一種含腈水解酶細胞的固定化方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種細胞的固定化方法，特別涉及一種含腈水解酶細胞的固定化方 法。 (二）
【背景技術】
[0002] 腈水解酶具有催化效率高和區域選擇性好的特點，能夠快速高效地將1-氰基環 己基乙腈中亞甲基上的氰基水解為羧基而保留環己基上的氰基，可用于生物合成抗癲癇藥 加巴噴丁藥物中間體1-氰基環己基乙酸的催化劑。相對游離細胞反應過程易破損、重復利 用率低，產物回收困難等缺點，通過物理，化學的方法將腈水解酶全細胞固定成顆粒后，可 增強細胞對毒性腈類底物的耐受性，有利于催化劑連續多批次使用和產物分離精制，可實 現生產過程的連續化，自動化，可控化，從而提高產品質量，降低生產成本。因此在工業化應 用中研宄了眾多固定化的方法，以提高腈水解酶全細胞的穩定性。
[0003] 在腈水解酶全細胞固定化方法中，Almatawah等人利用海藻酸鈉包埋腈水解酶細 胞連續生產煙堿酸，在IOOmM底物濃度下使用10批次后，酶活殘留70% (Almatawah et al/ Enzyme and Microbial Technology 25(1999)718-274)。Nigam 等人利用瓊脂包埋腈水 解酶細胞連續生產丙烯酸，在IOOmM底物濃度下使用25批次后，酶活殘留65% (Nigam et al/J. Biosci 34(2009)21-26)。柳志強等人利用海藻酸鈉和聚乙烯醇復合包埋腈水解酶 細胞連續生產亞胺基二乙酸，在75mM底物濃度下使用10批后，酶活殘余40% (Zhi-Qiang Liu et al/J Mol Microbiol Biotechnol 22(2012)35-47)。薛亞平等人用海藻酸鈉包 埋腈水解酶細胞并用聚乙烯亞胺和戊二醛交聯生產R-(-)_扁桃酸，在20mM扁桃腈底物 濃度下重復利用 19 批次（Ya-Ping Xue et al/0rganic Process Research&Development 17(2013)213-220)。Cooling等人利用卡拉膠包埋腈水解酶細胞并用聚乙烯亞胺和戊二 醛交聯連續生產4-氰基戊酸，在150mM底物濃度下使用4批后酶活殘留80% (Cooling et al/Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic 11(2001)295-306)。這些細 胞包埋法在工業化應用中都要面臨載體基質傳質受限制，底物濃度低，載體機械強度不 高導致操作穩定性差等缺點。張志軍等人用戊二醛交聯腈水解酶細胞生產R-(-)_扁 桃酸，IOOmM 底物濃度下重復使用 15 批（Zhi-Jun zhang et al/Bioprocess Biosyst Eng(2014) 1241-1248)，雖然解決了傳質限制等問題，但仍然存在顆粒強度低，使用批次低 的問題。Ni等人用鄰苯二酚殼聚糖結合氧化鐵納米顆粒制備固定化腈水解酶細胞生產 R_(_)_ 扁桃酸，IOOmM 底物濃度下重復使用 16 批（Ni et al/Journal of Biotechnology 167(2013)433-440)。雖然此方法具有一定創新性，但在實際的工業化應用中存在固定化細 胞制備復雜，細胞回收不便捷難以在大規模生產中使用等問題。
[0004] 美國專利（US6551804B2)報道了用海藻酸鈣包埋腈水解酶細胞并交聯戊二醛和 聚乙烯亞胺以及卡拉膠包埋腈水解酶細胞并交聯戊二醛和聚乙烯亞胺的方法生產4-氰基 戊酸。美國專利（US20050009154A1)報道了用海藻酸鈉固定化腈水解酶細胞生產1-氰基 環己基乙酸。這些包埋方法受到海藻酸鈣載體基質傳質限制，大量非催化載體影響催化劑 性能。卡拉膠凝膠過程溫度較高容易使酶失活等問題而難于很有效應用于工業化生產。
[0005] 在游離腈水解酶固定化的方法中，Sandeep Kumar等人用交聯腈水解酶聚體的 方法進行固定化生產R-(-)_扁桃酸，IOmM底物濃度下重復使用5批（S. kumar et al/ Bioresource Technology 101(2010)6856-6858)。Joshua D. Swartz 等人用二氧化娃納米 顆粒包埋腈水解酶生產煙堿酸，5mM底物濃度下重復使用10批（Joshua D. Swartz/Organic Process Research&Development 13(2009)584-589)。這些方法仍然沒有很好解決操作穩 定性差，游離酶在固定化過程中易失活，所用材料難以有效放大等問題。
[0006] 因此研宄一種成本低、性能優異，制備簡單且可實現1-氰基環己基乙酸工業化生 產的固定化方法，具有非常重要的現實意義。 (三）
【發明內容】

[0007] 本發明目的在于克服腈水解酶催化生產1-氰基環己基乙酸過程中由于雙腈底物 毒性大，底物溶解度低而造成的反應批次低等問題，提供了一種含腈水解酶細胞的固定化 方法。
[0008] 本發明采用的技術方案是：
[0009] 本發明提供一種含腈水解酶細胞的固定化方法，所述方法為：將含腈水解酶基因 的重組基因工程菌經發酵培養獲得的濕菌體加入緩沖液或蒸餾水中，制成菌懸液；向菌懸 液中添加載體，攪拌混勻，再加入聚乙烯亞胺，攪拌絮凝〇. 5~2h，然后加入戊二醛進行交 聯，10~25°C攪拌交聯0. 5~2h后，棄去上清液，真空抽濾后，得含腈水解酶的固定化細 胞；所述載體為硅藻土、珍珠巖或活性炭；所述載體與菌懸液中濕菌體重量比為〇. 01~ 0· 1 :1〇
[0010] 進一步，所述腈水解酶基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示，編碼蛋白的氨基酸 序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 進一步，所述緩沖液為pH = 7. 0、IOOmM磷酸鹽緩沖液。
[0012] 進一步，所述緩沖液或蒸餾水體積用量以濕菌體濕重計為5ml/g~15ml/g。
[0013] 進一步，所述戊二醛以體積濃度25% (v/v)戊二醛水溶液形式加入，所述25% (v/ v)戊二醛水溶液體積用量以濕菌體重量計為0. 05~0. 5ml/g(優選0. 3ml/g)。
[0014] 進一步，所述聚乙烯亞胺以體積濃度5% (v/v)聚乙烯亞胺水溶液形式加入，所述 5% (v/v)聚乙稀亞胺水溶液體積用量以濕菌體重量計為0. 01~I. 0ml/g(優選0. lml/g)， 本發明所述聚乙烯亞胺分子量70000,聚合度1600。
[0015] 進一步，所述重組基因工程菌構建方法為：將SEQ ID NO. 1所示腈水解酶基因與 PGEM-T載體連接后導入E. coli JM109中，提取連接質粒并與質粒pET28b(+)-Nit進行雙 酶切后，連接過夜，將連接產物導入宿主E. coli BL21(DE3)中，獲得重組大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)/pET28b(+)-F168V。
[0016] 進一步，所述濕菌體的制備方法為：
[0017] (1)將含腈水解酶基因的重組基因工程菌接種至斜面培養基，37°C培養12h，獲得 斜面菌體；斜面培養基組成為：l〇g/L蛋白胨，10g/L氯化鈉，5g/L酵母粉，20g/L瓊脂，溶劑 為水，pH自然；
[0018] ⑵將斜面菌體接種至種子培養基，37°C培養12h，獲得種子液；種子培養基組成： lOg/L蛋白胨，lOg/L氯化鈉，5g/L酵母粉，溶劑為水，pH自然；
[0019] (3)將種子液以體積濃度3. 3%接種量接種至發酵培養基，37°C、150rpm條件下培 養2h，然后加入10g/L乳糖誘導劑，28°C、150rpm條件下誘導12h，取發酵液離心，收集濕菌 體；發酵培養基組成：甘油12g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，KH2PO4L 36g/ L，Κ2ΗΡ042· 28g/L，MgSO4O. 375g/L，（NH4) 2S045g/L，溶劑為去離子水，pH 7· 0。
[0020] 本發明所述重組基因工程菌最優選以含腈水解酶的重組大腸桿菌E. coli BL21(DE3)/pET28b(+)-F168V為例，所述重組大腸桿菌是將Acidovorax facilis ZJB09122 腈水解酶突變體基因 F168V(核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示）與PGEM-T載體進行連接 后導入E. coli JM109中，對F168V/PGEM-T和質粒pET28b (+)-Nit進行雙酶切，連接酶連 接過夜，將連接產物pET28b(+)-F168V導入宿主E. coli BL21(DE3)中，所得的重組大腸桿 菌 E. coli BL21(DE3)/pET28b(+)_F168V 作為生產菌種（Xin-Hong Zhang et al/Process Biochemistry 49(2014)2141-2148)。
[0021] 本發明所述硅藻土分子式為SiO2，分子量為60. 08,中位粒徑19. 6 μ m，比重0. 32 能吸收大于本身4倍的水；溶于濃堿和氫氟酸，不溶于水、酸或稀堿，優選購自阿拉丁公司。
[0022] 本發明所述珍珠巖，化學組成Si02:70~75%，Al 203:12~16%，Na2O :1· 0%~ 4. 0%，K2O :1· 0%~4. 0%，外觀白色顆粒，比重0· 09,熔點：1280~1350°C，優選購自杭州 錦大綠產業技術有限公司。
[0023] 本發明所述活性炭，分子式為C，分子量為12. 01，比重1. 8,對有機色素和含氮堿 有高容量的吸附能力，優選購自阿拉丁公司。
[0024] 本發明方法是在初始高密度培養基中發酵生產腈水解酶；然后將發酵液離心獲得 菌體與緩沖液或蒸餾水混合成菌懸液，添加載體（如硅藻土），攪拌混勻，再與聚乙烯亞胺 混合，攪拌使菌體絮凝；最后向溶液中加入戊二醛進行交聯，真空抽濾后得固定化細胞。
[0025] 本發明所述含腈水解酶細胞的固定化方法中，在緩沖液或蒸餾水混合成菌懸液 中，載體、聚乙烯亞胺、戊二醛的添加順序是：首先添加載體、然后添加聚乙烯亞胺、最后添 加戊二醛；添加順序調將顯著降低固定化細胞酶活回收率和操作穩定性。眾所周知，沒有一 種固定化方法適合所有的酶或細胞，即使是同樣的細胞由于含有不同的酶，同樣固定化細 胞的方法或相同方法不同操作步驟產生的效果也會有巨大的差異。本發明的重點是提供一 種適用于SEQ ID NO. 1所示核苷酸編碼的腈水解酶細胞的固定化方法，為催化1-氰基環己 基乙腈生產1-氰基環己基乙酸降低成本。
[0026] 與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在：
[0027] 本發明所提供的固定化方法具有固定化材料成本低，操作簡單，重