-(CO-Y3-NH)n-R2(c)其中Y3是含有0-3個N雜原子的六元芳香環，CO和NH基團分別與環上相對處于1，4位的兩個碳原子相連，六元環被連有CO或NH的兩個碳原子分成兩邊，一邊未與CO或NH基團相連的兩個原子被R3任意取代，另一邊未與CO或NH基團相連的兩個環原子被R7任意取代；R1-(HN-Y4-HN-CO-Y4-CO)n-R2(d)Y4含有0-3個N雜原子的6元芳香環，NH、CO基團分別與環上的相對處于1，4位的兩個碳原子相連，該六元環被環上連有CO或NH的兩個碳原子分成兩邊，一邊未與CO或NH相連的兩個原子可被R3任意取代，另一邊未與CO或NH基團相連的兩個原子可被R7任意取代；R1-(Y5)n-R2(e)Y5是六元芳香環與含有一個雙鍵的五元環的稠合環，該稠合環有0-3個選自N、S、O的雜原子，R1和R2基團分別與稠合環的不同環上的碳原子相連，它們從共同的橋頭原子算起均是第二個環原子，在R1和R2之間該稠合環的一邊有兩個非橋頭環原子而在另一邊則有三個非橋頭環原子，所述的稠合環一邊的兩個非橋頭環原子可被R7任意取代，另一邊的三個非橋頭環原子可被R3任意取代；其中R1、R2獨立地為H、F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3+、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2、R4、H2N(CH2)mCO、CONH2、CONHR4和H2N(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4、O(CH2)mCO、O(CH2)mCH(OH)(CH2)mNHCO(CH2)mNH、-O-、-S-、-HN(CH2)mCO、-CONH-、-CONR4、-HN(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4和-(CH2)mCH(OH)(CH2)mNHCO(CH2)mNH-，或者R1和R2中有一個基團下存在；R3為選自下列基團的基團F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3+、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2和R4、或者R3是可形成與Y1環成稠合環的3、4、5或6元環的基團，該R3可被一個、二個、三個R4基團取代；R4是含有1-20個碳原子的烷基或環烷基、含有1-20個碳原子和1-3個雙鍵的鏈烯基或環烯基、含有不超過25個碳原子的碳環芳基、含有不超過25個碳原子的雜環芳基、含有不多于25個碳原子的碳環或雜環芳烷基，其中R4可被1、2或3個F、Cl、Br、I、NH2、NHR5、N(R5)2、N(R5)3+、OH、OR5、SH、SR5、COR5、CONHR5、CON(R5)2或R5基團任意取代；R5是具有1-6個碳原子的烷基，R6是H、具有1-5個碳原子的烷基，或R6和R7共同形成一個4、5或6元環，-O-、-S-、-NH-、-NCH3-或N-低級烷基任意地是上述環的一部分；R7是F、甲基或乙基；-CH2-、或-CH2CH2-；m是1-10之間的整數n是1-10之間的整數，以及P是1-5之間的整數。
3.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的包括連接基內的小溝結合基由通式(a)代表。
4.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的包括連接基內的小溝結合基由通式(b)代表。
5.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的包括連接基內的小溝結合基由通式(c)代表。
6.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的包括連接基內的小溝結合基由通式(d)代表。
7.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的包括連接基內的小溝結合基由通式(e)代表。
8.根據權利要求1的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基與所述寡核苷酸的5′端相連。
9.根據權利要求1的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基與所述寡核苷酸的3′端相連。
10.根據權利要求1的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基與核苷酸單位相連，該核苷酸單位既不在所述寡核苷酸的3′端也不在所述寡核苷酸的5′端。
11.根據權利要求1的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基與核苷酸單位的雜環堿基相連。
12.根據權利要求10的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基與所述核苷酸單位的雜環堿基相連。
13.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的包括連接基在內的小溝結合基具有如下通式 其中n為2-5。
14.根據權利要求13的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基與所述寡核苷酸的3′端相連。
15.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的包括連接基在內的小溝結合基具有如下通式 其中n＝2-5。
16.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的包括連接基在內的小溝結合基具有如下通式 其中n＝2-5。
17.根據權利要求16的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基與所述寡核苷酸的3′端相連。
18.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基由通式(a)代表，式(a)中的5元環具有如下的結構
19.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基由通式(a)代表，式(a)中的5元環具有如下的結構
20.根據權利要求2的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基由通式(b)代表，式(b)中的稠合環體系具有如下的結構
21.根據權利要求1的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，還包括與至少一個所述的核苷酸單位共價相連的交聯官能團。
22.一種寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，包括含有多個核苷酸單位、一個3′端和一個5′端的寡核苷酸和通過連接基與至少一個所述的核苷酸共價結合的小溝結合基，所述的連接基通過不超過15個的原子使該小溝結合基與所述的寡核苷酸共價結合，該結合物具有如下所示的通式 式中的X是O或S；q為3至100之間的整數；R8是H、OH、具有1-6個碳原子的烷氧基、O-C2-C6鏈烯基或F；B是糖苷配基，選自存在于核酸內的天然雜環堿基和6-羥基嘌呤、2-氨基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-N4-亞乙烯基胞嘧啶、4-氨基吡咯并[3，4-d]嘧啶、6-氨基-4-羥基[3，4-d]嘧啶；W1是H、PO(OH)2或其鹽，或是與所述的寡核苷酸的3′-或5′-端相連的小溝結合基，該W1包括通過不超過15個的原子共價連接所述的小溝結合基和寡核苷酸的連接基；W2是無或與一個糖苷配基B相連的小溝結合基，該W2包括將所述的小溝結合基共價連接到所述糖苷配基B上的連接基，或者W2是含有連接臂的交聯官能團，該連接臂使所述的交聯官能團與所述的糖苷配基共價連結；其中小溝結合基是分子量為150-2000道爾頓以非嵌入方式與雙鏈DNA、RNA或雜合體的小溝相結合的其締合常數大于約103的分子基團，條件是所述的W1和W2至少一個為小溝結合基。
23.根據權利要求22的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的包括連接基內的小溝結合基具有選自(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的通式R1-(HN-Y1-CO)n-R2(a)其中Y1表示含有兩個雙鍵和0-3個雜原子(選自N、S、O)的五元環，NH和CO分別與環上的兩個碳原子相連，這兩個碳原子被一個環原子隔開，當這兩個碳原子之間的這個環原子是碳或氮時它僅被H取代，而當這個環原子是氧或硫時它則不被取代，環上的其余原子可被1、2或3個R3基團任意取代；R1-(R6N-Y2-CO)n-R2(b)其中Y2是六元芳香環與含有一個雙鍵的五元環縮合成的稠合環，該稠合環體系中含有0-3個雜原子(所述雜原子選自氮、硫、氧)，R6N和CO分別與稠合環的兩個不同環上的碳原子相連，這兩個碳原子從一個共同橋頭原子算起均是第二個環原子，在CO和NR6之間稠合環的一邊有兩個非橋頭環原子而在另一邊有三個非橋頭環原子，所述的稠合環一邊的兩個非橋頭環原子可被R7任意取代，另一邊的三個非橋頭環原子可被R3任意取代；R1-(CO-Y3-NH)n-R2(c)其中Y3是含有0-3個N雜原子六元芳香環，CO和NH分別與環上相對處于1，4位的兩個碳原子相連，六元環被連有CO或NH的兩個碳原子分成兩邊，一邊未與CO或NH基團相連的兩個環原子被R3任意取代，另一邊未與CO或NH基團相連的兩個環原子被R7任意取代；R1-(HN-Y4-HN-CO-Y4-CO)p-R2(d)Y4含有0-3個N雜原子的6元芳香環，CO和NH分別與環上的相對處于1，4位的兩個碳原子相連，該六元環被環上連有CO或NH的兩個碳原子分成兩邊，一邊未與CO或NH相連的兩個環原子可被R3任意取代，另一邊未與CO或NH基團相連的兩個環原子可被R7任意取代；R1-(Y5)n-R2(e)其中Y5是六元芳香環與含有一個雙鍵的五元環的稠合環，該稠合環體系中含有0-3個雜原子，所述雜原子選自N、S、O；R1和R2分別與稠合環的不同環上的環碳原子相連，它們從共同的橋頭原子算起均是第二個環原子，在R1和R2之間該稠合環的一邊有兩個非橋頭環原子而在另一邊則有三個非橋頭環原子，所述的稠合環一邊的兩個非橋頭環原子可被R7任意取代，另一邊的三個非橋頭環原子可被R3任意取代；式中的R1、R2獨立地為H、F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3+、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2、R4、H2N(CH2)mCO、CONH2、CONHR4和H2N(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4、-O-、-S-、-HN(CH2)mCO、-CONH-、-CONR4、-HN(CH2)mCOO(CH2)mS(CH2)mC6H4NNC6H4和-(CH2)mCH(OH)(CH2)mNHCO(CH2)mNH-，或者R1和R2中有一個基團下存在；R3為選自下列基團的基團F、Cl、Br、I、NH2、NHR4、N(R4)2、N(R4)3+、OH、OR4、SH、SR4、COR4、CONHR4、CON(R4)2和R4，或者R3是可形成與Y1環成稠合環的3、4、5或6元環的基團；R4是含有1-20個碳原子的烷基或環烷基、含有1-20個碳原子和1-3個雙鍵的鏈烯基或環烯基、含有不超過25個碳原子的碳環芳基、含有不超過25個碳原子的雜環芳基、含有不多于25個碳原子的碳環或雜環芳烷基，其中R4可被1、2或3個F、Cl、Br、I、NH2、NHR5、N(R5)2、N(R5)3+、OH、OR5、SH、SR5、COR5、CONHR5、CON(R5)2或R5基團任意取代；R5是具有1-6個碳原子的烷基，R6是H、具有1-5個碳原子的烷基或R6和R7共同形成一個4、5或6元環，-O-、-S-、-NH-、-NCH3-或N-低級烷基任意地是所述環的一部分；R7是F、甲基或乙基；-CH2-，或-CH2CH2-；m是1-10之間的整數n是1-10之間的整數，以及P是1-5之間的整數。
24.根據權利要求23的寡核苷酸結合物，其中至少W1基團為小溝結合基和連接基，和W2為無。
25.根據權利要求23的寡核苷酸結合物，其中W2基團為小溝結合基和連接基。
26.根據權利要求24的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的包括連接基在內的小溝結合基由通式(a)代表，式(a)中的5元環具有如下的結構
27.根據權利要求24的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基由通式(a)代表，式(a)中的5元環具有如下的結構
28.根據權利要求24的寡核苷酸和小溝結合劑的結合物，其中所述的小溝結合基由通式(b)代表，式(b)中的稠合環體系具有如下的結構
全文摘要
小溝結合劑與寡核苷酸通過共價鍵結合，寡核苷酸的堿基序列與單鏈或雙鏈DNA、RNA或雜合體的靶序列互補。共價結合的寡核苷酸－小溝結合劑共軛物能增強與互補鏈靶序列的結合力。
文檔編號C07H19/00GK1644585SQ20041005589
公開日2005年7月27日 申請日期1996年4月3日 優先權日1995年4月3日
發明者伊戈爾·V·庫佳溫, 歐亨尼·A·盧克坦諾夫, 霍華德·B·岡佩爾, 小里奇·B·邁耶 申請人:依波奇生物科學公司