專利名稱：：乙醇酸的酶促生產的制作方法乙醇酸的酶促生產本申請要求都于2004年12月22日提交的美國臨時申請第60/638,176和60/638,127號的權益。發明領域本發明涉及微生物學和分子生物學領域。更具體地說，提供了一種使用具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶，由乙醇腈酶促生產乙醇酸的方法。發明背景乙醇酸(HOCH2COOH;CAS登記號為79-14-1)是羧酸的a-羥基酸家族的最簡單成員。其特性使之理想地廣泛用于消費和工業用途，包括用于水井修復、皮革工業、油氣工業、洗衣和紡織工業、在聚乙醇酸(PGA)制備中作為單體、以及作為個人護理產品成分。在多個行業中，乙醇酸還是的清潔劑的主要成分(乳制品和食品加工設別清潔劑、家用和機構用清潔劑、工業清潔劑[用于運輸設備、磚石建筑、印刷電路板、不銹鋼鍋爐和加工設備、冷卻塔/熱交換器]、以及金屬加工[用于金屬酸洗、銅拋光、蝕刻、電鍍、電解拋光])。最近，已報道聚乙醇酸作為阻氣性材料(即顯示高阻氧特性)用于包裝食品及汽水(WO2005/106005Al)。然而，乙醇酸的傳統化學合成產生了大量的雜質，在用于制備作為阻氣性材料的聚乙醇酸之前必須除去。商業化生產乙醇酸的新技術，特別是一種以高純度及低成本生產乙醇酸的技術，將是工業上所渴望獲得的。已知多種使用相應的a-羥基腈作為原料以及微生物作為催化劑用于制備a-羥基酸的方法。所產生的a-羥基酸的例子包括乙醇酸、乳酸、2-羥基異丁酸、2-羥基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羥基-3,3-二甲基-4-丁內酯和4-曱硫丁酸。這些產物是使用微生物合成的，例如屬于諾卡氏菌屬(AAocanikz)、芽孑包桿菌屬(5acz'〃w力、短桿菌屬(Srevz力ac/^n.ww)、金4干菌屬(^4wreo6a"en'ww)、々支單i包菌屬(尸sew(iomowa力、享L酪4干菌屬(0^eo^"er)、產減軒菌屬(^4/ca/扭we力、不動軒菌屬(^4"力柳Z"c^)、腸4干菌屬(五"/^ro6acfer)、節#干菌屬(/4w/zro6"cfer)、i矣希氏4干菌屬、微球菌屬(Mjctococcws)、鏈霉菌屬(5Yr，omyce力、黃桿菌屬(FAxvoZ)a"e"'謂)、氣單胞菌屬(Jerowo"—、枝動軒菌屬(綺cop/"m)、纖維單月包菌屬(0〃w/omo"oy)、歐文氏菌屬C&w/ma)、，I絲酵母屬(Q/"Wtfo)、無芽孑包桿菌屬(Sa"enV/z'i/附)、曲霉屬(^4s/grgz'〃i^)、青霉屬(尸ew/c/〃z.wm)、S走孑包月空菌屬(C0c/2/z'060/ws)、鐮孑包菌屬(Fz^"n.t/m)、纟工假單胞菌屬(朋otiop化W(icw7o"—、紅球菌屬(i/zo6fococc—、棒狀軒菌屬(Co^ywe6aCerz'wm)、纟田^干菌屬(Mz.cro6ac,erz.ww)、(9Z^wm6acfen'wm和戈登氏菌屬(Gonfo"a)的那些微生物(相應于US5,223,416的JP-A-4-99495、JP國A-4-99496和JP-A國4國218385;相應于US5,234,826的JP-A-4誦99497;相應于US5,296,373的JP-A-5-95795;JP-A-5-21987;相應于US5,326,702的JP-A陽5-192189;相應于EP畫A畫0610048的JP-A-6-237789;相應于EP-A-0610049的JP-A-6-284899;相應于US5,508,181的JP-A-7國213296)。然而，大多數已知的上述由相應的a-羥基腈制備a-羥基酸的方法并不產生并以足夠高的濃度積聚產物，以滿足商業上的需要。經常的結果是在反應初期酶就失活。US5,756,306教導了"當使用腈水解酶或腈水合酶酶促水解或水合a-羥基腈以產生a-羥基酸或a-幾基酰胺時，所出現的問題是在短時間內酶失活。因此，難以以高濃度和高產率獲得a-羥基酸或a-羥基酰胺"(第1欄，第49-54行)。維持反應混合物中醛濃度(由a-幾基腈解離為醛和氰化氫所形成的)和/或a-羥基腈濃度在規定的范圍內是一種避免該問題的方法。US5,508,181提出了涉及酶快速失活的更多困難。特別是，U.S.5,508,181提及根據解離平衡，a-羥基腈化合物部分解離為相應的醛。這些醛通過與蛋白結合，在短時間內失活酶，因此;f艮難由a-羥基腈以高產率獲得高濃度的a-羥基酸或a-羥基酰胺(第2欄，第16-29行)。阻止由于醛積聚所引起的酶失活的解決方案是將磷酸鹽或次磷酸鹽離子添加到反應混合物中。US5,326,702使用亞硫酸鹽、二亞硫酸鹽或連二亞硫酸鹽離子來螯合醛并阻止酶失活。然而，即使通過使用上述這樣的添加劑，所產生和積聚的a-羥基酸的濃度仍然是不高的。U.S.6,037,155教導了a-羥基酸產物的低積聚與由于解離的醛積聚所引起的短時間內酶失活相關。這些發明人提出在水中a-羥基腈部分解離所產生的氰4b氫04g"'cw/Z^ra/Sz'o/ogz'ca/C7zew^/T7，Vol.46,pages1165(1982))以及相應的醛或酮(C/ze脂ca/Vol.42,pages189(1948))存在下，酶活性受抑制。本發明人通過使用微生物解決了醛誘導的活問題，所述微生物酶活性能通過將氰化物添加到反應混合物中而得到改善。氰化物的添加限制了a-羥基腈解離為醛和氰化氫。具體就乙醇酸生產來說，已知乙醇腈能可逆解離為氰化氫和曱醛，兩者都可失活酶活性。US3,940,316描述了一種由相應的腈制備有機酸的方法，使用了具有"腈水解(nitrilasic)"活性的細菌，并列出乙醇腈作為底物。具體來說，該專利描述了對于該目的使用芽孢桿菌屬、無芽孢桿菌屬、微球菌屬和短桿菌屬細菌。雖然被描述具有腈水解活性，但是短桿菌R312C8reWk"enwwA3W)是在US3,940,316所有實施例中使用的唯一菌抹。已知短桿菌R312具有腈水合酶和酰胺酶活性，但沒有腈水解酵;舌'l"生(Toumeix等，Jwfowz.e丄eewwew/20eA:，52:173-182(1986》。一種通過利用屬于纟奉狀桿菌(Coo^e^c"n'wms/^.)的微生物制備乳酸、乙醇酸和2-羥基異丁酸的方法披露于日本專利/>開號昭61-56086中。JP09028390披露了一種通過紅球菌屬或戈登氏菌屬水解酶起作用，由乙醇腈制備乙醇酸的方法。報道了對乙醇酸的選擇性幾乎為100%,沒有乙醇酸酰胺生成。US6,037,155披露了由a-羥基腈產生包括乙醇酸的a-羥基酸的方法的例子。該/>開內容承認由于前述問題之故并非所有的微生物催化劑都能產生高濃度的乙醇酸，并教導應當進行篩選研究以便發現在工業上有益的微生物。US6,037,155具體鑒定了抗a-羥基腈或a國鞋基酸4中制效應的r"novorajc和節4干菌(jw/ztoZ^"w)孩支生物，具有持久的活性，并能在高濃度下產生期望的產物。敏捷食酸菌(JcWm;orajc/a"fe)72W(ATCC55746)具有脂族腈水解酶(EC3.5.5.7)活性，以及腈水合酶(EC4.2.1.84)和酰胺酶(EC3.5丄4)活性組合的特征。US5,814,508披露了于35-70°C,在適合的緩沖液中加熱敏捷食酸菌72W(ATCC55746)懸浮液一段短時間以鈍化全細胞催化劑不需要的腈水合酶和酰胺酶活性，不產生明顯減少的期望的腈水解酶活性。已克隆并重組表達了編碼敏捷食酸菌72W(ATCC55746)腈水解酶的基因((相應于US6,870,038的WO01〃5077)和Chauhan等，々p/A^cro&o/傷o/ec/mo/,61:118-122(2003))。壽丈捷食酸菌72W腈水解酶能以高產率將a-羥基腈轉化為相應的a-羥基羧酸(US6,383,786),包括乙醇酸(US6,416,980)。然而，對于降低工業生產成本，用于以高達100%轉化的高產率將乙醇腈轉化為乙醇酸的具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶應當是十分有用的。一種使用酶催化劑經濟地生產乙醇酸的方法需要利用能以高濃度將乙醇腈轉化為乙醇酸，并具有高催化劑生產率(公斤乙醇酸/公斤酶催化劑)和容積生產率(乙醇酸克數/升/小時)的催化劑。酶催化劑可用于多步連續分批反應(multipleconsecutivebatchreactions)中,或用于恒量添加乙醇腈并移除乙醇酸的連續反應中；在任何一種操作方式中，催化劑活性和壽命應以致于獲得高容積生產率和催化劑生產率，并且在分批反應情況下，催化劑應當在多個反應循環中得到利用，而不在連續分批反應之間明顯損失酶活性。具有改善的用于乙醇腈水解的腈水解酶活性的突變的腈水解酶能提供改善的容積生產率。鑒于在乙醇腈反應混合物中游離曱醛(以及可能的其他雜質)的失活效應會不同程度地消極影響所有腈水解酶催化劑的事實，還需要在用于乙醇腈水解的反應條件下穩定酶活性的改善(產生相對增加的催化劑生產率)。待解決的問題是提供一種利用具有明顯改善的用于乙醇腈水解的腈水解酶活性的酶催化劑增加乙醇酸體積生產率的方法。待解決的額外問題是提供一種增加用于乙醇酸生產的酶催化劑生產率和穩定性，由此降低酶催化劑成本和生產總成本的方法。發明概述本發明提供了由乙醇腈酶促生產乙醇酸的方法。提供了一種由乙醇腈生產乙醇酸的方法，包括a)將適合的含水反應混合物中的乙醇腈與包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化劑接觸，所述多肽具有SEQIDNO:6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代(1)在氨基酸殘基第168位用賴氨酸、曱硫氨酸、蘇氨酸或纈氨酸取代；和(2)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；由此產生乙醇酸；和b)以鹽或酸的形式回收(a)中產生的乙醇酸；其中當在相同的反應條件下將乙醇腈轉化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化劑提供了至少1.5倍腈水解酶活性的增加。在本發明的另一方面，提供了一種編碼具有腈水解酶活性的多肽的分離的核酸分子，所述核酸分子編碼具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代a)在氨基酸殘基第168位用曱硫氨酸或蘇氨酸取代；和b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當在相同的反應條件下將乙醇腈轉化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少1.5倍腈水解酶活性的增加。在又一方面，提供了一種當將乙醇腈轉化為乙醇酸時，顯示明顯改善的腈水解酶活性的分離的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代a)在氨基酸殘基第168位用曱硫氨酸或蘇氨酸取代；和b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當在相同的反應條件下將乙醇腈轉化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少1.5倍腈水解酶活性的增加。序列表和生物學保藏簡述以下序列描述和附于此的序列表符合37C.F.R.§1.821-1.825所列的指導專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列披露的規定。序列描述包含符合M/c/e/c爿c油T^e^Tc/z13:3021-3030(1985)和Woc/ze脂.c"/Jowrwa/219(No.2):345-373(1984)(它們在此并入作為參考)中所述的IUPAC-IYUB標準規定的對于核苷酸序列字符的單字母編碼和對于氨基酸的三字母編碼。用于核苷酸和氨基酸序列數據的符號和格式符合37C.F.R.§1.822的規定。SEQIDNO:1是用于擴增敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的引物165的核苷酸序列。隨后，將所擴增的PCR產物克隆入pUC19(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA;GenBankL09137)以創建質粒pSW138。SEQIDNO:2是用于擴增敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的引物166的核苷酸序列。隨后，將所擴增的PCR產物克隆入pUC19(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA;GenBankL09137)以創建質粒pSW138。SEQIDNO:3是用于擴增敏捷食酸菌72W腈水解酶的引物的核苷酸序列。SEQIDNO:4是用于擴增敏捷食酸菌72W腈水解酶的引物的核苷酸序列。SEQIDNO:5是敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的核苷酸序列，包含由TTG至ATG的起始密碼子改變以利于在大腸桿菌中重組表達。SEQIDNO:6是推斷的由SEQIDNO:5的核苷酸序列編碼的每丈捷食酸菌72W腈水解酶的氨基酸序列，所述核苷酸序列包含由TTG至ATG的起始密碼子改變以利于在大腸桿菌中重組表達。SEQIDNO:7是包含密碼子改變的壽丈捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產生單個氨基酸取代(L201Q;Leu—Gin)。SEQIDNO:8是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:7)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201—GIn)。SEQIDNO:9是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產生單個氨基酸取代(L201A;Leu—Ala)。SEQIDNO:10是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:9)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201—Ala)。SEQIDNO:11是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產生單個氨基酸取代(L201C;Leu—Cys)。SEQIDNO:12是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:ll)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201《ys)。SEQIDNO:13是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產生單個氨基酸取代(L201T;Leu—Thr)。SEQIDNO:14是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:13)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201—Thr)。SEQIDNO:15是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產生單個氨基酸取代(L201G;Leu—Gly)。SEQIDNO:16是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:15)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201—Gly)。SEQIDNO:17是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苦酸序列，其在殘基第201位產生單個氨基酸取代(L201H;Leu—His)。SEQIDNO:18是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:17)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201—His)。SEQIDNO:19是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產生單個氨基酸取代(L201K;Leu—Lys)。SEQIDNO:20是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:19)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201—Lys)。SEQIDNO:21是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第201位產生單個氨基酸取代(L201N;Leu—Asn)。SEQIDNO:22是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:21)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201—Asn)。SEQIDNO:23是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苦酸序列，其在殘基第201位產生單個氨基酸取代(L201S;Leu—Ser)。SEQIDNO:24是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:23)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第201位包含單個氨基酸取代(Leu201—Ser)。SEQIDNO:25是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產生單個氨基酸取代(F168K;Phe~>Lys)。SEQIDNO:26是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:25)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個氨基酸取代(Phel68—Lys)。SEQIDNO:27是包含密碼子改變的^t捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產生單個氨基酸取代(F168M;Phe—Met)。SEQIDNO:28是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:27)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個氨基酸取代(Phel68—Met)。SEQIDNO:29是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苦酸序列，其在殘基第168位產生單個氨基酸取代(F168T;Phe—Thr)。SEQIDNO:30是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:29)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個氨基酸取代(Phel6"Thr)。SEQIDNO:31是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產生單個氨基酸取代(F168V;Phe—Val)。SEQIDNO:32是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:31)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第168位包含單個氨基酸取代(Phel68—Val)。SEQIDNO:33是包含密碼子改變的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產生單個氨基酸取代(T210A;ThHAla)。SEQIDNO:34是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:33)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第210位包含單個氨基酸取代(Thr210—Ala)。SEQIDNO:35是包含密碼子改變的^:捷食酸菌72W腈水解酶突變體的核苷酸序列，其在殘基第168位產生單個氨基酸取代(T210C;Thr—Cys)。SEQIDNO:36是推斷的突變的腈水解酶(SEQIDNO:35)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的殘基第210位包含單個氨基酸取代(Thr210—Cys)。SEQIDNO:37是在大腸桿菌SS1001(ATCCPTA-1177;US6,870,038,在此并入作為參考)中表達的敏捷食酸菌72W腈水解酶基因的核苷酸序列。SEQIDNO:38是推斷的在大腸桿菌SS1001(ATCCPTA-1177)中表達的敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQIDNO:33)的氨基酸序列。業已依據國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約條款的規定進行了以下生物學保藏保藏人識別參考國際保藏編號_保藏日_敏捷食酸菌72WATCC557461996年3月8日大腸桿菌SS1001ATCCPTA-11772000年1月11曰如本文所使用的，"ATCC"指美國典型培養物保藏中心，位于ATCC,10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209,USA的國際保藏機構。"國際保藏編號"是在ATCC保藏的培養物的保藏號。所列的保藏物應當在所指明的國際保藏機構保藏至少三十(30)年，并且公眾在得到披露其的專利授權之后可以獲得。保藏物的可利用性并不構成對實施本發明的許可，這種實施會破壞通過政府行為4受予的專利權。發明詳述已通過提供了一種利用具有改善的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體，以高產率及在高濃度下由相應的乙醇腈制備乙醇酸的方法解決了所述問題。該解決所述問題的方法包括1)利用具有改善的腈水解酶活性和/或改善的用于將乙醇腈轉化為乙醇酸的催化劑生產率的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體，和2)在用于將乙醇腈轉化為乙醇酸的反應條件下，改善催化劑穩定性和/或生產率的方法。該在用于將乙醇腈轉化為乙醇酸的反應條件下，改善催化劑穩定性/生產率的方法，包括l)利用添加劑來穩定酶催化劑活性，2)在基本上無氧的條件下運行反應，和3)控制乙醇腈到反應混合物中的進料速度，以便保持乙醇腈的目標濃度。定義在本文中，使用了許多術語和縮寫。除非另作明確說明，否則使用以下定義。如本文所使用的，術語"包含"表示如權利要求中所提及的規定的特征、整體、步驟或組分的存在，但其并不排除一個或多個其他特征、整體、步驟、組分或它們的組的存在或添加。如本文所使用的，修飾所使用的本發明成分或反應物的數量的術語"約"指數量上的變化，所述變化可例如通過用于在真實世界中制備濃縮物或〗吏用溶液的標準量度和液體處理工序；通過在這些工序中的疏忽過失；通過用于制造組合物或執行方法的產品、原料或配料純度的差異等平衡條件之i丈所相異的量。無論是否為術語"約"所修飾，權利要求l括相等的量。在一個實施方案中，術語"約"表示在所報告的數值的10%之內，優選在所報告的數值的5%之內。如本文所使用的，術語"回收"表示分離、純化或轉移利用本發明方法所生成的產物。分離和純化來自反應混合物的產物的方法是本領域眾所周知的，可包括但不限于選擇性沉淀、結晶、過濾、反應性溶劑萃取、離子交換、電滲析、聚合、蒸餾、熱分解、醇解以及它們的組合。在一個實施方案中，術語"回收"還可包括將反應混合物(通常在濾除酶催化劑之后)轉移到另一種反應中以產生一種或多種額外的產物。如本文所使用的，術語"酶催化劑"或"微生物細胞催化劑"指具有用于將乙醇腈轉化為乙醇酸和氨的腈水解酶活性特性的催化劑(即包含至少一種具有腈水解酶活性的多肽)。酶催化劑可以完整的微生物細胞、透化處理的孩i生物細胞、孩i生物細胞提取物的一種或多種細胞成分、部分純化的酶或純化的酶的形式存在。酶催化劑可以是游離的(未固定的)或固定在可溶性或不溶性支持物中或其上。如本文所使用的，"再循環的酶催化劑"指在分批反應中被再生為酶催化劑的酶催化劑。如本文所使用的，術語"催化劑生產率"和"酶催化劑生產率"指每克催化劑產生的產物總量。在本發明中，所述催化劑是腈水解酶(EC3.5.5.7)，所產生的產物是乙醇酸和/或乙醇酸銨(取決于反應的pH)。一般而言，在基本上pH中性的條件下進行本發明方法，以便所產生的乙醇酸主要以乙醇酸相應的鹽(即乙醇酸銨)的形式存在。一般來說，在具有催化劑再循環的分批反應中，隨每一次循環反應催化劑活性而降低(酶失活)。如本文所使用的，術語"敏捷食酸菌04cWowrax/ac77z力"和"每丈捷食酸菌(A力c/fe)"可交換地使用，并指保藏在美國典型培養物保藏中心(國際保藏機構)，具有保藏號55746("ATCC55746")的敏捷食酸菌72W。如本文所使用的，術語"大腸桿菌(&c/ze"c/^co/0"和"大腸桿菌(Eco/0"可交換地使用。一些適合用于重組表達的大腸桿菌菌抹描述于此，包括但不限于具有國際保藏編號ATCC47076的大腸桿菌MG1655、具有國際保藏編號ATCC53911的大腸桿菌FM5、具有國際保藏編號ATCC27325的大腸桿菌W3110、具有國際保藏編號ATCC35695的大腸桿菌MC4100和具有國際保藏編號ATCC12435的大腸桿菌W1485。在一個實施方案中，適合的大腸桿菌菌抹包括大腸桿菌FM5(ATCC53911)和大腸桿菌MG1655(ATCC47076)。如本文所使用的，術語"大腸桿菌ssioor，或"ssioor，指表達敏捷食酸菌72W腈水解酶的轉化的大腸桿菌菌林，具有ATCC登記號PTA-1177(US6,870,038;其全文在此并入作為參考)。與野生型72W腈水解酶序列(SEQIDNO:6)相比，重組表達的大腸桿菌SS1001腈水解酶(SEQIDNO:38)含有2個小的序列改變。起始密碼子由GTG變為ATG以利于重組表達，并在克隆過程中導入在C-末端附近引起單個氨基酸改變(Pro367[CCA〗—Ser[TCA])的人工序列。如本文所使用的，術語"乙醇腈"縮寫為"GLN"，并且與羥基乙腈、2-羥基乙腈、羥基曱腈以及CAS登記號107-16-4的所有其他異名同義。如本文所使用的，術語"乙醇酸"縮寫為"GLA",并且與羥基乙酸(hydroxyaceticacid)、鞋基醋酸(hydroxyethanoicacid)以及CAS登記號79-14-1的所有其他異名同義。經本發明方法產生的乙醇酸可以質子化的羧酸和/或相應的銨鹽的形式存在。如本文所使用的，術語"乙醇酸銨"縮寫為"NH4GLA"。如本文所使用的，術語"乙交酯"指CAS登記號502-97-6的化合物。如本文所使用的，術語"適合的含水乙醇腈反應混合物"和"適合的含水反應混合物"指其中乙醇腈和酶催化劑得到接觸的物質和水。如本文所使用的，術語"腈水解酶催化劑"指具有腈水解酶活性(EC3.5.5.7)特性的酶催化劑。腈水解酶直接將脂族腈轉化為相應的羧酸，不形成作為中間體的相應的酰胺(方程式1)。方程式1.腈水解酶<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>如本文所使用的，術語"改良的腈水解酶"、"腈水解酶突變體"、"敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體"和"蛋白質工程的腈水解酶"可交換地使用來指在相同的反應條件下，與敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性相比，具有明顯改善的將乙醇腈轉化為乙醇酸的腈水解酶活性的本發明的腈水解酶。在一個實施方案中，當重組表達(使用相同的表達系統)并在基本上相同的反應條件下測定時，可通過比較本發明突變的腈水解酶催化劑與天然的敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，測定腈水解酶活性的改善。SDS-PAGE分析顯示本發明突變體及其相應的對照(SEQIDNO:6)之間的蛋白表達水平是基本上相的敏感的。同樣地，認為腈水解酶活性的改善是天然敏捷食酸菌72W腈水解酶結構修飾的結果。術語"腈水解酶活性"指當將乙醇腈轉化為乙醇酸(或相應的乙醇酸銨)時，每單位質量(例如毫克)蛋白、細胞干重或珠子重量(固定的催化劑)的酶活性。比較測量的腈水解酶活性，與細胞干重或珠子重量成正比。由于使用SDS-PAGE凝膠的激光光密度分析，在量上難以區分在敏捷食酸菌72W對照(SEQIDNO:6)和改良的突變體之間的腈水解酶表達水平，因此相對于細胞干重(dcw)或珠子重量(bw)，比較并測量報道的改善的腈水解酶活性。如本文所使用的，術語"一單位酶活性"或"一單位腈水解酶活性"或"U"規定為在規定溫度(如25。C)下，每分鐘產生1]imol乙醇酸產物需要的酶活性的量(GLAU/g細胞干重或珠子重量)。如本文所使用的，術語"相對的腈水解酶活性"、"改善的腈水解酶活性"和"在腈水解酶活性方面相對的改善"指表示為參照(對照)腈水解酶活性的倍數(或分數)的腈水解酶活性。相對于使用天然敏捷食酸菌72W腈水解酶所觀察到的腈水解酶活性，本發明突變的腈水解酶顯示明顯改<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>善的腈水解酶活性。在本發明中，相對腈水解酶活性的"明顯改善"是在相同的反應條件下，與對照(敏捷食酸菌72W腈水解酶；SEQIDNO:6)的腈水解酶活性相比，至少1.5倍更高的腈水解酶活性的改善。在另一個實施方案中，在相同的反應條件下，與對照的腈水解酶活性相比，所述改善是至少2倍更高的腈水解酶活性。在另一個實施方案中，在相同的反應條件下，與對照的腈水解酶活性相比，所述改善是至少4倍更高的腈水解酶活性。如本文所使用的，術語"初始反應速率"在規定的反應條件下，乙醇腈轉化為乙醇酸的速率的大小，其中剛一添加乙醇腈到反應混合物中，就產生的反應速率的大小，其中在反應過程中乙醇腈濃度保持在高于約50毫摩(mM)的一段時間內測定反應速率。根據每單位時間產生的乙醇酸濃度(如摩爾乙醇酸/升/分鐘或毫摩乙醇酸/小時)的改變測定反應速率。如本文所使用的，術語"重組生物"、"轉化宿主"、"轉化體"、"轉基因生物"和"轉化的微生物宿主"指已用異源或外源DNA轉化的宿主生物。本發明的重組生物表達編碼活性腈水解酶的外源編碼序列或基因。"轉化"指DNA片段轉移入宿主生物中。所述轉移的DNA片段可在染色體或染色體外摻入(即通過載體)宿主生物中。如本文所使用的，"轉化盒"指含有一組便于準備插入宿主細胞中的遺傳元件的DNA特定片段，通常作為質粒的一部分。如本文所使用的，"表達盒"指含有一組便于準備插入宿主細胞中的遺傳元件的DNA特定片段，通常作為質粒的一部分，還供在宿主中增強基因表達之用。如本文所使用的，術語"核酸片段"和"核酸分子"指可編碼完整基因、編碼序列和/或編碼序列前(5',上游)或后(3'，下游)的調節序列的DNA分子。在一方面，本發明的核酸分子編碼具有腈水解酶活性的多肽。如本文所使用的，"基因"指表達特定蛋白的核酸分子。如本文所使用的，其可以或不必包括編碼序列前的調節序列(5'非編碼序列)和編碼序列后的調節序列(3'非編碼序列)。"天然基因"指在自然界中發現的帶有其自身調節序列的基因。"嵌合基因"指不是天然基因的任何基因，包含在自然界中不同時出現的調節序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含來源于不同來源的調節序列和編碼序列，或來源于相同來源的調節序列和編碼序列，但排列方式與天然排列方式不同。"內源基因"指位于生物的基因組中的天然位點上的天然基因。"外源基因"指正常情況下不存在于宿主生物中的基因，但是所述基因是通過基因轉移導入宿主生物中的。外源基因可包含插入非天然生物中的天然基因或嵌合基因。"轉基因"是已通過轉化操作導入基因組的基因。如本文所使用的，術語"編碼序列"指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。如本文所使用的，"適合的調節序列"指影響轉錄、RNA加工或穩定性、或相關編碼序列的翻譯并位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、之中或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列。調節序列可包括啟動子、翻譯前導序列、內含子和多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結合位點和莖-環結構。"啟動子"指能控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一般而言，編碼序列位于啟動子序列的3'。啟動子可以完全來源于天然基因、或由來源于天然存在的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含合成的DNA區段。能使基因在大部分細胞類型中在大多數時間下或在大多數的環境條件下表達的啟動子，通常稱為"組成型啟動子"。能使基因僅在特定化合物或環境條件存在下表達的啟動子，通常稱為"誘導型啟動子"。由于在大多數情況下，調節序列的確切邊界還未完全確定，因此不同長度的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。如本文所使用的，術語"可操作地連接"指核酸序列在單一核酸分子上的結合，使得一條序列的功能受另一條影響。例如，當啟動子能影響編碼序列表達時，其就是與編碼序列可操作地連接的(即編碼序列受啟動子轉錄控制)。編碼序列可沿有義或反義方向可操作地與調節序列連接。如本文所使用的，術語"3'非編碼序列"指位于編碼序列下游并包括多腺苦酸化識別序列(通常限于真核生物)和其他編碼能影響mRNA加工或基因表達的調節信號的序列的DNA序列。多腺苷酸化信號(通常限于真核生物)一般特點在于影響多聚腺苦酸束添加到mRNA前體的3'末端上。本領域技術人員應充分意識到，在使用核苷酸密碼子來表示所給定的氨基酸中，特定宿主細胞具有"密碼子偏倚"。因此，當合成用于改善在宿主細胞中的表達的基因時，期望設計能使其密碼子使用反映優選的宿主細胞密碼子偏倚的基因。對其中序列信息可得到的來源于宿主細胞的基因的調查，可以確定其的密碼子偏倚。密碼子優化是本領域眾所周知的，且已被描述用于不同的系統，包括但不限于酵母(Outchkourov等,Ex/^尸w"/,24(1):18-24(2002))和大腸桿菌(Feng等，5/oc/ze脂Wr乂39(50):15399-15409(2000》。敏捷食酸菌72W腈水解酶(EC3.5.5.1)是一種用于由脂肪族或芳香族腈產生羧酸的穩定催化劑(WO01/75077;US6,870,038和Chauhan等，(同上))。還已顯示能催化a-羥基腈(即乙醇腈)轉化為a-羥基羧酸(即乙醇酸)(見US6,383,786和US6,416,980;它們的全文在此并入作為參考)。所有已知的腈水解酶，包括敏捷食酸菌72W腈水解酶，在酶活性中心中都具有親核的半胱氨酸(Cowan等，Ex/yewo;/n7^,2:207-216(1998);Pace,H.和Brenner,C，GewomeAo/ogy,2(1):reviewsl國9(2001);和Chauhan等，同上)且都易受硫醇試劑(l.OmM濃度的氯化銅、硝酸銀、乙酸汞或氯化鐵，每一種都引起敏捷食酸菌72W腈水解酶酶活性大幅降低)影響而失活。半胱氨酸殘基也能被不可逆地氧化為亞磺酸，導致酶活性損失。盡管腈水解酶對多種失活機制敏感，但是固定的敏捷食酸菌72W細胞是穩定的，在多次再循環反應后能保持其大部分腈水解酶活性(US6,870,038)。已報道了敏捷食酸菌72W腈水解酶與其他細菌腈水解酶的序列比較(US6,870,038;Chauhan等，同上)。該72W腈水解酶具有幾個保守的特征結構域，包括鄰近氨基末端的16-氨基酸區(SEQIDNO:6的氨基酸殘基40-55)和含有必需半胱氨酸殘基的催化區(SEQIDNO:6的氨基酸殘基160-173)。該半胱氨酸殘基(SEQIDNO:6的Cysl64)與保守的谷氨酸(SEQIDNO:6的Glu48)以及賴氨酸殘基(SEQIDNO:6的Lysl30)—起形成見于所有腈水解酶中的催化三聯體基序(Pace,H.,和Brenner,C,同上)。盡管在所報道的腈水解酶之中某些結構相似性是保守的，但是底物特異性變化很大(O'Reilly,C.和Turner,P.,J如/Mc油W,95:1161-1174(2003))。突變的腈水解酶特性之前已報道了一些來源于敏捷食酸菌72W腈水解酶的突變的腈水解酶(US10/919182;在此并入作為參考)。在US10/919182中，為了將3-羥基腈(即3-羥基丁腈和3-羥基戊腈)轉化為3-羥基酸的腈水解酶活性的相對改善(相對于重組表達的、天然的72W腈水解酶的活性)，選擇并篩選各種突變的腈水解酶。US10/919182中所述的腈水解酶突變體使用的表達系統是基于質粒pTrcHis2-TOPO⑧和大腸桿菌宿主TOP10(兩者都來自于Invitrogen,LaJoIIa,CA)的。使用實施例12所述的方法，在相同的表達系統中比較腈水解酶突變體F168L(SEQIDNO:6中第168位殘基由Phe變為Leu)、F168V(第168位殘基由Phe變為Val;SEQIDNO:32)、F168K(第168位殘基由Phe變為Lys;SEQIDNO:26)、T210A(第210位殘基由Thr變為Ala;SEQIDNO:34)和T210C(第210位殘基由Thr變為Cys;SEQIDNO:36)與天然的酶("對照"；SEQIDNO:6)的活性。當將GLN轉化為GLA時，突變體F168L、T210A和T210C最初被鑒定可能具有明顯改善的腈水解酶活性，但是隨后發現它們與72W腈水解酶對照具有類似的腈水解酶活性。出乎意料地，當將乙醇腈(一種2-羥基腈)轉化為乙醇酸時，US10/919182中所述的兩種突變的腈水解酶(F168K，Phel68—Lys;F168V，Phel68—Val)(在此分別由SEQIDNOs:26和32表示)也顯示明顯改善的腈水解酶活性。然而，當將乙醇腈轉化為乙醇酸時，US10/919182中所述的其他突變的腈水解酶(如T210A,SEQIDNO:34;T210C,SEQIDNO:36)并沒有顯示明顯改善的腈水解酶活性。如本申請實施例所述，易錯PCR和定向飽和誘變用于隨機突變天然的72W腈水解酶編碼序列(SEQIDNO:5)。導致在氨基酸殘基第168位(在野生型序列中為苯丙氨酸)和第201位(在野生型序列中為亮氨酸)的氨基酸取代的突變似乎明顯增加了腈水解酶活性。如本文所使用的，術語"氨基酸殘基位置"指在相對于由N-末端甲硫氨酸殘基起算的參照序列(SEQIDNO:6)的特定位置上所見的氨基酸。進行定向飽和誘變以評估在兩個殘基位置(168和210)上的所有氨基酸取代。鑒定了一些具有明顯改善的將乙醇腈轉化為乙醇酸(如在本發明的反應條件下，以乙醇酸銨鹽的形式存在)的腈水解酶活性的額外的突變體。相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶序列(SEQIDNO:6),本發明突變的腈水解酶包含至少一個氨基酸取代。同樣地，每一個本發明突變的腈水解酶的氨基酸序列具有帶有至少一個如本文所述的氨基酸取代的氨基酸序列SEQIDNO:6(參照序列)。在一個實施方案中，適用于本發明方法的突變的腈水解酶包含編碼具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，所述氨基酸序列帶有至少一個選自以下的氨基酸取代a)在氨基酸殘基第168位用賴氨酸、曱硫氨酸、蘇氨酸或纈氨酸取代；和b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當將乙醇腈轉化為乙醇酸時，所述多肽提供了至少1.5倍的腈水解酶活性改善。在另一個實施方案中，適用于本發明方法的突變的腈水解酶具有選自SEQIDNOs:8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32的氨基酸序列。在又一個實施方案中，適用于本發明方法的突變的腈水解酶具有選自SEQIDNOs:7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29和31的核苷酸序列。在一方面，本發明包括編碼具有腈水解酶活性的多肽的分離的核酸分子，所述多肽具有SEQIDNO:6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代a)在氨基酸殘基第168位用甲硫氨酸或蘇氨酸取代；和b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當在相同的反應條件下將乙醇腈轉化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少1.5倍的腈水解酶活性的增加。在另一方面，本發明包括編碼具有選自SEQIDNOs:8、10、12、14、16、18、20、22、24、28和30的氨基酸序列的多肽的分離的核酸分子。在又一方面，本發明包括具有選自SEQIDNOs:7、9、11、13、15、17、19、21、23、27和29的核酸序列的分離的核酸分子。在一方面，本發明包括具有腈水解酶活性的分離的多肽，所述多肽具有SEQIDNO:6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代a)在氨基酸殘基第168位用甲硫氨酸或蘇氨酸取代；和b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當在相同的反應條件下將乙醇腈轉化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少1.5倍的腈水解酶活性的增加。在另一個實施方案中，本發明包括具有腈水解酶活性的多肽，所述多肽具有選自SEQIDNOs:8、10、12、14、16、18、20、22、24、28和30的氨基酸序列。通過將所測定的活性單位(U)除以催化劑重量計算腈水解酶活性。可根據純化的蛋白質重量、細胞濕量、細胞干重或固定的催化劑(即使用角叉菜膠和/或GA/PEI-交聯的催化劑/藻酸鹽珠子)的重量測定催化劑重量。在本發明中，腈水解酶活性記錄為每克細胞干重的活性單位(U/gDCW)或每克催化劑珠子的活性單位(比較固定的催化劑)。就基于細胞干重作為單位催化劑重量的腈水解酶活性比較，應當考慮腈水解酶蛋白產生的水平。測定不同轉化體及它們各自對照之間的腈水解酶的表達水平，并觀察到是基本上相同的(即當在相同的遺傳背景中比較時)。因此。對于不同的突變體而言，所報道的腈水解酶活性的改善歸因于酶結構上的改變。在相同的載體背景(pTrcHis2-TOPO⑧或pUC19)和宿主大腸桿TOP10(Invitrogen)、大腸桿菌FM5(ATCC53911)或大腸桿菌MG1655(ATCC47076)中表達突變的腈水解酶(以及敏捷食酸菌72W(ATCC55746)腈水解酶對照)的編碼序列。相對的改善是基于與使用相同的載體和宿主背景的適當的對照比較的。SDS-PAGE分析(如使用激光光密度分析定量)證明了在每種突變體(和對照)中腈水解酶蛋白表達水平基本上相同(如由于使用相同的表達系統和宿主所預期的)。相對酶活性被記錄為對不同突變的催化劑所測定的腈水解酶活性相對于在表達^:捷食酸菌72W腈水解酶(SEQIDNO:6)的各自的大腸桿菌對照轉化體中所測定的腈水解酶活性的倍數增加。對于未固定的催化劑，通過測定每克細胞干重在25。C下將乙醇腈轉化為乙醇酸的轉化率OimolGLA/min)，確定突變的腈水解酶的腈水解酶活性(U/g細胞干重)。對于固定的催化劑比較，通過在25。C下測定乙醇腈轉化為乙醇酸的轉化率OmolGLA/mm)來確定活性，并記錄為每克固定的細胞催化劑珠子的腈水解酶活性單位(U/g珠子)。一單位的腈水解酶活性(U)相當于在25。C下每分鐘產生1微摩爾乙醇酸(pmolGLA/min)。對于特定的突變的腈水解酶，使用下列格式之一，關于敏捷食酸菌72W氨基酸序列(SEQIDNO:6)，DNA編碼區中的點取代突變以及所得到的氨基酸改變得到了詳細說明1.擴展格式:提供了SEQIDNO:6中野生型氨基酸(使用標準的3-字母縮寫)和相應的氨基酸殘基位置，之后是在相同的殘基位置處見于突變體中的新氨基酸，例如。"Phel68改變為Lys"或"Phel68—Lys"描述了一種在SEQIDNO:6中氨基酸殘基第168位處作為突變的結果——苯丙氨酸被改變為賴氨酸的突變。2.簡寫形式:野生型氨基酸(表示為標準的單字母縮寫)之后是SEQIDNO:6的氨基酸殘基位置，再后是突變的氨基酸(也表示為標準的單字母縮寫)。例如，"F168K"描述了一種在SEQIDNO:6中氨基酸殘基第168位處作為突變的結果——苯丙氨酸被改變為賴氨酸的突變。使用腈水解酶催化劑將乙醇腈水解為乙醇酸通過將酶催化劑與包含乙醇腈的含水反應混合物接觸進行水解反應。完整的重組微生物細胞(表達本發明的突變的腈水解酶)可用作為酶催化劑而無需任何預處理。微生物細胞催化劑可直接添加到反應混合物中，或使用中空纖維膜柱體或超濾膜保持與主體反應混合物分離。或者，微生物細胞可固定在聚合物基質(如角叉菜膠或聚丙烯酰胺(PAG)顆粒)中或固定在不溶性支持物(如硅藻土)上以便于酶催化劑回收和再生(US6,870,038)。純化或部分純化的酶也可分離自全細胞并直接用作為催化劑，或所述酶可固定在聚合物基質中或固定在不溶性支持物上。固定細胞或分離的酶的方法已得到廣泛地報道并且是本領域技術人員眾所周^口的(MethodsinBiotechnology,Vol.1:ImmobilizationofEnzymesandCells;GordonF.Bickerstaff,編；HumanaPress,Totowa,NJ,USA;1997)。之前已報道了敏捷食酸菌72W腈水解酶催化劑的固定(US6,870,038)。含水反應混合物中酶催化劑的濃度取決于酶催化劑的特定活性，并可選擇以獲得期望的反應速率。在水解反應中用作為催化劑的微生物細胞的細胞濕重通常為0.001g-0.250g濕細胞/mL總反應體積，優選0.002g-0.050g濕細胞/mL。選擇水解反應的溫度以控制反應速率和酶催化劑活性的穩定性。反應溫度可在僅僅高于反應混合物凝固點(大約0。C)至約65°C的范圍內；優選反應溫度在約5。C至約35°C。可通過將細胞懸浮于蒸餾水中，或懸浮于可保持反應初始pH在約5.0和約10.0之間、優選在約5.5和約8.0之間、更優選在約5.5和約7.7之間以及最優選約6.0至約7.7的緩沖水溶液中制備微生物細胞催化劑懸浮液。當反應進行之時，由于由相應的腈官能團形成羧酸銨鹽，可改變反應混合物的pH。所述反應可運行直至完全轉化乙醇腈，無需pH控制，或在整個反應過程中可添加適合的酸或堿以保持期望的pH。發現在25。C下乙醇腈能與所有比例的水完全混溶。在其中選擇反應條件使得水相中底物(即a-羥基腈)的溶解性也取決于溶液溫度和/或鹽濃度(緩沖液或產物乙醇酸銨鹽，也稱為乙醇酸銨)情況下，反應混合物起初可由兩相組成含有酶催化劑和溶解的a-羥基腈的水相以及有機相(不溶解的a-羥基腈)。當反應進行時，a-鞋基腈溶解于水相中，并最終獲得單相產物混合物。還可通過以大約等于酶促水解反應速率的速率添加a-羥基腈到反應混合物中運行反應，由此保持單相含水反應混合物，并避免在高的起始物料濃度下，潛在的酶底物抑制的問題。的pH)^混:物存在于產物:^物中〈并可額外:也作為羧酸鹽與任何能額外地存在于產物混合物中的緩沖液存在于產物混合物中。視所需，乙醇酸產物可作為質子化的羧酸或羧酸鹽分離自反應混合物。在乙醇腈完全轉化下，產物混合物中的乙醇酸的終濃度可在0.001M至乙醇酸產物的溶解度極限。在一個實施方案中，乙醇酸的濃度會約0.10M至約9.0M。在另一個實施方案中，乙醇酸的濃度在約0.2M至約4.0M。通過用諸如的濃鹽酸或濃硫酸的適合的無機酸調節反應混合物的pH為約1.0至約3.0,并用適合的有機溶劑萃取乙醇酸，可從產物混合物(在除去催化劑后)中分離乙醇酸。在一個實施方案中，所述適合的有機溶劑是Alamine⑧336(—種三烷基叔胺，其中烷基長度為C8-C10;CognisCorp.,Cincinnati,OH)與一種或多種稀釋劑的混合物，所述稀釋劑選自甲基異丁基酮、l-辛醇、l-癸醇、曱苯、二曱苯(混合的)、煤油、曱基叔丁基醚和二氯甲烷(見共同未決的US臨時專利申請60/638128;在此并入作為參考)。可利用水從有機溶劑中反萃取乙醇酸。在一個實施方案中，用氯化鈉飽和有機溶劑，并將有機溶劑與適合的干燥劑(如硫酸鎂)接觸，過濾并除去溶劑(如通過旋轉蒸發)以高產率和高純度(通常98-99%純)產生期望的產物。視所需，可通過重結晶或蒸餾進一步純化產物。在另一個實施方案中，可利用直接脫氨和/或其他純化方法從乙醇酸銨中直接分離乙醇酸，所述其他純化方法包括但不限于濃縮、結晶、反應性溶劑萃取、離子交換、電滲析、糖醇解、聚合、蒸餾、熱分解(鹽裂化)、醇解以及它們的組合(見共同未決的US臨時專利申請60/638148和60/638126;每一申請全文在此并入作為參考)。微生物表達可在異源宿主細胞中，優選在微生物宿主中產生本發明的腈水解酶突變體。在本發明中特別有用的是易于適應大規模發酵法的細胞。這樣的生物體是工業生物工藝領域眾所周知的，其例子可見RecombinantMicrobesforIndustrialandAgriculturalApplications.Murooka等，編，MarcelDekker,Inc.,NewYork,NY(1994),并包括發酵細菌以及酵母和絲狀真菌。宿主細胞可包括但不限于叢毛單胞菌(Com"momw^.)、#奉狀4干菌(Cor少we6(3c/^n'wm、頭豆4干菌<s/.)、鄉工5求菌(A/zotfococc2^平)、固氮菌(y^oto6a"er平)、軒樣酸軒菌(C"to6(2c妙)、腸牙干菌(五"&ro6""ers/7.)、梭狀芽孑包#干菌(C/oWn.c/z.i/ms/.)、克雷白氏4干菌(^T/eZw'e〃a沙門氏菌(5"a/mo"e〃as/7.)、孝L酸4干菌(Z^"o6""'〃t/s5/.)、曲霉(j，rg/〃ws平)、糖酵母(iS^cc/z"r麵yces".)、接合酵母(Zygos"cc/zar麵yc"、畢赤酵母(尸z'c/n."取)、克魯維酵母(^T/wyv"ero，cess/.)、假絲酵母(QmA(ias/.)、漢森氏酵母(^mse肌/a5/.)、杜氏藻(Dw""/z.e〃a平)、德巴利氏酵母(Z)e6"謹yce"/.)、毛霉菌(Mwcor)、3求4以酵母(7brw/o/w7's曱基4干菌(A^//z_y/o6<2"en.a)、芽孢桿菌(5a"〃ws、埃希氏桿菌(￡^c/^nc/zz<2、布支單胞菌(尸sewt/owo/7oww.)、才艮瘤菌(i/^'zo^wws/.)和《連審菌(5V^p/ww少ces特別優選的是大腸桿菌。其中突變的腈水解酶基因可被表達的適合的大腸桿菌宿主細胞的例子包括，但不限于在此列舉的宿主細胞以及MG1655(ATCC47076)、FM5(ATCC53911)、W3110(ATCC27325)、MC4100(ATCC35695)、W1485(ATCC12435)及它們的衍生物。在另一方面，優選的大腸桿菌宿主菌才朱是MG1655(ATCC47076)或FM5(ATCC53911)。先前已報道了敏捷食酸菌72W腈水解酶的異源表達(Chauhan等,同上和US6,870,038)。Chauhan等報道了一種表達活性敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQIDNO:38)的大腸桿菌菌抹(大腸桿菌SS1001(ATCCPTA-1177))。與野生型72W腈水解酶序列(SEQIDNOs:5和6)相比，該重組表達的(大腸桿菌SS1001)腈水解酶的編碼序列含有2個小的序列改變。起始密碼子由GTG改變為ATG以利于重組表達，并且在克隆過程中導入引起鄰近C-末端的單個氨基酸改變的人工序列(Pro367[CCA卜Ser[TCA])。在工業上適合的宿主中進行重組表達具有幾個優點。首先，與由大多數獲得目的基因的微生物可得到的遺傳工具相比，對于大多數常用的生產宿主，其遺傳工具箱通常得到充分的開發。與在天然宿主中表達相比，在這些宿主中重組表達一般更具成本效率。例如，業已顯示當通過發酵培養時，敏捷食酸菌72W細胞得在甘油——一種相當昂貴的碳底物上生長，而使用便宜的葡萄糖卻無法成功地生長。與此相反，與敏捷食酸菌72W細胞相比，在約一半時間內，大腸桿菌轉化體就可在葡萄糖上生長至相同的細胞密度，明顯地降低了生物催化劑生產成本(US6,870,038)。含有指導高水平外源蛋白表達的調節序列的微生物表達系統和表達載體是本領域技術人員眾所周知的。這些可用于構建用來生產本發明突變的腈水解酶的基因產物的嵌合基因。然后，通過轉化可將這些嵌合基因導入適當的微生物中，以提供高水平的突變的腈水解酶表達。本發明的核酸分子被用來產生具有相對于天然的敏捷食酸菌72W腈水解酶增加的或改變的腈水解酶活性水平的基因產物。在一方面，本發明突變的基因所編碼的多肽提供了至少1.5倍的將乙醇腈轉化為乙醇酸的腈水解酶活性的改善(與SEQIDNO:6所示的敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性相比)。在改變宿主細胞的特性上嵌合基因應當是有效的。例如，在適當的啟動子控制下，將至少一個編碼本發明的腈水解酶的嵌合基因拷貝導入宿主細胞，賦予了該宿主細胞改善的將乙醇腈轉化為乙醇酸的能力。本發明的嵌合基因應包含適合的用于驅動本發明突變的腈水解酶序列基因表達的調節序列。調節序列可包括，但不限于啟動子、翻譯前導序列和核糖體結合位點。如果這些序列來源于宿主生物體，則是優選的；然而，本領域技術人員應認識到也可以使用異源調節序列。通過將嵌合基因克隆入適合的表達載體中，其可被導入適當的宿主中。用于轉化適合的宿主細胞的載體或表達盒是本領域眾所周知的。一般來說，所述載體或表達盒含有指導有關基因轉錄和翻譯的序列、可選擇的標記以及容許自主復制或染色體整合的序列。適合的載體包含具有轉錄起始控制的編碼序列的5'區和控制轉錄終止的DNA片段的3'區。盡管這樣的控制區無需來源于選擇作為生產宿主的特定物種自身的基因，但是當這兩個控制區都來源于與宿主細胞同源的基因時，則是最優選的。在一個實施方案中，所述調節序列應包括啟動子。啟動子可以是組成型或誘導型的。誘導型啟動子一般響應于特定的刺激(如IPTG或乳糖誘導的/"c啟動子)。誘導型啟動子可以響應于多種刺激，包括化學藥品、生長周期、溫度改變、pH改變和摩爾滲透壓濃度改變，不——例舉。用于在期望的宿主細胞中驅動本發明突變的腈水解酶表達的起始控制區或啟動子為數眾多，且為本領域技術人員所熟悉，包括但不限于<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>(用于在糖酵母屬中表達)；JOW(用于在畢赤酵母中表達)；以及<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>和"c(用于在大腸桿菌中表達)。特別適用于在大腸桿菌中驅動表達的啟動子的額外的例子包括，但不限于大腸桿菌的色氨酸操縱子啟動子尸"/、大腸桿菌的乳糖操縱子啟動子尸/"c、大腸桿菌的尸f"c啟動子、X噬菌體右翼啟動子i^、X噬菌體左翼啟動子尸b77啟動子以及來自甲醇酵母(尸zc/z^;^Ww^)的04尸基因，或是至少一種分離自微生物組的啟動子，所述微生物選自由叢毛單胞菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬、固氮菌屬、檸檬酸細菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷白氏桿菌屬、沙門氏菌屬、乳酸桿菌屬、曲霉屬、糖酵母屬、畢赤酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢森氏酵母屬、杜氏藻屬、德巴利酵母屬、毛霉菌屬、球擬酵母屬、曱基桿菌屬、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬和鏈霉菌屬組成的組。終止控制區還可來源于不同的基因，優選宿主自身的基因。任選地，終止位點可以是不必需的；然而，如果包括的話，則是最優選的。此外，所插入的遺傳物質可包括核糖體結合位點。所述核糖體結合位點可來自x噬菌體cn基因或選自從毛單胞菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬、固氮菌屬、檸檬酸細菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷白氏桿菌屬、沙門氏菌屬、乳酸桿菌屬、曲霉屬、糖酵母屬、畢赤酵母屬、接合酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢森氏酵母屬、杜氏藻屬、德巴利酵母屬、毛霉菌屬、球擬酵母屬、曱基桿菌屬、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬和鏈霉菌屬基因的核糖體結合位點。任選地，所述基因產物可優選為轉化的宿主的分泌產物。期望的蛋白分泌到生長培養基中簡化了純化步驟并降低了成本。分泌信號序列通常用于促進可表達的蛋白主動轉運通過細胞膜。可通過將編碼分泌信號的DNA序列摻入宿主中創建能分泌的轉化宿主。用于選擇適當的信號序列的方法是本領域眾所周知的(見例如EP546049;WO9324631)。所述分泌信號DNA可位于表達控制DNA和本發明的編碼序列或編碼序列片段之間，以及位于帶有后者的讀框中。蛋白質工程通過誘變生產本發明突變的腈水解酶。預期本發明的核苷酸可用于生產具有進一步增強的或改變的活性的基因產物。用于突變天然基因序列以產生具有改變的或增強的活性的基因產物的多種方法是^^知的，包括但不限于1)隨機誘變，2)結構域交換(使用鋅指結構域或限制性內切酶)，3)易錯PCR(Melnikov等，A^c/e/cW"ewc/z,27(4):1056-1062(1999));4)位點定向誘變(Coombs等，(1998),pp259-311,1plate.Angeletti,RuthHogue，編，Academic:SanDiego,CA);和5)"基因改組"(US5,605,793;US5,811,238;US5,830,721;和US5,837,458，在此并入作為參考)。通過錯誤摻入核苷酸，聚合酶鏈式反應(PCR)可用于擴增帶有伴隨多個突變產生的DNA片段。這可通過改變PCR條件例如改變dNTPs比率或在反應中添加不同凄史量的氯化錳而得以實現(Fromant等，傷(9c/z謹,224(1):347-53(1995);Lin國Goerke等，S她c—腦,23(3):409-12(1997))。然后，可克隆突變的DNA片段庫以產生突變質粒文庫，在諸如大腸桿菌的宿主中表達后，接著可對所述文庫進行篩選。由于基因改組的方法容易實施且誘變率高并易于篩選，因此其是特別具有吸引力的。基因改組的方法包括在具有與目的基因相似性和/或差異的額外幾群DNA區存在下，用限制性內切核酸酶將目的基因切割為特定大小的片段。然后，該片段庫應變性并重退火以產生突變的基因。接著篩選改變活性的所述突變的基因。可通過該方法突變本發明的微生物序列，并篩選改變或增強的活性。該序列應當是雙鏈的且可以具有從50bp到10kB不同的長度。使用本領域眾所周知的限制性內切核酸酶，該序列可以被隨機消化為約10bp到1000bp的片段(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual-第2版，ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,NY(1989);在下文中"Maniatis，，)。除本發明的微生物序列之外，可以添加與微生物序列全部或部分能雜交的片段群。同樣地，也可以添加不能與本發明序列雜交的片段群。一般來說，與總的核酸相比，這些附加的片段群以約10至約20倍過量添加。一般地，如果執行該方法，則混合物中不同的特定核酸片段的數目會在約100至約1000。對混合的隨機核酸片段群變性以形成單鏈酸片段，然后重退火。只有那些具有與其他單鏈核酸片段同源的區域的單鏈核酸片段會重退火。可通過加熱變性隨機核酸片段。本領域技術人員能確定完全變性雙鏈核酸所必需的條件。優選溫度為約80°C-100°C。可通過冷區重退火核酸片段。優選溫度為約20°C至約75°C。可通過添加聚乙二醇("PEG")或鹽加速復性。適合的鹽濃度可在0mM至約200mM。然后在核酸聚合酶和dNTPs(即dATP、dCTP、dGTP和dTTP)存在下溫育退火的核酸片段。所述核酸聚合酶可以是Klenow片段、Taq聚合酶或任何其他本領域/>知的DNA聚合酶。可在退火先前、退火同時或退火后，添加所述聚合酶到隨機核酸片段。在聚合酶存在下，變性、復性和溫育循環重復期望的次數。優選所述循環重復約2至約50次，更優選所述次序重復10至約40次。所得到的核酸是一種約50bp至約100kB的較大的雙鏈多核苷酸，且通過標準的克隆和表達實驗設計，對于表達和改變的活性可進行篩選(Maniatis,同上)。此外，可通過使用基因改組(外顯子改組)方法融合功能域裝配雜合蛋白質(Nixon等，94:1069-1073(1997》。本發明基因的功能域可與其他基因的功能域相結合以產生具有期望催化功能的新酶。可使用PCR重疊延伸方法構建雜合酶并使用本領域技術人員眾所周知的技術將其克隆入不同的表達載體中。當將乙醇腈轉化為乙醇酸時，穩定劑改善了腈水解酶穩定性和生產率可通過讓曱醛與氰化氫反應合成乙醇腈(US2,175,805,US2,890,238,US5,187,301和共同未決的US臨時專利申請60/638127)。取決于反應物的純度和用于制備乙醇腈的反應條件，多種雜質可存在于最終產物中。這些雜質能干擾乙醇腈轉化為乙醇酸的效率。在一個實施方案中，在進行酶促轉化為乙醇酸之前，可處理乙醇腈水溶液以除去不需要的雜質。另一種增加酶催化劑穩定性/生產率的方法是添加一種或多種會與乙醇腈溶液中不需要的化合物反應的化合物，所述不需要的化合物可干擾催化劑穩定性和/或生產率。不需要的化合物包括，但不限于曱醛、曱醛衍生的雜質、甲醛衍生的低聚物以及聚合物、2-羥乙酰胺、2-羥乙酰胺衍生的雜質、氰化氫衍生的雜質、氰化氫衍生的低聚物和聚合物、乙醇腈衍生的雜質、乙醇腈衍生的低聚物和聚合物、乙交酯、線型乙醇酸低聚物以及可能的氧(反應在改善催化劑穩定性的基本上無氧的條件下進行)。不需要的化合物還可包括那些1)與腈水解酶催化劑反應并失活其的，2)在反應中與乙醇腈竟爭的，3)與乙醇腈或乙醇酸反應以形成不需要的副產物的，或4)對重組宿主細胞產生不利影響的(即促進細胞溶解)。能添加到乙醇腈反應混合物中的適合的化合物的例子可包括，但不限于硫代硫酸鹽(如硫代硫酸鉀，K2S203),連二亞硫酸鹽(如連二亞硫酸鈉，Na2S204)以及氰化物(如HCN、NaCN、KCN等)。在一個實施方案中，所述化合物在酶催化劑添加之前、過程中或之后添加到乙醇腈反應混合物中。在另一個實施方案中，添加所述化合物到反應混合物中使得在反應混合物中的終濃度為至少約0.001M至小于約5wt。/。的反應混合物。在另一個實施方案中，添加所述化合物到反應混合物中使得終濃度為至少約0.01M。在還一個實施方案中，添加所述化合物到反應混合物中使得化合物的終濃度為約0.01M至約1M。在本發明的另一方面，在基本上無氧的條件下進行本發明方法。如本文所使用的，術語"無氧的條件"、"無氧的氣氛"和"基本上無氧的條件"指其中不起反應的氣體例如氮氣被用于清洗和/或覆蓋反應釜使得分子氧(02)不存在于本發明方法過程中的反應條件。本領域技術人員應承認在基本上無氧的條件下可存在痕量的分子氧。在一方面，術語"基本上無氧的"表示其中分子氧濃度低于約5%,優選低于2%,更優選低于1%以及最優選低于O.l%的反應釜中氣體的反應條件。在另一方面，本發明方法在基本上無氧的條件下進行，其中氮氣(N》用于覆蓋反應釜中含水反應混合物。控制乙醇腈濃度以改善催化劑穩定性和生產率另一種增加腈水解酶穩定性的方法是控制含水反應混合物中乙醇腈的最大濃度。如前所述，乙醇腈在極性溶劑中離解以釋放甲醛和氰化氫。反應混合物中的曱醛可與酶催化劑反應，導致過早的失活并降低了催化劑生產率。控制溶液中乙醇腈的濃度能增加催化劑穩定性和催化劑生產率(每克催化劑產生的乙醇酸克數)。如實施例12-"(表9)所示，在含有3M乙醇腈的反應中，僅3次循環反應后來源于敏捷食酸菌72W的腈水解酶催化劑就迅速喪失其活性，濃度降至1M和/或以1M增量逐步添加3M乙醇腈(在之前添加的乙醇腈已轉化為乙醇酸銨之后添加)明顯增加了催化劑生產率(表9)。在一個實施方案中，逐步添加(等分物)乙醇腈到含水反應混合物中增加了催化劑生產率。在另一個實施方案中，以逐步方式添加乙醇腈到含水反應混合物中，使得反應過程中乙醇腈的總濃度保持在約1M或更低。如實施例15所示，在幾次再循環反應后連續添加乙醇腈也增加了催化劑生產率。在一個實施方案中，由乙醇腈產生乙醇酸銨的方法使用了連續添加乙醇腈。在另一個實施方案中，乙醇腈添加的速率為至少5倍的催化劑Km。本發明的催化劑通常具有約1mM(野生型敏捷食酸菌72W;SEQIDNO:6)至約2.7mM的對乙醇腈的Km。如本領域已知的，約5倍Km值的底物濃度(即5X2.7mM=13.5mM)產生約97%的最大反應速率(Vmax)的反應速率。在又一個實施方案中，控制乙醇腈進料速度以保持反應混合物中乙醇腈濃度為約5mM至約1M,優選約100mM至約1M,更優選約100mM至約500mM。控制PH利用本發明的腈水解酶催化劑的反應通常在約5至約10,優選5.5至約8,更優選約5.5至約7.7以及最優選約6至約7.7的pH下運行。乙醇酸和乙醇腈的分析適合于分析乙醇酸產生的分析法是本領域眾所周知的，包括但不限于HPLC、CE、GC和MS。例如，HPLC分析用于測定乙醇酸產生量，使用了折光率4全測器和Bio-RadHPX-87H柱(30cmx7.8mm直徑)以及在50°C下以1.0mL/min(等度洗脫)的0.01N硫酸作為流動相。HPLC方法適合于定量底物(乙醇腈)和產物(乙醇酸)。微生物催化劑的工業生產在期望使用本發明突變的腈水解酶基因工業生產本發明的腈水解酶的情況下，可使用多種培養方法。發酵可以分批、補料分批或連續方式進4亍，方法是本4頁域眾所周知的(ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology:第2版(1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA,(1989);Deshpande,MukundV.,J///.5zoc/^w.所o&c/mo/.36(3):227-234(1992))。經典的分批培養方法是一種封閉系統，其中培養基組合物在培養開始時就設定好的，在培養過程中不進行人工改變。因此，在培養過程開始時，就將期望的生物體接種培養基，并且在不添加任何物質到該系統中的情況下，讓其生長或進行代謝活動。然而，一般來說，"分批"培養是針對碳源的添加而言的分批，并且通常試圖控制諸如pH和氧濃度的因素。在分批系統中，該系統的代謝物和生物量組成穩定地改變著，直到培養結束。在分批培養中，細胞通過靜止停滯期到高速生長對數期并最終到達穩定期，其中在穩定期生長速度降低或停止。如果不進行處理。處在靜止期的細胞最終會死亡。對數期的細胞通常決定最終產物或在某些系統中的中間產物的產量。靜止期或指數期后生產可以在其他系統中獲得。標準分批系統的變化形式是補料分批系統。補料分批培養方法同樣適用于本發明，并且包括典型的分批系統，所不同的是，隨著培養的進行，以增量形式添加底物。當降解物阻遏傾向于抑制細胞的代謝以及當培養基中需要具有有限量的底物時，可以使用補料分批系統。要測定補料分批系統的實際底物濃度是困難的，因此，根據可測定因素如pH，溶解氧，以及諸如C02的廢氣的分壓的變化進行估算。分批和補料分批培養方法是常用的并且為本領域眾所周知，其例子可見于Brock(同上)和Deshpande(同上)。本發明腈水解酶催化劑的工業生產還可以通過連續培養來實現。連續培養是一種開放系統，其中將規定的培養基連續地添加到生物反應器中，并同時將等量的條件培養基取出進行加工。連續培養通常將細胞保持在恒定的高液相密度下，其中細胞主要是在對數期生長。或者，可用固定的細胞進行連續培養，其中連續添加碳和養分以及不斷地從細胞團塊中將有價值的產物、副產物或廢棄產物取出。可使用多種由天然和/或合成材料組成的支持物進行細胞固定。連續或半連續培養可以調節能夠影響細胞生長或最終產物濃度的一種因素或任意數目的因素。例如，一種方法能保持限制養分，例如讓碳源或氮含量處在固定比例上，并且允許所有其他參數處在適當水平上。在其他系統中，可以連續地改變影響生長的多種因素，同時保持通過培養基濁度測量的細胞濃度恒定。連續系統試圖保持穩態生長條件，因此，通過取出培養基所導致的細胞減少，必須與培養物中的細胞生長速度平衡。調節連續培養方法的養分和生長因子的方法，以及用于使產物形成速度最大化的方法在工業微生物學領域中是眾所周知的，并且由Brock(同上)詳細披露了多種方法。本發明的發酵培養基必須含有適合的碳底物。適合的碳底物可包括，但不限于諸如葡萄糖和果糖的單糖、諸如乳糖或蔗糖的二糖、諸如淀粉或纖維素或它們的混合物的多糖、以及來自諸如千酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖漿和大麥芽的可再生原料的未純化的混合物。因此，預計用于本發明的碳源可包括多種含碳底物，僅受受限于所選擇的生物體。從乙醇酸銨回收乙醇酸的方法從相應的銨鹽回收和/或獲得有機酸的方法是本領域已知的。從包含乙醇酸銨的水溶液回收和/或獲得乙醇酸的方法可包括，但不限于離子交換(陰離子和/或陽離子交換)、電滲析、反應性溶劑萃取、熱分解、醇解(酯化后將乙醇酸酯水解為乙醇酸)以及它們的組合。庠fit炎(7^離fx換,陽離子交換是一種可逆過程，其中溶解的離子物種以化學計量的方式為支持物所吸收。陽離子交換是本領域眾所周知的。在本發明方法中，將乙醇酸銨注入陽離子交換樹脂中，其中銨離子與質子交換，形成乙醇酸(見實施例28)。乙醇酸穿過柱子并得到收集。一旦樹脂為銨離子所飽和，就用酸例如硫酸再生，會產生副產物硫酸銨鹽。使用模擬移動床或圓盤傳送帶(carrousel),可分批進行陽離子交換(見Perry'sChemicalEngineers'Handbook—第7版，Perry,RobertH.,Green,DowW.和Maloney,JamesO,,編；McGrawHillCompanies,Inc.,NewYork,NY,1997;在下文中稱為"Perry's")。樹脂的選擇可影響進料濃度，其可為約0.02wt。/o鹽至約50wt。/。乙醇酸銨，優選約0.02wt。/。至約40wt%。通常所用的再生酸為約0.5wt%至約20wt%。,子it炎f厲庠fit換」陰離子交換也是本領域眾所周知的。除使用弱陰離子交換樹脂之外，陰離子交換類似于陽離子交換(見Perry's,同上)。樹脂的選擇能影響再次進料濃度，其可為約0.02wt。/。至約卯wt。/。乙醇酸銨，優選約0.02wtn/。至約40wt。/。。通常應使用弱酸進行樹脂再生。遂森萃WX^鉤一種已用于分離羧酸的方法是反應性萃取。已報道該方法能用于從乳酸銨中萃取乳酸(Wasewar等，J.Ao&c/mo/.,97:59-68(2002))。反應性萃取包括使用反應性有機溶劑(即胺)絡合水相中的酸。該過程中的第一步通常包括酸化含有期望的酸的鹽的水溶液。然后，將酸化的水溶液與通常包含反應性叔胺和一種或多種稀釋劑的有機溶劑接觸。反應性胺(通常為C8-C10三烷基叔胺例如Alamine336,CognisCorp,Cincinnati,OH)與羧酸反應形成優先溶于有機相中的酸/胺絡合物(Tamada等，/^/.C/^w.29:1319-1326(1990);Tamada等，/"dC/zem.i^s.29:1327-1333(1990))。與使用常規的溶劑萃取所能獲得的結果相比,使用叔烷基胺通常提供了更高的分配系數。然后，使用反萃取從有機相中回收酸。Inci,I.(C/^w.16(2):81-85(2002);Inci,I.和Uslu,H.,J.C/ze附.Z)ato，50:536-540(2005))報道了使用反應性胺溶劑萃取乙醇酸。然而，這些試驗報道的是溶解于純水中的純乙醇酸的萃取系數。Inci沒有舉例說明或教導一種由復雜的含水基質(如包含大量天然鹽和其他雜質的乙醇酸水溶液)例如濃縮的乙醇酸銨水溶液獲得乙醇酸的方法。反應性溶劑萃取還可用于由乙醇酸銨水溶液獲得乙醇酸(見共同未決的US臨時專利申請60/638128;在此并入作為參考)。更具體地說，提供了一種由包含乙醇酸銨的水溶液分離乙醇酸的方法，包括a)提供第一相，其中所述第一相是水不混溶的有機溶劑混合物，包含i)約30體積百分比至約99體積百分比的所述第一相是至少一種具有以下分子式的叔烷基胺<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>其中RbR2和R3獨立地是C8-C12烷基；和ii)約1體積百分比至約70體積百分比的所述第一相是至少一種選自以下的稀釋劑曱基異丁基酮、l-辛醇、l-癸醇、二氯甲烷、1-氯丁烷、氯苯、氯仿，煤油、曱苯、混合二曱苯、磷酸三丁酯和它們的混合物；b)提供第二相，其中所述第二相是具有約3或更低的pH的包含乙醇酸的水溶液；所述第二相通過以下步驟形成i)提供乙醇酸銨水溶液；所述乙醇酸銨水溶液具有約5重量％至約40重量％乙醇酸銨的濃度；和ii)添加足以降低(b)(i)的乙醇酸銨水溶液的pH至約3或更低的量的無才幾酸；由此形成包含乙醇酸的水溶液；c)在反應性萃取處理中將所述第一相與所述第二相接觸；由此形成負荷了乙醇酸的第一相；d)分離所述負荷了乙醇酸的第一相；e)在反萃取處理中將所述負荷了乙醇酸的第一相與第三相接觸，由此負荷了乙醇酸的第一相中的乙醇酸被萃取到所述第三相中，其中所述第三相是不混溶于所述負荷了乙醇酸的第一相中的水溶液；和f)由所述第三相回收乙醇酸。在一個實施方案中，所述三烷基叔胺選自三正辛胺、三異辛胺、三正壬胺、三正癸胺和三-正十二烷胺。在另一個實施方案中，所述三烷基叔胺選自Alamine308(CAS#2757-28-0)、Alamine300(CAS#1116-76-3)、Alamine304-1(CAS#102-87-4)和Alamine336(CAS#68814-95-9)(CognisCorp.,Cincinnati,OH)。在另一個實施方案中，所述稀釋劑選自曱基異丁基酮(MIBK)、煤油、甲苯、混合二甲苯、l-辛醇和它們的混合物。在又一個實施方案中，水不混溶的有機溶劑選自90%(v/v)Alamine336:10%(v/v)MIBK;90%Alamine336:10%1-辛醇；90%Alamine336:10%甲苯和90%Alamine336:10%混合二曱苯。第一相中三烷基叔胺的濃度可為約30%(v/v)至約99%(v/v),優選約50%(v/v)至約90%(v/v)以及最優選約70%(v/v)至約90%(v/v)。第一相中稀釋劑的量可為約1。/0(v/v)至約70%(v/v)，優選約10%至約50%以及最優選約10至約30%。適合用于萃取乙醇酸的有機溶劑萃取混合物包含Alamine336與一種或多種稀釋劑的混合物，所述稀釋劑選自甲基異丁基酮(MIBK)、l-辛醇、l-癸醇、二氯甲烷、l-氯丁烷、氯苯、氯仿、煤油、曱苯、混合二甲苯和磷酸三丁酯。在一個實施方案中，所述有機相萃取劑包含Alamine336和一種或多種稀釋劑，所述稀釋劑選自MIBK、l-辛醇、甲苯、二曱苯和煤油。在另一個實施方案中，所述反應性有機溶劑包含約50%至約95%Alamine336，優選占有機溶劑混合物的約65%至約95%。有機溶劑包含約50%至約5%稀釋劑的一種或多種稀釋劑，優選占有機溶劑混合物的35%至約5%。在一個實施方案中，所述混合的有機溶劑包含約70%Alamine336、約10%MIBK和約20%煤油。在另一個實施方案中，所述混合的有機溶劑包含約90%Alamine336和約10%稀釋劑，所述稀釋劑選自MIBK、l-辛醇、曱苯和二曱苯。本領域技術人員能去頂有機相萃取的優選溫度。在一個實施方案中，萃取反應在約10°C至約90。C，更優選約20。C至約75。C以及最優選約25。C至約75。C的溫度下進行。從酸化的水相中萃取乙醇酸所需要的混合的有機溶劑的量取決于溶劑負荷度。取決于水相中存在的乙醇酸的量，本領域技術人員能調節用于萃取乙醇酸的混合的有機溶劑的體積。可通過反萃取從有機相中回收乙醇酸。另一種由乙醇酸銨獲得乙醇的方法是在酯化劑存在下的熱分解。溶劑可通過保護乙醇酸不與反應性氨反應(由此阻止酰胺形成)起作用，或可作為有機反應性萃取溶劑，由此幫助酸分離(Meng等，US2004/0210087;其全文在此并入作為參考)。任選地，該方法還可包括醇，由此生成酯(其可更多地溶于有機溶劑中)。有機溶劑可選自三烷基叔胺、醇、酰胺、醚、酮、磷酯、氧化膦、硫化膦、烷醚以及它們的組合。然后，在反萃取步驟過程中，從有機溶劑中回收乙醇酸(或相應的酯)。回收的溶劑可再循環到鹽裂化反應步驟中。不幸的是，溶劑萃取/反萃取可能有問題，如多種不混溶液體形成難以分離的復雜的物理狀態混合物。寧賴，乙醇酸銨可與醇反應形成相應的乙醇酸酯。通過酯4定水解，乙醇酸酯可轉化為乙醇酸和相應的醇。可以化學或酶學方法(即利用酯酶、蛋白酶等)完成水解。水解羧酸酯的方法是本領域眾所周知的(見Gurthrie,J.和Cullimore,P.,丄C/ew.,58(13):1281-1294和US2004/0138409Al，在此并入作為參考)。例如，Cockrem(US6,291，708Bl)教導了快速加熱有才幾酸銨鹽與醇的混合物以產生包含酸、酯以及未反應的銨鹽的液流。有機酸和/或酯可隨后從液體產物流中分離。或者，共同未決的US臨時專利申請US60/638126提供了一種從包含乙醇酸銨的水溶液獲得乙醇酸的方法，包括(a)提供(i)包含乙醇酸銨的水溶液；和(ii)加熱的包含具有以下分子式的醇的醇蒸汽原料流R2-OH其中R2是C1-C4直鏈或支鏈烷基；和(iii)反應奮；(b)在所述反應釜中將所述包含乙醇酸銨的水溶液與所述加熱的醇蒸汽原料流接觸，由此產生包含乙醇酸酯的第一蒸汽產物流；和(c)從所述第一蒸汽產物流回收乙醇酸酯。通過酯^:水解，乙醇酸酯可轉化為乙醇酸和相應的醇。可以化學或酶學方法(即利用酯酶、蛋白酶等)完成水解。水解羧酸酯的方法是本領i或眾所周知的(見Gurthrie,J.和Cullimore,P.,O"J.C/zew.,58(13):1281曙1294和US2004/0138409Al,在此并入作為參考)。在一個實施方案中，所述醇選自曱醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇和叔丁醇。在一個優選的實施方案中，所述醇是甲醇。相對于含水原料流中羧酸銨鹽的量，與羧酸銨鹽接觸的加熱的醇蒸汽的量通常是摩爾過量的。加熱的醇蒸汽與羧酸銨鹽的摩爾比率可以改變，但通常為約5至約300摩爾/摩爾羧酸銨鹽(摩爾比率至少約5:1至約300'.1),優選約5至約200摩爾/摩爾羧酸銨鹽，最優選約20至約100摩爾/摩爾羧酸銨鹽。摩爾過量的醇蒸汽傾向于以至酰胺形成。醇蒸汽原料流(如甲醇)溫度一般選擇能確保醇通常留在其蒸汽相中的溫度，使得醇蒸汽作為酯化劑和解吸氣/載氣。根據所選擇的醇以及具體的裝置幾何形狀，進入反應室的加熱的醇蒸汽原料流的溫度可改變。加熱的醇蒸汽進料作為反應的加熱源、酯化劑以及本發明方法所產生的羧酸酯的解吸氣/載氣。本發明的實施例舉例說明了利用加熱的甲醇蒸汽來形成乙醇酸甲酯(其隨后水解為乙醇酸)。一般來說，加熱的曱醇蒸汽的溫度為約140°至約350。C。在一個實施方案中，甲醇蒸汽原料流的溫度為約170。C至約300。C。在另一個實施方案中，甲醇蒸汽原料流的溫度為約230。C至約250。C。醇解反應器常用的操作溫度為約140°c至約300。c，優選約no°C至約200。C。在一方面，所述羧酸銨鹽為乙醇酸銨，醇為曱醇。利用了該特定組合的反應器溫度通常為約100。C至約300。C，優選約150°C至約250。C，更優選約170°C至約225°C以及最優選約170°C至約200。C。反應器可任選地包括填充物或高沸點流體/液體以改善期望的羧酸酯的產率。填充或高沸點流體的好處能改善鹽水溶液和醇蒸汽之間的接觸。填充可以是無規則填充、工程化填充(engineeredpacking)或不同的蒸餾塔板設計。見Perry's第7版第M."-l4.61節(Terry'sChemicalEngineers'Handbook,第7版.，Perry,RobertH.,Green,DowW.,和Maloney,JamesO.,編；McGrawHillCompanies,Inc.,NewYork,NY,1997)。氣液反應系統的工業化設計圖解于Perry's圖23-25、23-26和13.79中。在選定操作條件或容易與所回收的酯分離情況下，應當選擇具有低蒸汽壓力的高沸點流體。流體可以是對酯化化學反應惰性的(例如礦物油)或可能參與酯化化學反應的，例如聚亞烷基二醇(多元醇)。多元醇是一種分子量大于150并具有至少一個羥基的物質，包括醇類例如癸醇和十二烷醇。常用的多元醇包括聚乙烯醚二醇(PEG)、聚丙烯醚二醇(PPG)和聚四亞曱基醚乙二醇(PTMEG)以及這些聚烷撐醚二醇的共聚物。已提議使用雙極性膜電滲析(EDBM)從相應的銨鹽回收有機酸。為了讓EDBM運行，溶液應當是導電的。對于弱酸的銨鹽，EDBM的產物(有機酸和氫氧化銨)是非常弱的導體，造成了溶液高電阻并降低生產率。為彌補其，添加導電鹽(即氯化銨)到堿回路(baseloop)中(氫氧化銨流)。當堿濃度增加時，氨就從溶液中解吸，而銨鹽則再循環以保持電導率。應仔細監測有機酸銨鹽的成分——諸如鉤的多價陽離子。這些陽離子通過與羥基締合能沉淀下來并破壞膜。多價陽離子的濃度為優選低于約5ppm,最優選低于約1ppm。例如，可建立具有適用于銨鹽的膜的通常的實驗室規模EDBM系統。首先，建立含有約5wt。/。氯化銨的再循環^喊回路。還建立了大約3M乙醇酸銨的再循環回路。通常的分批試驗運行是在約0.5至約1.0kA/m2的恒電流下進行的。保持循環回路約1小時至約5小時。當EDBM進行時，乙醇酸銨回路中的電導率和pH降低了。一般來說，EDBM在應預期將至少約80%的乙醇酸銨轉化為乙醇酸的這樣的條件下運行。可隨后用強陽離子交換樹脂或其他方法處理所得到的乙醇酸/乙醇酸銨溶液以達到徹底轉化。秉合包含羥基的羧酸銨鹽可進行縮聚以形成二聚物、低聚物和聚合物，同時釋出氨。可使用多種眾所周知的技術將所得到的聚合物與反應混合物分離。一旦與反應混合物分離，可通過解聚獲得游離酸。趟^襲^熱分解("鹽裂化")可用于獲得包含乙醇酸的產物(見共同未決的美國臨時專利申請US60/638148;其全文在此并入作為參考)。該方法不需要在熱分解基本上無水的乙醇酸銨鹽之前添加一種或多種化學藥品。熱鹽裂化可與一種或多種本發明的回收方法結合以進一步分離乙醇酸。該方法的第一步是從包含乙醇酸銨水溶液的原料流中除去游離水分，以致形成基本上無水的乙醇酸銨鹽(在室溫(約25。C)下該基本上無水的鹽是粘性液體)。從含水反應混合物中除去游離水分的方法是本領域眾所周知的，包括但不限于蒸餾、真空蒸餾、凍干和蒸發。該方法的下一步包括在真空下加熱基本上無水的鹽至足以熱分解銨鹽為乙醇酸和氨的溫度。所使用的溫度應選擇以致發生鹽熱分解，同時4吏酸分解和/或可產生不需要的副產物例如2-羥乙酰胺的不需要的副反應降至最低的溫度。通常在真空(0.5至約385mmHg絕對壓力)下，于約100。C至不超過約140。C的溫度，加熱基本上無水的乙醇酸銨鹽一段足以熱分解所述鹽為包含乙醇酸的產物的時間。真空用于幫助除去氨。本領域技術人員能確定適合的真空壓力。一個常用的真空值的例子為約0.5至約385mmHg絕對壓力。熔融銨鹽的熱分解可使用任何蒸發器裝置，但優選刮膜式蒸發器。在指定的條件下熱分解鹽將大部分的熔融乙醇酸銨鹽轉化為乙醇酸和某些額外的副產物，例如乙交酯(乙醇酸的環狀二聚物)、線型多聚形乙醇酸(通常為二聚物，至多五聚物)、線型多聚形乙醇酸的銨鹽(通常為二聚物，至多五聚物)和2-羥乙酰胺。本領域技術人員能調節用于熱分解乙醇酸銨的條件，以最優化游離乙醇酸的產生，同時使副反應例如產生2-羥乙酰胺減至最少。在熱分解過程中產生的氨可回收并再循環。任選地，乙醇酸銨水溶液部分脫氨產生含有明顯更少銨離子的脫氨產物。對于后繼處理該脫氨產物是特別適合的，因為產生了較少的廢物(天然鹽)。除從包含乙醇酸銨的溶液中回收乙醇酸之外，可4吏用已知4支術與腈水解酶催化劑相分離，直接回收包含乙醇酸銨的溶液，所述技術包括但不限于傾析或過濾，以及隨后任選地蒸餾濾液中的水而濃縮。申請特別并入所有在本文中引用的參考文獻的全文內容。此外，當給出數量、濃度或其他值或參數的范圍、優選的范圍，或一列更可取的上限值和下限值時，很清楚所明確披露的所有范圍由任何一對的任意上限值或優選值和任意下限值或優選值形成，與范圍是否是分別披露的無關。對于本文所列的數值范圍，除非另作說明，該范圍規定為包括其端點，以及在該范圍內的所有整數和分數。當定義范圍時，并不意圖將本發明的范圍限制在所列的特定值。一jl殳方法適合于細菌培養物保持和生長的材料和方法是本領域眾所周知的。i舌用干以下定施例中的4去術可化干如ManualofMethodsforGeneralBacteriology(1994)(PhillippGerhardt,R.G.E.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips,編.)，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.)或ThomasD.Brock，inBiotechnology:ATextbookoflndustrialMicrobiology.(1989)第2版，(SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA)所述的。基因組DNA制備、PCR擴增、通過核酸內切酶和核酸外切酶產生期望的末端用于DNA克隆的DNA修飾、連接和細菌轉化所需要的操作是本領域眾所周知的。在此使用的標準的重組DNA和分子克隆技術是本4頁域眾所周知的，并描述于Maniatis,同上；和T.J.Silhavy,M.L.Bennan和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions.(1984)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpring,NY;andbyAusubel,F.M.等，CurrentProtocolsinMolecularBiology.(1994-1998)JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork。說明書中相應于度量單位、技術、特性或化合物的縮寫如下"sec"或"s"表示秒，"min"表示分鐘,"h"或"hr"表示小時，"d"表示天，、M"表示微摩爾，"mM"表示毫摩爾，"M"表示摩爾，"iimol"表示微摩爾，"mmol"表示毫摩爾，"wt"表示重量，"wt。/。"表示重量百分數，"g"表示克，"iug"表示微克,"L"表示升,"mL"表示毫升，"^iL"表示微升,"kb，,表示千堿基對，"kDa"表示千道爾頓，"HPLC"表示高效液相色譜，"OD"表示在指定波長下的光密度，"nm"表示納米，"rpm"表示每分鐘轉數，"SDS-PAGE"表示十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，"dcw"表示細胞干重，"U"表示腈水解酶活性單位，"GLA"表示乙醇酸或相應的銨鹽，"NH4GLA"表示乙醇酸銨，"GLN"表示乙醇腈，"Rxn"表示反應，"mMGLA/h"是以mMGLA/小時測定的初始反應速率，"ca"表示大約，"HCN"表示氰化氫以及"HCHO，，表示曱醛。實施例1構建高拷貝腈水解酶表達盾粒合成的寡核苷酸引物165(5'國GTTC畫3';SEQlDNO:l)和166(5'-TGATCTAGAGCTTGGAGAATAAAGGGGAAGACCAGAGATG誦3';SEQIDNO:2)(其分別摻入了尸M和Z6"I限制酶切位點(下劃線))用于PCR擴增來自敏捷食酸菌72W(ATCC55746)基因組DNA(SEQIDNO:5)的腈水解酶基因。典型的PCR參凄t如下步驟1:在95°C下5分鐘步驟2:在95°C下O.5分鐘(變性)步驟3:在55°C下0.5分鐘(退火)步驟4:在74°C下1分鐘(延伸)步驟2-4重復25個循環。PCR試劑為RocheDiagnosticsCorporation(Indianapolis,IN)所提供，并如其所推薦的使用該PCR試劑。來自天然敏捷食酸菌72W序列的唯一改變是一種第一個核苷酸由G改變為A以利于在大腸桿菌中表達的改變。在這樣的操作中，將腈水解酶基因的起始密碼子由天然的GTG改變為ATG。因此，相應的腈水解酶蛋白的第一個氨基酸由天然的纈氨酸改變為甲硫氨酸(SEQIDNO:6)。寡核苷酸引物165還導入了核糖體結合位點(粗體)和密碼子(TAG)以終止在腈水解酶開始翻譯之前的/acZ翻譯。用尸M和^Z)al消化PCR產物，并克隆入用尸WI和Z6al消化的pUC19(GenBankL09137;NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.)中以產生稱為pSW138的質粒。實施例2在大腸桿菌中表達活性腈水解酶質粒pSW138用于轉化大腸桿菌MGI655(ATCC47076)和大腸桿菌FM5(ATCC53911)以產生兩才朱菌4朱，分別稱為(l)MG1655/pSW138和(2)FM5/pSW138。如前所述，對每抹菌抹進行培養、誘導、收獲并測定腈水解酶活性(將乙醇腈轉化為乙醇酸)。每一菌林重復6次。1.細菌i咅養在37°C下，搖動(200rpm)16-18小時，于補充有氨芐青霉素(50mg/L)的LB培養基培養菌林接種物。2.腈水解酶表達的誘導將足量的接種物添加到新鮮的補充有氨千青霉素(50mg/L)和IPTG(lmM)的LB培養基中以給出大約0.1的起始OD(600nm)。在37。C下搖動(200rpm)約6-8小時溫育培養物。3.細菌收獲通過離心收獲細菌細胞，盡可能地除去液體，并將細胞沉淀凍在-70。C下。4.測定腈水解酶活性向帶有微型攪拌棒的20-mL溫控(25。C)玻璃閃爍管添加3.0mL底物溶液(0.667M乙醇腈；TCI)和1.0mL細胞懸浮液(400mg細胞濕重/mL,在100mM焦磷酸鈉pH6.0中，1昭/mL脫氧核糖核酸酶)。乙醇腈終濃度為500mM,細胞終濃度為100mg/mL。在5、10、15、30、45和60分鐘時取出樣品(100pL)并將其添加到分析混合物(lOO^L去離子水，36.0NHCL,200jxL200mM丙醇)中，然后渦》走并離心。通過HPLC(HPX87H柱，30cmx7.8mm;0.01NH2S04流動相；在50°C下流速1.0mL/min;IO屮L注射體積；20分鐘分析時間)分析所得到的上清液的乙醇腈(GLN)和乙醇酸(GLA)。對微波千燥的雙^f分樣品測定細胞干重(dcw)。腈水解酶活性記錄為U/gdcw，其中在25。C下在1分鐘內，1單位(U)轉化1jimolGLN為GLA(表1)。表1菌株MG1655/Psw138FM5/Psw1383.3實施例3通過易錯聚合酶鏈式反應構建敏捷食酸菌72W腈水解酶隨機誘變文庫才艮據廠商使用說明(GentraSystems,Minneapolis,MN),使用PuregeneDNA分離試劑盒由敏捷食酸菌72W(ATCC55746)制備基因組DNA。才艮據GeneMorphPCR誘變試劑盒(Stratagene,LaJolla,CA)提供的使用說明，對敏捷食酸菌72W腈水解酶基因(編碼序列；SEQIDN0:5)進行易錯PCR，使用標識為SEQIDN0:3(5'-GCGCATATGGTTTCGTATAACAGCAAGTTCC-3')和SEQIDN0:4(5'畫ATAGGATCCTTATGGCTACTTTGCTGGGACCG-3')的引物。使用推薦產生低突變頻率(0-3次突變/kb)和中等突變頻率(3-7次突變/kb)的反應條件。根據pTrcHis2TOPOTA表達試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)提供的使用說明，將10%的1.1kbPCR產物連接入表達載體pTrcHis2TOPO⑧中。根據供應廠商(Invitrogen)的推薦，將一半的連接混合物轉化到大腸桿菌TOP10中。將1。/。的轉化混合物涂布(plated)在補充有50mg/L氨千青霉素的LB平板上。所得到的轉化體共計200-400個克隆，表明腈水解酶活性(U/gdcw)22.1所產生的總PCR產物能產生400,000-800,000個克隆，遠多于篩選改善的酶活性所需的。通過隨機選擇的克隆樣品的核苦酸序列分析證實了突變頻率。如所預計的，序列分析也證實了大約50%的插入物是以正向存在。SDS-PAGE分析證實了當如推薦的進行生長和誘導時(Invitrogen),基本上所有的克隆都具有表達約41kD腈水解酶蛋白質的正向插入物。此外，通過標準的PCR擴增了敏捷食酸菌72W腈水解酶基因，使用標識為SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物，并根據廠商推薦，將所得到的DNA產物克隆入pTrcHis2-TOPO(Invitrogen)中，以產生質粒pNM18。用pNM18轉化大腸桿菌TOP10或大腸桿菌FM5(ATCC53911)產生的菌抹用作為各自的對照。除起始密碼子由GTG改變為ATG利于在大腸桿菌中表達之外，pNM18中的敏捷食酸菌72W腈水解酶"對照"序列(SEQIDNO:5)和野生型敏捷食酸菌72W的編碼序列相同。實施例4對敏捷食酸菌72W腈水解酶隨機誘變文庫篩選增加的腈水解酶活性將來自低突變頻率易錯PCR文庫(如實施例3中所述構建的)的大約10,000個克隆涂布在補充有50mg/L氨節青霉素的LB瓊脂上。使用機器人技術在96-孔微量滴定板中進行高通量篩選。在單個克隆于補充有50mg/L氨千青霉素和1mMIPTG(異丙基-P-D-硫代半乳糖苷)的液體LB中在37。C下，200rpm搖動培養18h后，培養物在37。C下補充50mM乙醇腈(GLN)持續1h，80Hz線性振蕩。通過濾出細菌細胞終止反應，并將待分析的上清液密封在微量滴定板中并貯藏在4。C直至分析。通過大氣壓化學電離(APCI)質譜法測定產生的乙醇酸(GLA),在單離子模式中以陰離子模式監測M-H離子，m/z75。所用的質譜儀是Micromass(Waters)QuattroUltima三級四級(triplequad)式質語儀，具有以下設定離子源溫度=150°"探頭溫度-300。C,錐孔氣二80L/hr,脫溶劑氣=700-800L/hr,錐孔電壓-35V，電暈電壓二20mA,倍增器=600V,采樣時間=0.1s,信道間延遲時間=0.02s。流動相為50/50MeOH/H20,每針3.5mL/min,在注入質譜^(義之前具有1:5的洗脫液稀釋，使用了LCPackingsAcurate分流器。通過Gilson215自動取樣器遞送樣品，所述Gilson215自動取樣器帶有將30mL樣品注射到5-mL進樣回路中的889次連續注射的8-閥組。HudsonPlateCraneXT平板操作機器人將平板遞送至Gilson自動取樣器的擱板上。在每8次一組的注射之間，用相同的溶劑以5mL/min洗滌針頭和注射口。通過該方法，鑒定并分離了7抹具有增加的腈水解酶活性的菌抹。實施例5鑒定賦予增加的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶中的突變核苷酸序列分析用于鑒定存在于如實施例4所述分離的7抹TOP10突變體菌林的腈水解酶基因中的任何突變，并推斷相應的氨基酸改變。所有7株菌抹顯示了帶有單個氨基酸改變的相同的腈水解酶序列(SEQIDNO:8),第201位的Leu改變為Gin(L201Q),在質粒中稱為pNM18-201Q。該改變對通過SDS-PAGE分析所測定的腈水解酶蛋白產生沒有可檢測到的影響(與天然酶相比)。實施例6腈水解酶氨基酸殘基第201位飽和誘變根據廠商使用說明，使用簡并寡核苷酸以及QuikChange⑧位點定向誘變試劑盒(Stratagene,LaJoIIa,CA)構建敏捷食酸菌72W腈水解酶氨基酸殘基第201位々包和誘變文庫。如前所述(實施例4)，該文庫篩選出大約500個具有增加的腈水解酶活性的成員。核苷酸測序分析用于確定第201位處賦予增加的腈水解酶活性的任何氨基酸改變。除L201Q(SEQIDNO:8)之外，通過篩選鑒定了以下賦予增加的腈水解酶活性的突變L201G(SEQIDNO:16)、L201H(SEQIDNO:18)、L201K(SEQIDNO:20)、L201N(SEQIDNO:22)、L201S(SEQIDNO:24)、L201A(SEQIDNO:10)、L201C(SEQIDNO:12)和L201T(SEQIDNO:14)，在質沖立中分別稱為pNM18-201G、pNM18-201H、p麗18-201K、pNM18畫201N、p麗18陽201S、p畫18-201A、p畫18-201C和p麗18-201T。實施例7敏捷食酸菌72W腈水解酶催化域的定向飽和誘變在增加對2-羥基腈即產生乙醇酸的腈水解酶活性的嘗試中，我們假設敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQIDNO:6)中的催化域可以是適合于突變的區域。根據廠商使用說明，使用簡并寡核苷酸以及QuikChange⑧位點定向誘變試劑盒(Stratagene,LaJoIIa,CA)完成壽丈捷食酸菌72W腈水解酶(SEQIDNO:6)催化域(160G161G162L163N164C165W166E167H168E169Q170￡171L172S173K)中在已知的細菌腈水解酶之間那些并不完全保守的殘基(下劃線)的飽和誘變。具體來說，構建9個小文庫(500-1000個克隆)，一個文庫對應一個靶向的活性位點殘基(上述下劃線的)。如前所述對這些文庫篩選增加的腈水解酶活性。核苷酸測序分析用于確定賦予增加的腈水解酶活性的任何氨基酸改變。鑒定了以下賦予增加的腈水解酶活性的改變F168K(SEQIDNO:26)、F168M(SEQIDNO:28)、F168T(SEQIDNO:30)和F168V(SEQIDNO:32),在質粒中分別稱為pNM18畫168K、pNM18國168M、pNM18-168T和pNM18-168V。實施例8構建MG1655/pSW138誦168K、MG1655/pSW138-168M、MG1655/PSW138-168T、MG1655/pSW138畫168V、MG1655/pSW138-201Q、MG1655/PSW138-201G、MG1655/pSW138國201H、MG1655/pSW138-201K、MG1655/PSW138-201N和MG1655/pSW138國用切割質粒pNM18-168K、pNM18-168M、pNM18畫168T、p麗18國168V、p麗18-201Q、p畫18國201G、p畫18國201H、p畫18-201K、pNM18-201N和pNM18-201S中的每一個，并將較小的片段(907bp)亞克隆入也已用五coRI切割的質粒pSW138(描述于實施例1中)中，以分別產生質粒pSW138-168K、pSW138-168M、pSW138-168T、pSW138-168V、pSW138-201Q、pSW138-201G、pSW138隱201H、pSW138國201K、pSW138腸201N和pSW138-201S。將質粒pSW138國168K、pSW138-168M、pSW138-168T、pSW138國168V、pSW138畫201Q、pSW138誦201G、pSW138-201H、pSW138-201K、pSW138-201N和pSW138-201S中的每一個用于轉化大腸桿菌MG1655以分別產生菌才朱MG1655/pSW138-168K、MG1655/pSW138-168M、MG1655/pSW138-168T、MG1655/pSW138畫168V、MG1655/pSW138-201Q、MG1655/pSW138-201G、MG1655/pSW138國201H、MG1655/pSW138-201K、MG1655/pSW138-201N和MG1655/pSW138國201S。實施例9通過IO升發酵產生的突變體的腈水解酶活性在發酵罐接種之前，于30°C在補充有0.1mg氨芐青霉素/mL的500mLLB培養基中搖動(300rpm)培養大腸桿菌種子培養物6-10h(OD550=1-2)。在14-LBraunBiostatC發酵罐(B.BraunBiotechInternationalGmbh,Melsungen,Germany)中培養腈水解酶菌抹，使用了含有葡萄糖、氨和鹽的礦質培養基。IPTG(對于基于FM5/pNM18的菌抹)或乳糖(對于基于MG1655/pSW138的菌才朱)用于誘導。預殺菌發酵罐培養基(7.5L)描述于表2中。殺菌后添加劑包括過濾滅菌的微量元素(表3)、0.1mg氨芐青霉素/mL、2g酪蛋白氨基酸(Difco)/L、4g葡萄糖/L和500mL種子培養物。發酵設定值描述于表4中。NH4OH(40%w/v)和H2P04(20%w/v)用于pH控制。溶解氧濃度控制在25%的空氣，所述空氣首先攪拌以增加需氧量并接著通氣飽和。IPTG誘導和乳糖誘導所使用的發酵進料方案分別在表5和6中給出。如果葡萄糖蓄積超過5g/L，則降低葡萄糖進料速度。對于基于FM5/pNM18的菌抹，在OD55o=20-30下添加IPTG到0.5mM。在40-56hrs后，將細胞冷卻至5-10°C并通過離心收獲。如(實施例2)所述測定腈水解酶活性，結果示于表7。表2.發酵培養基，預殺菌(<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表3.發酵微量元素<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表4.發酵設定值<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表7.在IO升發酵罐中培養的突變體的腈水解酶活性<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>實施例10測定大腸桿菌TOP10/pNM18、大腸軒菌TOP10/pNM18-201A、大腸桿菌TOP10/pNMl8-201C和大腸桿菌TOP10/pNMl28-201T的腈水解酶活性(搖瓶)將10mL過夜培養物(LB+50ng/mL氨千青霉素，37。C搖動)添加到200mL(LB+50ug/ml氨千青霉素+1mMIPTG)中，并在37°C下搖動溫育4-5hrs(最終OD600大約2.0),—式兩份。在4。C下通過離心收集細胞并貯藏冷凍在-80°C下。向配備有磁性攪拌棒的4-mL玻璃瓶中添加1.0mL1.0M乙醇腈水溶液，并在溫控水浴中將玻璃瓶及其內容物平衡至25。C。攪拌的同時，將預平衡至25°C的含有40-100mg濕細胞糊的1.0mL0.100M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)添加到玻璃瓶中(最終[GLN]=0.5M)。在預定時間取出樣品(O.IOOmL)并與包含0.100mL7JC、0.020mL6.0N乙酸和0.200mL0.20M丁酸鈉水溶液的溶液(HPLC外標)混合。離心所得到的混合物，并通過HPLC分析所得到的上清液的乙醇酸，使用了Supelco(SigmaAldrichCorp.)LC-18-DB4i(15cmX4.6mm);流動相10mM醋酸鈉水溶液(NaOAc),10mM醋酸(AcOH)，7.5。/)(v/v)甲醇。測定每一細胞糊的細胞干重(dcw)并用于計算細胞特異性腈水解酶活性。表8概述了與天然腈水解酶相比，腈水解酶突變體的腈水解酶活性增加了。表8.相對于對照突變體L201A、L201C和L201T的腈水解酶活性(搖瓶)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>實施例11制備固定的大腸桿菌SS1001(ATCCPTA-1177)大腸桿菌菌抹SS1001(ATCCPTA-1177)是一種表達敏捷食酸菌72W腈水解酶的轉化的大腸桿菌菌抹(US6,870,038;在此并入作為參考)。與野生型72W腈水解酶序列(SEQIDNO:5)相比，重組表達的(大腸桿菌SS1001)腈水解酶(SEQIDNOs:37-38)的編碼序列含有2個小的序列改變。起始密碼子由GTG改變為ATG以利于重組表達，并且在克隆過程中導入引起鄰近C-末端的單個氨基酸改變的人工序列(Pro367[CCA]—Ser[TCA]).如前所述在10-L發酵罐中培養該菌抹(見US10/919182的實施例8)，以及細胞糊(乙醇腈(GLN))用于如下將GLN轉化為乙醇酸(GLA)的處理中。首先，按照以下步驟將大腸桿菌SS1001細胞固定在角叉菜膠珠子中(固定的大腸桿菌SS1001)。在50。C下將9g角叉菜膠(FMCGP911;FMCCorp.,Philadelphia,PA)緩慢地添加到快速攪拌的231g去離子水中，將所得到的混合物加熱至80。C,直至角叉菜膠完全溶解，然后將所得到的溶液攪拌冷卻至47。C。在配備有攪拌棒的獨立燒杯中，在約25。C下將75.9g冷凍的大腸桿菌SS1001細胞(39.53%dcw)添加到84.1g0.35MNa2HP04(pH7.3)中并混合直至細胞懸浮，然后添加脫氧核糖核酸酶I溶液(IOnL12,500U/mL脫氧核糖核酸酶(SigmaAldrich,St.Louis,MO)/100mL細胞懸浮液)。在添加角叉菜膠溶液之前，立刻攪拌加熱細胞懸浮液至45-46。C。在47。C下將160.0g大腸桿菌SS1001細胞懸浮液添加到攪拌的47。C的角叉菜膠溶液中，并在47。C下將所得到的細胞/角叉菜膠懸浮液經由電熱的20標準規格的針頭泵出，并在室溫下(約21-22。C)滴入攪拌的0.25MKHCO3(pH=7.3)t;通過針頭的流速設定在5-8mL/min。進行1h的攪拌，使所得到的珠子變硬，并貯藏在0.25MKHC03(pH7.3)中。通過添加0.5g25。/。戊二醛(GA)水溶液(SigmaM752隱07)到懸浮在48mL0.25MKHC〇3(pH7.3)中的20g珠子上，并在室溫下攪拌lh,進行珠子的化學交聯。然后，向珠子的懸浮液添加2.0g12.5wt%聚氮丙咬水溶液(PEI,BASFLUPASOLPS;BASFAktiengesellschaft,Ludwigshafen,Germany),然后在室溫下再混合1h。在5。C下將GA/PEI-交聯的珠子貯藏在1.0MNH4HC03(pH7.3)中。GLN生物催化轉化為GLA繼之以HPLC。將等分物(0.2mL)的反應混合物添加到0.01mL6MHCL和0.8mL0.25M正丙醇水溶液(HPLC外標)中，并通過HPLC(HPX87H柱(Bio-Rad,Hercules,CA),30cmx7.8mm;0.01NH2S04流動相；在50。C下流速1.0mL/min;10注射體積；折光率(Rl)檢測器，20分鐘分析時間)分析GLN和GLA。GA/PEI-交聯的角叉菜膠/7.5。/。(dcw)大腸桿菌SS1001珠子的腈水解酶活性為約12U/g珠子，其中在25。C下在1分鐘內，1單位(U)轉化1pmolGLN為GLA。實施例121M乙醇腈(GLN)轉化為乙醇酸銨(NH4GLA)向帶高架攪拌的50-mL夾套式反應釜進料4g大腸桿菌SS1001珠子(實施例11)、13.73mL去離子水、0.4mL5MNH4GLA和1.87mLGLN(約52wt。/。水溶液(TCI))，0.89MGLN終濃度，pH調節至pH7.6,在25°C下攪拌混合物，并將0.2mL等分物取出進行通過HPLC的反應處理。當所有的GLN轉化為NH4GLA時，傾析產物溶液，并添加14.13mL去離子水和1.87mLGLN到生物催化劑中，pH調節至pH7.6，重復生物催化劑再循環。在第一生物催化劑再循環下NRtGLA合成的初始速率為143mM/h。相對于再循環次數，NH4GLA合成初始速率的百分數減少示于表9("1M")。實施例13大約3M乙醇腈(GLN)轉化為乙醇酸銨(NH4GLA)向帶高架攪拌的50-mL夾套式反應釜進料4g大腸桿菌SS1001珠子(實施例11)、6.39mL去離子7jc、4mL1MKHC03和5.61mLGLN(約52wt。/。水溶液(TCI)),2.68MGLN終濃度，pH調節至pH7.6,在25。C下攪拌混合物，并將0.2mL等分物取出進行通過HPLC的反應處理。當所有的GLN轉化為NH4GLA時，傾析產物溶液，并添加6.39mL去離子水、4mL1MKHC03和5.61mLGLN到生物催化劑中，pH調節至pH7.6,重復生物催化劑再循環。在第一生物催化劑再循環下NH4GLA合成的初始速率為207mM/h。相對于再循環次數，NH4GLA合成初始速率的百分數減少示于表9("3M")。實施例14以大約1M增量(lM+1M+1M)添加大約3M乙醇腈以產生乙醇酸銨向帶高架攪拌的50-mL夾套式反應釜進料4g大腸桿菌SS1001珠子(實施例11)、8.13mL去離子7JC、4mL1MKHC03和1.87mLGLN(約52wt。/。水溶液(TCI》，0.89MGLN,pH調節至pH7.6，在25。C下攪拌混合物，并將0.2mL等分物取出進行通過HPLC的反應處理。當所有的GLN轉化為NH4GLA時，添加第二部分的1.87mLGLN，pH調節至pH7.6，并當所有GLN被消耗時，添加第三部分的1.87mLGLN,pH調節至pH7.6，完成反應產生了大約3MNH4GLA溶液。傾析產物溶液，并添加8.13mL去離子水、4mL1MKHC03和1.87mLGLN到生物催化劑中，pH調節至pH7.6，繼續完成GLN轉化，以及GLN、水和緩沖液的添加，pH調節和完成GLN轉化被重復兩次更多以結束再循環(GLN在三次大約1M增量中逐步轉化)，重復生物催化劑再循環。在第一再循環中(每次再循環三個約1MGLN部分)的第一1MGLN溶液中NH4GLA合成的初始速率為155mM/h。相對于再循環次數，NH4GLA合成初始速率的百分數減少示于表9("(1M+1M+1M)=3M")。實施例15連續添加乙醇腈(GLN)至0.2MGLN以產生乙醇酸銨(NH4GLA)向帶高架攪拌的50-mL夾套式反應釜進料4g大腸桿菌SS1001珠子(實施例ll)、8mL去離子水、4mL1MKHC03和0.4mLGLN(約52wt0/。水溶液(TCI))，pH調節至pH7.6,在25。C下攪拌混合物，以GLN消耗速率連續添加GLN溶液至3MGLN,以保持GLN濃度約0.2M，并將0.2mL等分物取出進行通過HPLC的反應處理。當所有的GLN轉化為NH4GLA時，傾析產物溶液，并添加8mL去離子水、4mL1MKHC03和0.4mLGLN到生物催化劑中，pH調節至pH7.6,并以GLN消耗速率添加GLN至3MGLN，重復新的生物催化劑再循環。對于第一生物催化劑再循環(每次再循環3MGLN總量)，NH4GLA合成的初始速率為144mM/h。相對于再循環次數，NH4GLA合成初始速率的百分數減少示于表9("0.2M連續")。表9.在3MGLN、1MGLN、以三個1M增量添加3MGLN以及以0.2MGLN開始連續添加GLN下，相對于再循環次數，NH4GLA合成初始速率的百分數減少(nd-未測定).<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>實施例16制備包含不同交聯度的GA/PEI-交聯的角叉菜膠/大腸桿菌FM5/pNM18-210A珠子來自質粒pTrcHis2-T0P0⑧的表達腈水解酶突變體210AIa(SEQIDNO:M)的質粒pNMl8-210A用于轉化大腸桿菌FM5，以產生稱為FM5/pNM18-21OA的菌抹。如前所述在10-L發酵罐中培養該菌林(見US10/919182的實施例8;在此并入作為參考)，并將細胞糊用于如下將GLN轉化為乙醇酸(GLA)的處理中。首先，按照以下步驟將大腸桿菌FM5/pNM18-21OA細胞固定在角叉菜膠珠子中。在50。C下將12g角叉菜膠(FMCGP911)緩慢地添加到快速攪拌的228g去離子水中，將所得到的混合物加熱至80。C，直至角叉菜膠完全溶解，然后將所得到的溶液攪拌冷卻至52。C。在配備有攪拌棒的獨立燒杯中，在約25。C下將74.9g冷凍的大腸桿菌FM5/pNM18-210A細胞(26.7%dcw)添加到85.1g0.35MNa2HP04(pH7.3)中并混合直至細胞懸浮，然后添加脫氧核糖核酸酶I溶液(IO12,500U/mL脫氧核糖核酸酶(Sigma)AOOmL細胞懸浮液)。細胞懸浮液連續過濾通過230微米和140微米的NuproTF濾網組件過濾器，并在添加角叉菜膠溶液之前，立刻攪拌加熱至50°C。在50°C下將160.0g大腸桿菌FM5/pNM18-210A細胞懸浮液添加到攪拌的52。C的角叉菜膠溶液中，并在47°C下將所得到的細胞/角叉菜膠懸浮液經由電熱的20標準規格的針頭泵出，并在室溫下(約21-22。C)滴入攪拌的0.25MKHC03(pH=7.3)中；通過針頭的流速設定在5-8mL/min。進行1h的攪拌，使所得到的珠子變石更，并貯藏在0.2SMKHCO3(pH7.3)中。通過添加0.5g(在下文中稱為"生物催化劑1")或2.0g(在下文中稱為"生物催化劑2")25n/o戊二醛(GA)水溶液(SigmaM752-07)到懸浮在48mL0.25MKHC03(pH7.3)中的20g珠子上，并在室溫下攪拌1h,進行珠子的化學交聯。然后，向珠子的懸浮液添加2.0g(生物催化劑l)或4.0g(生物催化劑2)12.5wt。/o聚氮丙啶水溶液(PEI，BASFLUPASOLPS),然后在室溫下再混合18h。在5。C下將GA/PEI-交聯的珠子5&藏在1.0MNH4HC03(pH7.3)中。GLN生物催化轉化為GLA繼之以HPLC。將等分物(0.2mL)的反應混合物添加到0.01mL6MHCL和0.8mL0.25M正丙醇水溶液(HPLC外標)中，并通過HPLC(HPX87H柱，30cmx7.8mm;0.01NH2S04流動相；在50°C下流速1.0mL/min;10pL注射體積；Rl檢測器，20分鐘分析時間)分析GLN和GLA。對于生物催化劑1和生物催化劑2，GA/PEI-交聯的角叉菜膠/5Q/o(dcw)大腸桿菌FM5/pNM18-210A珠子的腈水解酶活性為約13U/g珠子，其中在25°C下在1分鐘內，1單位(U)轉化1pmolGLN為GLA。實施例17(比較)在空氣中無添加劑下，乙醇腈(GLN)轉化為乙醇酸銨(NH4GLA)向帶高架攪拌的50-mL夾套式反應釜進料4g生物催化劑1、12.42mL去離子水、0.5mL4MNH4GLA和1.78mLGLN(約52wt%水溶液(Fluka)),1MGLN終濃度，pH7.6,在25。C下攪拌混合物，并將0.2mL等分物取出進行通過HPLC的反應處理。當所有的GLN轉化為NH4GLA時，添加第二部分的1.78mLGLN,用氳氧化銨調節pH至pH7.6,當所有的GLN都被消耗時，添加第三部分的1.78mLGLN，pH調節至pH7.6，完成反應產生3.1MNH4GLA溶液。傾析產物溶液，并添加12.42mL去離子水和1.78mLGLN到生物催化劑中，pH調節至pH7.6，繼續完成GLN轉化，以及GLN添加、pH調節和完成GLN轉化被重復兩次更多以結束再循環(GLN在三次1M增量中逐步轉化)，重復生物催化劑再循環。相對于再循環次數，對于在再循環中第一1MGLN溶液的轉化，初始速率的百分數減少示于表IO(再循環反應是反應2-8)。實施例18在無氧環境中無添加劑下，乙醇腈(GLN)轉化為乙醇酸銨(NH4GLA)在氮氣下，向帶高架攪拌的50-mL夾套式反應釜進料4g生物催化劑1、12.42mL去離子水、0.5mL4MNH4GLA和1.78mLGLN(約52wt。/o水溶液(Fluka)),1MGLN終濃度，pH7.6,在25。C下攪拌混合物，并將0.2mL等分物取出進行通過HPLC的反應處理。當所有的GLN轉化為NH4GLA時，添加1.78mLGLN和0.2mL水，用氬氧化銨調節pH至pH7.6,當所有的GLN都被消耗時，添加第三部分的1.78mLGLN和0.2mL去離子水，pH調節至pH7.6，完成反應，產生3.1M麗4GLA溶液。傾析產物溶液，并添加12.62mL去離子水和1.78mLGLN到生物催化劑中，pH調節至pH7.6，繼續完成GLN轉化，以及1.78mLGLN和0.2mL去離子水的添加、pH調節和完成GLN轉化被重復兩次更多以結束再循環(GLN在三次增量中逐步轉化)，重復生物催化劑再循環。相對于再循環反應次數，對于在再循環反應中第一1MGLN溶液的轉化，初始速率的百分數減少示于表IO(再循環反應是反應2-8)。實施例19在無氣環境中在硫代硫酸鹽或連二亞硫酸鹽存在下，乙醇腈(GLN)轉化為乙醇酸銨(NH4GLA)除代替12.42mL去離子水，添加12.22mL去離子水和0.2mL1M添加劑(硫代硫酸鉀，K2S203或連二亞硫酸鈉，K2S20t,)水溶液以起始再循環，以及在每次添加1.78mLGLN同時，代替0.2mL水，添加0.2mL1M添加劑水溶液到反應釜中之外，如實施例18所述進行生物催化劑再循環。相對于再循環次數，對于在再循環中第一1MGLN溶液的轉化，初始速率的百分數減少示于表IO(再循環反應是反應2-8)。表10.在氮氣下添加石克代好u酸鹽或連二亞好u酸鹽到反應中之后、或對于在氮氣或空氣下無添加劑的GLN轉化，相對于再循環反應次數，對于在再循環反應(每次再循環3MGLN總量)中第一1MGLN溶液的轉化，NH4GLA合成初始速率的百分數減少(nd=未測定)。反應#K2S203/N2Na2S204/N2對照/N2對照/空氣(%初始(%初始(%初始(%初始反應速率)反應速率)反應速率)反應速率)0020176112nd5027974rid8664638927468實施例20在pH6.0下在空氣中無添加劑下，乙醇腈(GLN)轉化為乙醇酸銨(NH4GLA)向帶高架攪拌的50-mL夾套式反應釜進料4g生物催化劑1、12.42mL去離子水、0.5mL4MNH4GLA和1.78mLGLN(約52wt%水溶液(Fluka))，1MGLN終濃度，pH6.0，在25。C下攪拌混合物，并將0.2mL等分物取出進行通過HPLC的反應處理。當所有的GLN轉化為NH4GLA時，添加第二部分的1.78mLGLN，用氬氧化銨調節pH至pH6.0，當所有的GLN都被消耗時，添加第三部分的1.78mLGLN,pH調節至pH6.0，完成反應產生3.1MNH4GLA溶液。傾析產物溶液，并添加12.42mL去離子水和1.78mLGLN到生物催化劑中，pH調節至pH6.0,繼續完成GLN轉化，以及GLN添加、pH調節和完成GLN轉化被重復兩次更多以結束再循環反應(GLN在三次增量中逐步轉化)，重復生物催化劑再循環。對于生物催化劑1，相對于再循環反應次數，在再循環反應中第一1MGLN溶液的轉化初始速率的減少示于表ll(再循環反應是反應2-4)。表ll.對于生物催化劑1，在pH6.0下，相對于再循環反應次數，對于在再循環反應中(每次再循環3MGLN總量)第一1MGLN溶液的轉化，NH4GLA合成初始速率的百分數減少。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>實施例21在不同的反應pHs下，利用表達敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大腸桿菌MG1655/pSW138細胞，乙醇腈(GLISn轉化為乙醇酸銨(NILtGLA)向配備有高架攪拌和溫度控制的50-mL夾套式反應釜進料4gGA/PEI-交聯的角叉菜膠珠子(使用如實施例11所述方法制備的)，用72mL0.1MNH4GLA(pHT0)洗滌兩次，每次"分鐘)，所述珠子含有表達敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQIDNO:6)的5%(dcw)大腸桿菌MG1655/pSW138。然后，向反應蒼添加10.88g蒸餾水和2.98mL4.0MNH4GLA(pH7.5),適量的70wt。/。乙醇酸(GLA)(Aldrich)或1:4稀釋的氫氧化銨水溶液(28-30wt%)(表12),并用氮氣吹掃反應釜。混合物在25°C下攪拌，并在pH4.0、4.7、5.5、6.7或7.5下添加2.15mL49.88wt%乙醇腈(GLN)水溶液(2.25g,19.6mmol(Fluka))以產生1MGLN(表13)。在添加GLN后，在預定時間取出四份0.100-mL反應樣品，并通過HPLC分析以測定初始反應速率。在每一pH下，作為重復兩次才喿作的速率平均值的初始反應速率列于表13。表12.70wtQ/。乙醇酸水溶液(GLA)或1:4稀釋的28-30wt。/。氫氧化銨(NH40H)水溶液用于制備所示pH的反應溶液的量。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表13.在不同的pHs下，利用表達敏捷食酸菌WW腈水解酶的固定的大腸桿菌MG1655/pSW138細胞，GLN轉化為NH4GLA的初始反應速率(重復兩次反應的平均值)。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>實施例22在存在或不存在氰化氫(HCN)下，利用表達敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大腸桿菌FM5/pNM18，乙醇腈水解為乙醇酸銨向配備有高架攪拌和溫度控制的50-mL夾套式反應釜進料4gGA/PEI-交聯的角叉菜膠珠子(使用實施例11所述方法制備的)，用72mL0.1MNH4GLA(pH7.0)洗滌兩次，每次15分鐘)，所述珠子含有表達敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQIDNO:6)的5%(dcw)大腸桿菌FM5/pNM18。然后，向反應釜添加10.9g蒸餾水和3.0mL4.0MNH4GLA(pH7.5),并用氮氣吹掃反應釜。混合物在25。C下攪拌，并添加含有或不含有0.063mL50wt%HCN水溶液(0.054g,1mmol)的第一等分物的1.777mL60.51wt%乙醇腈(GLN)水溶液(1.885g,20.0mmol(Fluka，再蒸餾的))，接著馬上添加0.320mL1:16稀釋的氫氧化銨(28-30wt。/。)水溶液。在第一GLN添加后，在預定時間取出四份0.100-mL反應樣品，并通過HPLC分析以測定初始反應速率。在GLN轉化完成之時，添加第二等分物的GLN和氫氧化銨以保持GLN濃度S1M,pH在7,0-7.5,并在GLN轉化完成后，添加第三等分物的GLN和氬氧化銨。在反應完成之時，GLN100%轉化產生乙醇酸(作為銨鹽)，產率〉99%，通過添加GLN所產生的乙醇酸銨的濃度為大約2.5M(3.0M總乙醇酸銨，包括初始的乙醇酸銨緩沖液，最終反應體積為約23.7mL)。在第一反應結束之時，從催化劑中傾析出含水產物混合物(在氮氣下)到反應釜中，然后添加13.9mL蒸餾的去離子水，以及通過添加等分物的含水GLN并如上所述馬上添加氫氧化銨，在25。C下進行第二反應。對于具有催化劑再循環的連續分批反應，初始反應速率列于表14(再循環反應是反應2-9)。表14.在存在或不存在HCN下，利用表達敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大腸桿菌FM5/pNM18,在具有催化劑再循環的連續分批反應中GLN轉化為GLA的初始反應速率。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>實施例24在利用表達壽文捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大腸桿菌FM5/pNM18水解乙醇腈為乙醇酸銨的連續分批反應中，添加甲醛或氰化氪的影響除每一等分物的1.777mL60.51wt%乙醇腈(GLN)水溶液(1.885g,20,0mmol(Fluka,再蒸餾的))含有0.074mL37wt%HCHO水溶液(0.081g，1mmol)(再循環1、2、3和6)或0.063mL50wt%HCN水溶液(0,054g,lmmol)(再循環4、5和7)之外，如實施例23不添加HCN的反應所述，運行反應，進行鑒定并再循環生物催化劑(表15)。重復來自表14的不添加HCHO或HCN的反應數據用于比較。表15.在添加HCHO(反應1、2、3和6)或HCN(反應4、5和7)的相同反應系列以及不添加HCHO或HCN下，利用表達敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定的大腸桿菌FM5/pNM18,在具有催化劑再循環的連續分批反應中GLN轉化為GLA的初始反應速率。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>實施例25利用表達敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體L201Q的大腸桿菌FM5/pNM18-L201Q細胞，乙醇腈水解為乙醇酸銨向50-mL離心管裝入利用6g表達敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體L201Q(SEQIDNO:8)的大腸桿菌FM5/pNM18-L201Q獲得的1.25mL均勻懸浮液，并添加7.54mL0.35MNa2HP04(pH7.5)、35mL0.35MNa2HP04(pH7.5),在5000rpm下離心管子20分鐘，仔細并完全地從細胞糊中除去上清液，將935mg離心的細胞糊轉移到配備有高架攪拌和溫度控制的150-mL夾套式反應釜中。然后，向反應釜添加52.54mL0.3MNH4GLA(pH7.5)、7.88mL4.0MNH4GLA(pH7.5)和9.63mL蒸餾水，并用氮氣吹掃反應釜。在25°C下攪拌混合物，添加7.82mL54.61wto/o乙醇腈(GLN)水溶液(8.18g,78.3mmol(Fluka)),用l:4稀釋的氬氧化銨(28-30wt。/。)水溶液調節pH至pH7.5。為測定初始反應速率，在第一GLN添加之后，在預定時間取出四份0.050-mL反應樣品，添加到分析混合物(0.025mL6.0NHCL和0,800mL0.18M正丙醇)中，渦旋，在12,000rpm下離心6分鐘，并如實施例2所述通過HPLC分析上清液。在GLN轉化完成之時，添加第二等分物的GLN,用氫氧化銨調節pH至7.5,并在GLN轉化完成后，添加第三GLN等分物，并調節pH至pH7.5。在反應完成之時，GLN100%轉化產生乙醇酸(作為銨鹽)，產率>99%,通過添加GLN所產生的乙醇酸銨的濃度為大約2.5M(2.9M總乙醇酸銨，包^^初始的乙醇酸4妄緩沖液，最終反應體積為約94.05mL)。在第一反應結束之時，從細胞糊中離心出含水產物混合物(5000rpm,20分鐘)。稱重細胞糊并轉移回到反應釜中。然后，向反應釜添加52.54mL0.3MNH4GLA(pH7.5)、7.88mL4.0MNH4GLA(pH7.5)和9.63mL蒸餾水，用氮氣吹掃反應釜，通過添加等分物的含水GLN并如上所述馬上添加氫氧化銨，在25。C下進行第二反應。通過如上所述離心反應溶液，在反應4之后回收的細胞糊重量為964mg。對于具有催化劑再循環的連續分批反應，初始反應速率列于表16(再循環反應是反應2-4)。表16.利用表達敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體L201Q的大腸桿菌FM5/pNM18-L201Q細胞糊，在具有催化劑再循環的連續分批反應中GLN轉化為GLA的初始反應速率。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>實施例26利用表達敏捷食酸菌72W腈水解酶或敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的固定的大腸桿菌MG1655/PSW138轉化體，乙醇腈水解為乙醇酸銨向配備有高架攪拌和溫度控制的50-mL夾套式反應釜進料8gGA/PEI-交聯的角叉菜膠珠子(使用實施例11所述方法制備的)，用72mL0.1MNH4GLA(pH7.0)洗滌兩次，每次15分鐘)，所述珠子含有敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQIDNO:6)或敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體F168V(SEQIDNO:32)、F168M(SEQIDNO:28)、F168K(SEQIDNO:26)、F168T(SEQIDNO:30)和L201Q(SEQIDNO:8)的5%(dcw)大腸桿菌MG1655/pSW138轉化體。然后，向反應釜添加14.632g蒸餾水和6.0mL4.0MNH4GLA(pH7.0),并用氮氣吹掃反應釜。在25°C下攪拌混合物，同時利用可編程的注射泵添加8等分物的1.08mL59wt。/o乙醇腈(GLN)水溶液(1.14g,12.0mmol(Fluka,再蒸餾的))和0.288mL1:16稀釋的氫氧化銨(28-30wty。)水溶液(2.304mL總體積)；同時每隔2小時添加1等分物的GLN和氫氧化銨以保持GLN濃度^400mM，pH在6.5-7.5。在第一GLN添加之后，在預定時間取出四份0.050-mL反應樣品，并通過HPLC分析測定初始反應速率。在反應完成之時，GLN100%轉化產生乙醇酸(作為銨鹽)，產率>99%,通過添加GLN所產生的乙醇酸銨的濃度為大約2.4M(3.0M總乙醇酸銨，包括初始的乙醇酸銨緩沖液，最終反應體積為約39.5mL)。在第一反應結束之時，從催化劑中傾析含水產物混合物(在氮氣下)，留下約10.3g的固定的細胞催化劑(8.0g)和殘留的產物混合物(約2.3g)的混合物。然后，向反應釜添加18.3mL蒸餾的去離子水，通過添加等分物的含水GLN并如上所述馬上添加氫氧化銨，在25°C下進行第二反應。對于具有催化劑再循環的連續分批反應，初始反應速率列于表17(再循環反應是反應2-55)。根據產生100%乙醇腈轉化的具有催化劑再循環的連續分批反應的總次數，對每種腈水解酶計算催化劑生產率(產生的GLA總克數/克細胞干重(dcw)酶催化劑)。每種酶催化劑的催化劑生產率為大腸桿菌MG1655/pSW138-F168V,1001gGLA/gdcw(55次連續分批反應)；大腸桿菌MG1655/pSW138-F168M,473gGLA/gdcw(26次連續分批反應)；大腸桿菌MG1655/pSW138-F168K,473gGLA/gdcw(26次連續分批反應)；大腸桿菌MG1655/pSW138-F168T，364gGLA/gdcw(20次連續分批反應)；大腸桿菌MG1655/pSW138-L201Q,346gGLA/gdcw(19次連續分批反應)；大腸桿菌MG1655/pSW138,182gGLA/gdcw(10次連續分批反應)。表17.利用表達的敏捷食酸菌72W腈水解酶或敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體的固定的大腸桿菌MG1655/pSW138轉化體，在具有催化劑再循環的連續分批反應中，GLN轉化為GLA的初始反應速率(nd=未測定)。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>實施例27利用表達敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體F168V的固定的大腸桿菌MG1655/PSW138轉化體，通過GLN轉化獲得的乙醇酸銨的鑒定為確定通過固定的MG1655/pSW138-F168V生物催化劑水解GLN(Fluka,再蒸餾的)獲得的產物溶液成分(見實施例26,表17)，通過HPLC和&NMR波譜鑒定反應5、10和38產生的產物溶液。通過HPLC測定的乙醇酸鹽的濃度為3.1M。利用在500MHz下操作的VarianUnityInova波譜4義(Varian,Inc.,PaloAlto,CA)獲得定量！HNMR波i普。通過將150pL反應產物與400pLD20—起添加到5mmNMR管中制備樣品。用設置在5ppm、90-度脈沖(在Mdb的發射機功率下，5"微秒)的發射機，利用6000Hz的譜寬獲得2HNMR波譜。使用4秒的采集時間，其產生48,000點的總數據量。最長的^Ti(8秒)與曱醇CH3質子有關，因此采集前的總延遲時間設定在50秒(即大于5倍的曱醇CH3L)。在-6db的發射機功率下，該預延遲時間分隔在單次(simple)延遲時間("dl")和施加于殘留水共振的30秒的溶劑飽和脈沖之間。在4次穩態("模擬")掃描前加上32次掃描的信號平均值給出了大約32分鐘的總試驗時間。通過比較^NMR化學位移和在前述2-維NMR相關性試驗中獲得哪些化學位移，并通過加同位素指示劑試驗，獲得歸屬。通過^NMR波譜，對在乙醇酸銨產物溶液中觀察到的雜質進行基于它們官能團的分類，分為以下官能團類別曱醛衍生的、甲酸衍生的、曱醇衍生的和甲基衍生的。對于每一類別，質子信號的積分峰面積歸屬如下兩個質子歸屬為曱醛官能團、一個質子歸屬于甲酸官能團，三個質子歸屬于甲醇官能團以及三個質子歸屬于甲基官能團。對于乙醇酸銨，將積分峰面積除以2(乙醇酸銨質子數目)并分配100%的數值。對于每種雜質官能團分類，將觀察到的質子的積分峰面積除以相應的質子數目(見上)，并將所得到的積分峰面積除以樣品中一個乙醇酸鹽質子的積分峰面積以測定相對于所存在的乙醇酸銨的濃度，所存在的雜質的濃度。乙醇酸銨產率(基于GLN的100%轉化)和乙醇酸銨％純度(基于乙醇酸鹽和總雜質的相對濃度)列于表18。表18.利用表達敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體F168V的固定的大腸桿菌MG1655/pSW138轉化體，轉化GLN產生的乙醇酸銨的產率和純度。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>實施例28通過固定床離子交換層析從乙醇酸銨中分離乙醇酸無添加劑(除反應體積按比例增大18倍之外)，如實施例12所述，將共同未決的US臨時申i會60/638127(在此并入作為參考)的實施例4-8中所述的由氰化氫和甲醛合成的GLN轉化為乙醇酸銨，并用固定床離子交換將乙醇酸銨產物溶液轉化為乙醇酸。使用配備有TeflonPTFE端蓋和H+型的DowexG-26強酸陽離子交換樹脂(DowChemicalCo)的5cmIDx60cm娃酸硼玻璃柱(Spectrum-Chromatogmphy)。5加侖聚丙烯進料罐用于供應超純水(18+MD,通過Sybron-BamsteadNanopureII單元生產的)給柱進料泵(帶有全-丁611011@頭的Cole-Parmer變速隔膜泵)用于樹脂預沖洗和后沖洗。無論何時聚丙烯進料罐總是用氮氣吹掃，以阻止吸收大氣中的C〇2。在用超純水預沖洗填料柱(初始高度=23",柱床體積=1147mL)至〉5的流出液后，泵入乙醇酸銨(1.3升(1428g),pH=7.09)穿過柱床向上流出40mL;當乙醇酸鹽消耗時，將單元切換回超純水，以相同的速率泵入超純水以連續推送進料穿過柱床。在柱運行期間，使用預沖洗的HDPP(高密度聚丙烯)樣品瓶以50mL增量連續捕獲流出液；連續采集了總共38份50-mL流出液樣品，并分析pH(pH計)、乙醇酸鹽濃度(HPLC)和銨離子含量(通過離子交換層析)。使用配備有CD20電導率檢測器和DionexCS17柱(3-11mM曱磺酸，1.0mL/min，用DionexCSRSultra裝置校正(suppressed)到100孩i安，1.0mL/min，100微升樣品回路)的DionexIP25泵進行銨離子含量測定，并將陽離子3-11mMCS17法應用于該分析。合并級分12-23(總共600mL),與5g新鮮的DowexG-26樹脂(用45mL去離子水預沖洗3次，每次20分鐘)一起攪拌過夜，通過過濾收集651g乙醇酸溶液。通過旋轉蒸發濃縮溶液產生70wt。/o乙醇酸(140g產物)。分析70wt。/。乙醇酸的雜質，顯示乙醇酸純度大于99.9%。權利要求1.一種由乙醇腈生產乙醇酸的方法，包括a)將適合的含水反應混合物中的乙醇腈與包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化劑接觸，所述多肽具有SEQIDNO6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代(1)在氨基酸殘基第168位用賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸或纈氨酸取代；和(2)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；由此產生乙醇酸；和b)以鹽或酸的形式回收(a)中產生的乙醇酸；其中當在相同的反應條件下將乙醇腈轉化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化劑提供了至少1.5倍腈水解酶活性的增加。2.權利要求1的方法，其中所述氨基酸序列選自SEQIDNOs:8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32。3.權利要求1的方法，其中酶催化劑是當在相同的反應條件下將乙醇腈轉化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W(ATCC55746)腈水解酶的活性提供了至少約2倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化劑。4.權利要求2的方法，其中酶催化劑是當在相同的反應條件下將乙醇腈轉化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W(ATCC55746)腈水解酶的活性提供了至少約4倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化劑。5.權利要求1的方法，其中酶催化劑以完整的微生物細胞、透化處理的微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種成分、部分純化的酶或純化的酶的形式存在。6.權利要求5的方法，其中所述完整的微生物細胞是重組表達所述多肽的轉化的^f殷生物宿主細胞。7.權利要求5的方法，其中轉化的微生物宿主細胞選自叢毛單胞菌、棒狀桿菌、短桿菌、紅球菌、固氮菌、擰檬酸桿菌、腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、克雷白氏桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、畢赤酵母、克魯維酵母、假絲酵母、漢森氏酵母、杜氏藻、德巴利氏酵母、毛霉菌、球擬酵母、甲基桿菌、芽孢桿菌、埃希氏桿菌、假單胞菌、根瘤菌和鏈霉菌。8.權利要求7的方法，其中轉化的微生物宿主細胞是大腸桿菌。9.權利要求8的方法，其中轉化的微生物宿主細胞是選自具有國際保藏編號ATCC47076的大腸桿菌MG1655和具有國際保藏編號ATCC53911的大腸桿菌FM5的大腸桿菌菌抹。10.權利要求l-9任一項的方法，其中酶催化劑固定在可溶性或不溶性的支持物中或支持物上。11.權利要求l的方法，其中在含水反應混合物中產生的乙醇酸銨的濃度為約0.02wt。/。至約90wt%。12.權利要求11的方法，其中在含水反應混合物中產生的乙醇酸銨的濃度為約0.02wt。/Q至約40wt%。13.權利要求10的方法，其中含水反應混合物中乙醇腈的濃度為約5mM至約1M。14.權利要求13的方法，其中通過連續或等分物添加保持含水反應混合物中的乙醇腈濃度。15.權利要求1的方法，其中含水反應混合物中pH保持在約5.5至約7.7。16.權利要求l的方法，其中在基本上無氧的條件下進行乙醇腈酶促轉化為乙醇酸。17.權利要求l的方法，其中含水反應混合物進一步包含小于5wt%濃度的選自碌L/R^克酸鉀和連二亞石危酸鈉的穩定劑。18.權利要求l的方法，其中酶催化劑是再循環的酶催化劑。19.權利要求l的方法，其中酶催化劑提供了每克酶催化劑細胞干重產生至少300克乙醇酸的催化劑生產率。20.權利要求19的方法，其中酶催化劑提供了每克酶催化劑細胞干重產生至少450克乙醇酸的催化劑生產率。21.權利要求20的方法，其中酶催化劑提供了每克酶催化劑細胞干重產生至少iooo克乙醇酸的催化劑生產率。22.—種編碼具有腈水解酶活性的多肽的分離的核酸分子，所述多肽具有SEQIDNO:6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代c)在氨基酸殘基第168位用曱硫氨酸或蘇氨酸取代；和d)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當在相同的反應條件下將乙醇腈轉化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少1.5倍腈水解酶活性的增加。23.權利要求22的分離的核酸分子，編碼選自SEQIDNOs:8、10、12、14、16、18、20、22、24、28和30的氨基酸序列。24.權利要求23的分離的核酸分子，具有選自SEQIDNOs:7、9、11、13、15、17、19、21、23、27和29的核酸序列。25.—種嵌合基因，包含可操作地連接適合的調節序列的權利要求22-24任一項的分離的核酸分子。26.—種包含權利要求25的嵌合基因的表達盒。27.—種包含權利要求26的表達盒的轉化的宿主細胞。28.權利要求27的轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自叢毛單胞菌、棒狀桿菌、短桿菌、紅球菌、固氮菌、檸檬酸桿菌、腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、克雷白氏桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、畢赤酵母、克魯維酵母、假絲酵母、漢森氏酵母、杜氏藻、德巴利氏酵母、毛霉菌、球擬酵母、曱基桿菌、芽孢桿菌、埃希氏桿菌、假單胞菌、根瘤菌和鏈霉菌。29.權利要求28的轉化的宿主細胞，其中所述宿主細胞是大腸桿菌。30.權利要求29的轉化的宿主細胞，其中轉化的微生物宿主細胞是選自具有國際保藏編號ATCC47076的大腸桿菌MG1655和具有國際保藏編號ATCC53911的大腸桿菌FM5的大腸桿菌菌抹。31.—種具有腈水解酶活性的分離的多肽，所述多肽具有SEQIDNO:6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一個選自以下的氨基酸取代a)在氨基酸殘基第168位用甲硫氨酸或蘇氨酸取代；和b)在氨基酸殘基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸取代；其中當在相同的反應條件下將乙醇腈轉化為乙醇酸時，相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少1.5倍的腈水解酶活性的增力口。32.權利要求31的分離的多肽，編碼選自SEQIDNOs:8、10、12、14、16、18、20、22、24、28和30的氨基酸序列。全文摘要提供了由乙醇腈酶促生產乙醇酸的多種方法。這些方法包括1)利用具有改善的用于將乙醇腈轉化為乙醇酸的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突變體，和2)改善催化劑穩定性和/或生產率的方法。該改善催化劑穩定性和/或生產率的方法包括利用反應穩定劑，在基本上無氧的條件下運行反應以及控制反應混合物中底物的濃度。文檔編號C12N9/78GK101128583SQ200580048285公開日2008年2月20日申請日期2005年12月21日優先權日2004年12月22日發明者A·帕諾瓦,D·P·奧基夫,J·S·湯普森,M·S·佩恩,R·迪科西莫申請人:納幕爾杜邦公司