專利名稱：一種產醇腈酶微生物的篩選方法
技術領域：
本發明涉及產醇腈酶微生物的篩選方法。
醇腈酶(Hydroxynitrile lyases or oxynitrilases，EC 4.1.2.10，EC 4.1.2.11，EC 4.1.2.37，EC 4.1.2.39)是一種催化醇氰化合物(Cyanohydrins)分解和合成的酶，分解的產物或催化合成的底物為氫氰酸和相應的醛或酮，根據酶解反應對底物構型的要求不同，醇腈酶分為R型和S型。該酶促反應具有高度的對映體專一性和較低的底物特異性，合成反應生成的光活性醇氰化合物可轉化成鄰羥基胺、α-羥基酸、羥基醛、羥基酮和α-氟代羧酸等多種重要的手性中間體或手性藥物。分解反應可消除苦杏仁、木薯淀粉等食品或飼料中含氰有毒物質，因此醇腈酶在精細化工、醫藥、食品、農業和畜牧業等方面具有廣泛的應用前景。
自從1908年Rosenthaler利用苦杏仁的混合酶液(emulsin，富含醇腈酶)合成R型扁桃腈以來，從六個科的植物組織分離純化到十二種醇腈酶，如黑櫻桃醇腈酶(PaHNL)、雙色高梁醇腈酶(SbHNL)、木薯醇腈酶(MeHNL)和橡膠醇腈酶(HeHNL)等等。但由于植物的生長周期長，受地理、氣候條件的影響較大，加工分離的工藝復雜，成本較高，制約了植物醇腈酶的應用。眾所周知，微生物生長旺，繁殖快，容易實現工業化生產，無疑是醇腈酶的廉價來源。然而，迄今尚未見到微生物醇腈酶及其篩選方法的相關報道。
本發明的目的是設計一種簡便易行的方法，適用于各種可以分離到微生物的樣品或保藏的菌株等樣品中篩選產醇腈酶的微生物，以獲得豐富廉價的酶源。
本發明的特點是利用醇氰化合物及其衍生物作為底物，充當富集、分離培養基的氮源或碳、氮源，通過苦味酸試紙法、巴比妥酸—吡啶比色法或紫外分光光度法檢測酶活性，分別進行菌株的初篩、復篩。
本發明的技術方法是用滅菌水將試樣配制成懸浮液，接種0.1～0.5毫升懸浮液到裝有1～10毫升富集培養基的試管，在20～40℃、150～450轉/分鐘的搖床上培養。每升富集培養基的成分為葡萄糖0～15克，酵母膏0.1～1克，玉米漿0.1～0.5克，硫酸鎂0.1～0.4克，氯化鈣0.05～0.3克，磷酸氫二鈉1.2～2.5克，微量元素混合液1～3毫升，pH3～7。分裝后，在0.1MPa下滅菌30分鐘，接種前加入過濾除菌的醇氰化合物或衍生物至0.05～2％。微量元素混合液的組成為(％)硫酸亞鐵0.025，氯化鋅0.03，硫酸錳0.022，氯化銅0.01，硫酸鈷0.003，硼酸0.006。富集培養數天后，取產生混濁的試管液體涂布于分離平板，20～40℃溫箱靜止培養。分離培養基除另含1～2％的瓊脂外，其它成分同富集培養基。挑選單個菌落再接種到富集試管，利用苦味酸試紙法定性檢測醇腈酶活性，其中來源于保藏的菌株省掉分離過程，可接種富集管后直接檢測酶活。陽性菌株再通過巴比妥酸—吡啶比色法或紫外分光光度法進行復篩。也可以省掉苦味酸試紙法，直接利用這兩種方法篩選分離獲得的單個菌株和保藏的菌株。
苦味酸試紙法是基于酶解反應生成的揮發性氫氰酸，被堿性苦味酸試紙吸收后，與苦味酸反應生成磚紅色物質。
利用紫外法和巴比妥酸-吡啶比色法復篩或直接篩選時，將待篩菌種接種到裝有50毫升發酵培養基(其成分與相應的富集培養基相同)的250毫升三角瓶，20～40℃，150～450轉/分鐘旋轉搖床培養24～240小時，發酵液離心分成上清和菌體，后者經0.9％NaCl溶液洗滌1或2次，并懸浮在5～10毫升0.01M磷酸緩沖液中，pH5.5～6.5，4℃下超聲波破碎細胞3～10分鐘，細胞裂解液在10000-18000轉/分鐘離心15-30分鐘，收集上清，即無細胞粗酶液，它與發酵液的上清用下述方法之一分別檢測酶活。
紫外法是根據苯甲醛在249nm波長處有一特征吸收峰而設計的。具體步驟見實施例1(5)。一個酶單位定義為在25℃，pH5.4，每分鐘釋放出1μmol苯甲醛所需的酶量。
巴比妥酸—吡啶比色法HCN先被氧化成CN+，CN+與吡啶反應生成戊烯二醛，后者經Konig反應形成藍紫色化合物。具體操作步驟和試劑的配制見實施例2(5)。酶單位定義為在25℃，pH5.4，每分鐘釋放出1μmol氫氰酸所需的酶量。
實施例1(1)將無菌水配制的1～2％土樣懸浮液、保藏菌株懸浮液、植物表皮組織的浸洗液，分別接種0.2毫升到裝有10毫升富集培養基，在30℃、210轉/分鐘的搖床上培養。每升富集培養基的成分為葡萄糖5克，酵母膏0.5克，玉米漿0.2克，硫酸鎂0.25克，氯化鈣0.1克，磷酸氫二鈉1.36克，微量元素混合液2毫升，用氫氧化鈉和鹽酸水溶液調pH至4，分裝后，在0.1MPa下滅菌30分鐘，接種前加入過濾除菌的扁桃腈至0.1～0.3％。微量元素混合液的組成為(％)硫酸亞鐵0.025，氯化鋅0.03，硫酸錳0.022，氯化銅0.01，硫酸鈷0.003，硼酸0.006。
(2)富集培養5天后，取產生混濁的試管液體涂布于分離平板，30℃溫箱靜止培養。挑選單個菌落再接種到富集試管，并在與富集相同的條件下發酵培養。平板分離培養基除另含1～2％的瓊脂外，其它成分同富集培養基。其中來源于保藏的菌株省掉分離過程，可接種富集管后直接檢測酶活。
(3)苦味酸試紙法初篩酶活性的步驟如下將每個樣品每毫升含15毫克濕重菌體的5毫升懸浮液置入帶蓋子的試管(菌體經生理鹽水洗滌兩次后，用0.1M檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液配制成懸浮液，pH4.0)，依次加入0.005毫升DL-扁桃腈，混勻后迅速用大小適當的苦味酸試紙片覆蓋管口，擰緊管蓋，30℃保溫48小時觀察結果。同時設制三個陰性對照管和三個陽性對照管，前者每支由5毫升0.1M檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液(pH4)、0.005毫升扁桃腈組成，后者除含2個單位醇腈酶外，其它成分同陰性對照。陽性對照出現明顯的磚紅色，陰性為黃色。所用的苦味酸試紙片是分別通過濾紙在飽和苦味酸溶液中浸染、晾干，滴加0.5M碳酸鈉溶液至濾紙濕透，再晾干而獲得。
(4)復篩時，將經初篩獲得的陽性菌或保藏菌接種到裝有50毫升發酵培養基(其成分與相應的富集培養基相同)的250毫升三角瓶，28℃，220轉/分鐘旋轉搖床培養72小時，發酵液離心分成上清和菌體，后者經0.9％NaCl溶液洗滌1或2次，并懸浮在10毫升0.01M磷酸緩沖液中，pH6.2，4℃下超聲波破碎細胞10分鐘，細胞裂解液在12000轉/分鐘離心15分鐘，收集上清，即無細胞粗酶液，它與發酵液的上清用紫外法分別檢測酶活。
(5)紫外法的反應體系包括3.8毫升0.1M磷酸緩沖液(pH5.4)、0.2毫升無細胞粗酶液或發酵上清液，0.2毫升0.0042M DL-扁桃腈溶液(0.01M檸檬酸水溶液配制)。當加入底物后，立即用光徑1cm，5毫升的石英比色杯在25℃于249nm波長處連續測定其吸光度隨時間的變化ΔAt，并減去空白對照ΔAc，獲得的ΔAsymbol 162\f″Symbol″\s 12用于下述酶活力單位的計算。酶活力計算公式酶活力(單位/毫升)＝symbol 68\f″Symbol″\s12ΔAsymbol 162\f″Symbol″\s 12譜t矗/(13.2譼譜e)，Vt＝反應液的總體積，Ve＝酶液的體積，n＝酶液稀釋倍數，t＝檢測時間的長度(分鐘)，13.2為苯甲醛的克分子消光系數。
(6)利用該法篩選到產R型或S型醇腈酶的微生物，包含有細菌、放線菌、酵母和真菌菌株。實施例2(1)將滅菌水配制的1～2％土樣懸浮液、保藏菌株懸浮液、植物組織表皮的浸洗液，分別接種0.2毫升到裝有10毫升富集培養基，在30℃、210轉/分鐘的搖床上培養。每升富集培養基的成分為葡萄糖8克，酵母膏0.5克，玉米漿0.2克，硫酸鎂0.20克，氯化鈣0.1克，磷酸氫二鈉1.45克，微量元素混合液2毫升，用氫氧化鈉和鹽酸水溶液調pH至5，分裝后，在0.1MPa下滅菌30分鐘，接種前加入過濾除菌的丙酮醇氰至0.3％，培養過程中，每間隔二天每管補加丙酮醇氰40微升。微量元素混合液的組成同實施例1(1)。
(2)同實施例一(2)。
(3)同實施例一(3)，底物改為丙酮醇氰，10微升用量。
(4)復篩時，將經初篩獲得的陽性菌或保藏菌接種到裝有50毫升發酵培養基(其成分與相應的富集培養基相同)的250毫升三角瓶，28℃，220轉/分鐘旋轉搖床培養48～120小時，發酵液離心分成上清和菌體，后者經0.9％NaCl溶液洗滌1或2次，并懸浮在10毫升0.01M磷酸緩沖液中，pH5.8，4℃下超聲波破碎細胞10分鐘，細胞裂解液在12000轉/分鐘離心15分鐘，收集上清，即無細胞粗酶液，它與發酵液的上清用下述(5)巴比妥酸—吡啶比色法分別檢測酶活。也可以省掉苦味酸試紙法，直接利用比色法檢測分離獲得的單個菌株和來自保藏的菌株。
(5)巴比妥酸—吡啶比色法將0.4毫升發酵上清液或0.4毫升無細胞粗酶液和4.6毫升0.1M檸檬酸～磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.4)混合，加入0.2毫升10％丙酮醇氰(0.01M檸檬酸配制)后25℃保溫，并分別在不同時間取反應液0.02毫升，加入裝有5.0毫升N-氯琥珀酰胺水溶液的試管終止酶反應，隨即加入1.0毫升顯色劑，15分鐘后，580nm波長處讀取吸光度，同時設置空白對照管和標準管。所用試劑的配制N-氯琥珀酰胺水溶液0.125克N-氯琥珀酰胺、1.25克琥珀酰胺用蒸餾水定容至500毫升；顯色劑巴比妥酸7.5克溶于75毫升吡啶，用蒸餾水稀釋到250毫升；標準溶液由氰化鉀配制成1.5symbol 109\f″Symbol″\s 12μmol/ml的水溶液。酶活力計算公式為酶活力(單位/毫升)＝(symbol 68\f″Symbol″\s 12ΔA測定管-symbol 68\f″Symbol″\s 12ΔA空白管)譜t×1.5矗/(A標準管譜e譼)，Vt＝反應液的總體積，Ve＝酶液的體積，n＝酶液稀釋倍數，t＝檢測時間的長度(分鐘)。
(6)同實施例一(6)實施例3(1)將滅菌水配制的1～2％土樣懸浮液、保藏菌株懸浮液、植物組織表皮的浸洗液，分別接種0.4毫升到裝有10毫升富集培養基，在30℃、210轉/分鐘的搖床上培養。每升富集培養基的成分為酵母膏0.3克，玉米漿0.2克，硫酸鎂0.25克，氯化鈣0.1克，磷酸氫二鈉1.36克，微量元素混合液2毫升，用氫氧化鈉和鹽酸水溶液調pH至4，分裝后，在0.1MPa下滅菌30分鐘，接種前加入過濾除菌的D-扁桃苷(amygdalin)0.5％(W/V)。微量元素混合液的組成同實施例1(1)。
(2)同實施例1(2)。
(3)同實施例1(3)。
(4)同實施例1(4)。
(5)同實施例1(5)。
(6)利用該法篩選到產R型醇腈酶的細菌、放線菌、酵母和真菌菌株。實施例4(1)將滅菌水配制的1～2％土樣懸浮液、保藏菌株懸浮液、植物組織表皮的浸洗液，分別接種0.4毫升到裝有10毫升富集培養基，在30℃、210轉/分鐘的搖床上培養。每升富集培養基的成分為酵母膏0.3克，玉米漿0.2克，硫酸鎂0.25克，氯化鈣0.1克，磷酸氫二鈉1.36克，微量元素混合液2毫升，用氫氧化鈉和鹽酸水溶液調pH至5.5，分裝后，在0.1MPa下滅菌30分鐘，接種前加入過濾除菌的百脈根苷(lotaustralin)0.6％(W/V)。微量元素混合液的組成同實施例1(1)。
(2)同實施例2(2)。
(3)同實施例2(3)。
(4)同實施例2(4)。
(5)同實施例2(5)。
(6)利用該法篩選到產S型醇腈酶的細菌、放線菌、酵母和真菌菌株。
權利要求
1.一種篩選產醇腈酶微生物的新方法，其特征在于利用醇氰化合物作為唯一氮源或碳、氮源的培養基，對樣品進行富集分離，獲得的單株，用苦味酸試劑進行產醇腈酶菌株的篩選。再通過巴比妥酸—吡啶比色法或紫外分光光度法檢測酶活性，獲得產醇腈酶菌株。
2.根據權利要求1，其特征在于本法適用于各種可分離到微生物的樣品如果園、農田、菜田及有野生植物生長的山丘；化學物質和食品、果品加工工廠污染的土壤和水；植物組織，以及現存或保藏的微生物菌種，進行產醇腈酶微生物的篩選。
3.根據權利要求1所述的方法，富集、分離培養基的特征在于以醛或酮合成的醇氰化合物作為培養基的氮源或碳、氮源，每升培養基的組成為葡萄糖0～20克，最適量0～10克，酵母膏0.1～1克，最適量0.1～0.5克，硫酸鎂0.1～0.4克，氯化鈣0.05～0.3克，磷酸氫二鈉1.2～2.5克，微量元素混合液1～3毫升，瓊脂0～20克，pH3～7，最適pH3～5，接種前加入過濾除菌的醇氰化合物或其衍生物，濃度為0.05～1％(W/V)，最適濃度0.1～0.5％(W/V)。微量元素混合液的組成含Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Co2+、BO32-。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于利用苦味酸試劑，，可以用苦味酸試紙法檢測平板分離獲得或保藏的經過液體富集培養基培養的純株微生物，獲得初篩結果。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于應用巴比妥酸—吡啶比色法或紫外分光光度法的方法檢測酶活性；初篩獲得的產酶菌株再通過巴比妥酸—吡啶比色法或紫外分光光度法進行定量復篩；也可以直接利用這兩種方法對分離獲得的單個菌株和保藏的菌株進行篩選。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于此方法適用于產醇腈酶的細菌、放線菌、酵母和真菌的篩選。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于從微生物菌株中可以篩選到R型醇腈酶和S型醇腈酶。
全文摘要
本發明涉及從土壤、環境污染物、植物組織及保藏的微生物等樣品中篩選產醇腈酶微生物的全新方法,利用該法篩選到多種產醇腈酶微生物的菌株。
文檔編號C12N9/00GK1258743SQ9812659
公開日2000年7月5日 申請日期1998年12月31日 優先權日1998年12月31日
發明者孫萬儒, 程樹華 申請人:中國科學院微生物研究所