專利名稱：使用腈酶從相應的α-羥基腈生產α-羥基酸、乙醇酸、2-羥基異丁酸的方法
技術領域：
本發明涉及使用具有腈酶活性的催化劑生產α-羥基酸的方法。更具體而言，本發明涉及使用具有敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)72W腈酶活性的催化劑從乙醇腈生產乙醇酸或者從丙酮合氰化氫(acetone cyanohydrin)生產2-羥基異丁酸的方法。
背景技術：
已知有各種制備α-羥基酸的方法，使用相應的α-羥基腈作為原料，并且使用微生物作為催化劑。所生產的α-羥基酸的實例包括乙醇酸、乳酸、2-羥基異丁酸、2-羥基-2-羥基苯基丙酸、扁桃酸、2-羥基-3，3-二甲基-4-丁內酯和4-甲硫基丁酸。
這些產物是利用微生物合成的，所述微生物例如屬于諾卡氏菌屬、芽孢桿菌屬、短桿菌屬、金桿菌屬、假單胞菌屬、乳酪桿菌屬、產堿菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、節桿菌屬、埃希氏菌屬、微球菌屬、鏈霉菌屬、黃桿菌屬、氣單胞菌屬、枝動菌屬、纖維單胞菌屬、歐文氏菌屬、念珠菌屬、Bacteridium、曲霉屬、青霉屬、旋孢菌屬、鐮刀菌屬、紅假單胞菌屬、紅球菌屬、棒桿菌屬、微桿菌屬、肥桿菌屬和戈登氏菌屬的那些(JP-A-4-99495，JP-A-4-99496和JP-A-4-218385，相應于美國專利No.5,223,416；JP-A-4-99497，相應于美國專利No.5,234,826；JP-A-5-95795，相應于美國專利No.5,296,373；JP-A-5-21987；JP-A-5-192189，相應于美國專利No.5,326,702；JP-A-6-237789，相應于EP-A-0610048；JP-A-6-284899，相應于EP-A-0610049；JP-A-7-213296，相應于美國專利No.5,508,181)。
不過，上述從相應的α-羥基腈制備α-羥基酸的大多數已知方法不能生產和蓄積產物達到足夠高的濃度，以滿足商業需求。這經常是酶在反應早期階段就失活的結果。US 5,756,306教導了“在使用腈酶或腈水合酶水解或水合α-羥基腈來生產α-羥基酸或α-羥基酰胺時，存在酶在短時間內失活的問題。因此難以得到高濃度和高收率的α-羥基酸或α-羥基酰胺”(第1欄第49-54行)。
US 5,508,181致力于解決涉及酶迅速失活的困難。具體而言，US5,508,181提到按照離解平衡，α-羥基腈化合物部分地離解為相應的醛。這些醛通過與蛋白質結合使酶在短時間內失活，因而難以從α-羥基腈得到高濃度和高產率的α-羥基酸或α-羥基酰胺(第2欄第16-29行)。作為防止酶因醛的蓄積而失活的解決方案，向反應混合物加入磷酸鹽或次磷酸鹽離子。US 5,326,702與US 5,508,181相似，但是使用亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽或連二亞硫酸鹽離子來螯合醛，防止酶失活。不過，即使使用上述這類添加劑，所生產和蓄積的α-羥基酸的濃度也不高。
US 6,037,155也教導了α-羥基酸產物的低蓄積與酶因所離解的醛的蓄積而在短時間內失活有關。這些發明人提出酶的活性受氰化氫存在的抑制(Agricultural Biological Chemistry，Vol.46，p.1165(1982))，后者是在α-羥基腈以及相應的醛或酮在水中的部分離解作用中生成的(Chemical Reviews，Vol.42，p.189(1948))。這些發明人使用微生物解決了醛誘發的酶失活問題，通過向反應混合物加入一種氰化物，能夠提高這些微生物的酶活性。氰化物的加入限制了α-羥基腈向醛和氰化氫的離解作用。將反應混合物中的醛濃度(由α-羥基腈向醛和氰化氫的離解作用生成)和/或α-羥基腈濃度保持在指定的范圍內，是一種避免該問題的方法。
乙醇酸(HOCH2COOH；CAS登記號79-14-1)是羧酸的α-羥基酸家族中最簡單的成員。它的獨特性質使它得到用戶和工業上的廣泛應用，包括在井修復、皮革工業、油氣工業、洗衣與紡織工業中的用途，以及作為個人護理產品例如皮膚霜膏中的組分。乙醇酸還是多種工業清潔劑(乳品與食品加工設備清潔劑、家用與公共清潔劑、工業清潔劑(用于運輸設備、磚石建筑、印刷電路板、不銹鋼鍋爐與加工設備和冷卻塔/熱交換器)和金屬加工(用于金屬酸洗、銅增亮、蝕刻、電鍍、電拋光))的主要成分。商業化生產乙醇酸的新技術將是工業熱衷接受的。
關于乙醇酸的生產，已知乙醇腈可逆地離解為氰化氫和甲醛，二者都能使酶活性失活。US 3,940,316描述了使用具有“腈酶”活性的細菌從相應的腈制備有機酸的方法，列舉了作為底物的乙醇腈。具體而言，該專利描述了為此使用芽孢桿菌屬、Bacteridium、微球菌屬和短桿菌屬。盡管被描述為具有腈酶活性，不過短桿菌R312是唯一用在US 3,940,316所有實施例中的菌株。已知短桿菌R312具有腈水合酶和酰胺酶活性，但是沒有腈酶活性(Tourneix等，Antonie vanLeeuwenhoek，1986，52173-182)。JP 09028390公開了通過紅球菌屬或戈登氏菌屬水解酶的作用從乙醇腈制造高純度乙醇酸的方法。乙醇酸的選擇性據報道是幾乎100％的，沒有乙醇酸酰胺的生成。
2-羥基異丁酸(CAS登記號594-61-6)在多種工業原料包括粘合劑和涂料的生產中用作中間體。
使用屬于棒桿菌屬的微生物制備乳酸、乙醇酸和2-羥基異丁酸的方法公開在日本專利申請No.昭61-56086中。已經使用屬于紅球菌屬、假單胞菌屬、節桿菌或短桿菌(JP 04040897 A2)和無色桿菌屬(JP06237776 A2)的微生物從丙酮合氰化氫生產2-羥基異丁酸。在使用紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)(ATCC 19140)時，向反應混合物加入濃度0.5-50wt％的丙酮可提高2-羥基異丁酸生產的效率(JP05219969 A2)，這大概是氰化氫的螯合作用所致。
US 6,037,155也提供了從α-羥基腈生產α-羥基酸包括乙醇酸和2-羥基異丁酸的方法實例。該文承認，由于上述問題，不是所有的微生物催化劑都能夠生產高濃度的乙醇酸，并指出為了發現工業上有利的微生物，必須進行篩選研究。US 6,037,155具體鑒別了屬于貪噬菌屬和節桿菌屬的微生物，它們耐受α-羥基腈或α-羥基酸的抑制效果，具有持久的活性，能夠生產高濃度的所需產物。
敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)是以脂族腈酶(EC 3.5.5.7)活性以及腈水合酶(EC 4.2.1.84)與酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性的組合為特征的。US 5,858,736描述了在水性反應混合物中利用這種微生物的腈酶活性催化脂族α，ω-二腈水解為對應的ω-氰基羧酸和氨。已發現腈酶是高度區域選擇性的，α-烷基-α，ω-二腈的水解作用僅生成ω-氰基羧酸，這是由ω-腈基的水解作用所致。US 5,814,508公開了將敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)在適當緩沖液中的懸浮液在35-70℃下加熱短時使全細胞催化劑不合意的腈水合酶和酰胺酶活性失活，不會顯著減少所需的腈酶活性。
如上所述，開發使用腈酶催化劑高效制造α-羥基酸的工業方法已經證實是困難的。在產物的濃度很低時，對本領域技術人員而言熟知的是方法趨于復雜化，特別是為了從未反應的原料中分離產物，或者從大體積產物混合物中分離少量所需產物。所要解決的問題仍然是缺乏溫和的酶催化劑，以轉化α-羥基腈為對應的酸，該方法應當以高收率、高濃度和高選擇性為特征，并且附加了低溫要求和低廢料產出的優點。
發明概述本發明提供從相應的α-羥基腈制備α-羥基酸的方法，選擇性高，轉化率高。本發明具有下列步驟(a)使α-羥基腈在適合的水性反應混合物中與以來自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的腈酶活性為特征的催化劑接觸；和(b)分離在(a)中所生成的α-羥基酸。
本發明更具體地提供從乙醇腈制備乙醇酸的方法，選擇性高，轉化率高。本發明具有下列步驟(a)使乙醇腈在適合的水性反應混合物中與以來自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的腈酶活性為特征的催化劑接觸；和(b)分離在(a)中所生成的乙醇酸。另外，本發明涉及使用具有敏捷食酸菌72W腈酶活性的催化劑從丙酮合氰化氫生產2-羥基異丁酸。
在發明進一步的實施方案使用具有腈酶活性的催化劑，它是全微生物細胞、透化微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞組分和部分純化的酶或純化的酶的形式。以腈酶活性為特征并且可用在該方法中的微生物是敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)及其突變體、敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)和敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC55745)。另外，含有敏捷食酸菌腈酶活性的轉化微生物細胞也包括在本發明中。大腸桿菌SS1001(ATCC PTA-1177)和大腸桿菌SW91(ATCCPTA-1175)是這樣的轉化微生物細胞催化劑的實例。
本發明的進一步的實施方案使用以(1)腈酶活性和(2)腈水合酶與酰胺酶活性為特征的全微生物細胞作為酶催化劑，用于轉化乙醇腈為乙醇酸或者轉化丙酮合氰化氫為2-羥基異丁酸。優選的全細胞是A.facilis 72W菌株。不過，在用作催化劑之前，將A.facilis 72W全微生物細胞加熱至約35℃至70℃的溫度達10至120分鐘，由此破壞腈水合酶和酰胺酶活性，保存腈酶活性。這種處理避免了所不想要的副產物(分別為乙醇酰胺或2-羥基異丁酰胺)的生成。若突變體和轉化全微生物細胞缺乏腈水合酶和酰胺酶活性，無需熱處理步驟。大腸桿菌SS1001(ATCC PTA-1177)和大腸桿菌SW91(ATCC PTA-1175)是缺乏腈水合酶和酰胺酶活性的轉化微生物細胞催化劑的實例。
以任意方式和可選地，酶催化劑可以被固定在可溶性或不溶性載體之中或之上。
生物保藏的簡要說明出于專利程序的目的，申請人已經根據關于國際微生物保藏的布達佩斯條約進行了下列生物保藏保藏物名稱 國際保藏命名 保藏日期敏捷食酸菌72-PF-17 ATCC 55745 1996年3月8日敏捷食酸菌72WATCC 55746 1996年3月8日敏捷食酸菌72-PF-15 ATCC 55747 1996年3月8日大腸桿菌SS1001 ATCC PTA-1177 2000年1月11日大腸桿菌SW91 ATCC PTA-1175 2000年1月11日本文所用的“ATCC”表示American Type Culture CollectionInternational Depository Authority，位于ATCC，10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，USA。“國際保藏命名”是對保藏在ATCC的培養物的入藏號。
所列舉的保藏物將在所示國際保藏單位保存至少三十(30)年，在公開它的專利授權后，將可為公眾所利用。保藏物的可利用性并不構成實施本發明而侵犯由政府行為授予的專利權的許可。
發明的詳細說明申請人已經通過提供利用敏捷食酸菌72W的腈酶活性從對應的α-羥基腈以高收率和高濃度制備α-羥基酸的方法，解決了所述問題。申請人通過提供利用敏捷食酸菌72W的腈酶活性從對應的乙醇腈以高收率和高濃度制備乙醇酸的方法，已經更具體地解決了所述問題。另外，本發明還涉及使用具有敏捷食酸菌72W腈酶活性的催化劑從丙酮合氰化氫生產2-羥基異丁酸。以高選擇性和高轉化率生產產物。
由本發明生產的乙醇酸、2-羥基異丁酸或α-羥基酸在多種工業中具有有用的應用。例如，2-羥基異丁酸用作中間體生產異丁烯酸。本發明提供可取的方法，其優點在于低溫要求和低廢料產出，相對于以前已知的方法而言。
本發明包括下列步驟(a)使α-羥基腈在適合的水性反應混合物中與以腈酶(EC 3.5.5.7)活性或者以腈水合酶(EC 4.2.1.84)與酰胺酶(EC 3.5.1.4)活性為特征的催化劑接觸；和(b)分離以酸或相應的鹽形式的在(a)中所生成的相應的α-羥基酸。腈酶直接轉化脂族腈為相應的羧酸，不生成相應的酰胺作為中間體(反應式1)。
反應式1 定義本文使用多個術語和縮寫。除非有具體的相反規定，適用下列定義。
術語“催化劑”、“酶催化劑”或“全微生物細胞催化劑”表示以腈酶活性為特征的催化劑。該酶催化劑可以是全微生物細胞、透化微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞組分、部分純化的酶或純化的酶的形式。
術語“敏捷食酸菌”和“A.facilis”是可互換使用的。
術語“大腸桿菌”和“E.coli”是可互換使用的。
術語“乙醇腈”與羥基乙腈、2-羥基乙腈、羥甲基腈和CAS登記號107-16-4的所有其他同義詞是同義的。
術語“乙醇酸”與羥基乙酸、羥基醋酸和CAS登記號79-14-1的所有其他同義詞是同義的。
術語“丙酮合氰化氫”與2-羥基-2-甲基-丙腈、2-甲基-乳腈、α-羥基異丁腈、2-氰基-2-羥基丙烷、2-氰基-2-丙醇、2-羥基-2-氰基丙烷、2-羥基-2-甲基丙腈、2-羥基異丁腈、2-甲基-2-羥基丙腈、2-甲基乳腈、2-丙酮合氰化氫、二甲酮合氰化氫和CAS登記號75-86-5的所有其他同義詞是同義的。
術語“2-羥基異丁酸”與2-羥基-2-甲基-丙酸、2-甲基-乳酸、α-HIB、α-羥基-α-甲基丙酸、α-羥基異丁酸、2-羥基-2-甲基丙酸、2-甲基乳酸、醋酮酸、羥基二甲基乙酸和CAS登記號594-61-6的所有其他同義詞是同義的。
術語“適合的水性反應混合物”指材料與水，在其中α-羥基腈(例如乙醇腈或丙酮合氰化氫)與酶催化劑接觸。本文提供了描述適合的水性反應混合物的組分的表格，本領域技術人員可以領會到適合于該方法的組分變化范圍。
說明書中的縮寫對應于測量、工藝、性質或化合物的單位如下sec表示秒，min表示分鐘，h表示小時，d表示天，mL表示毫升，L表示升，mM表示毫摩爾，M表示摩爾，mmol表示毫摩爾，wt表示重量，HPLC表示高效液相色譜，ca表示大約，O.D.表示在指定波長下的光密度，IU表示國際單位。
優選實施方式的說明方法和材料以腈酶活性為特征并且可用在該方法中的微生物是敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)。以(1)腈酶活性和(2)腈水合酶與酰胺酶活性為特征的全微生物細胞可以用作酶催化劑。優選的全細胞是A.facilis 72W菌株。不過，在用作催化劑之前，將A.facilis 72W全微生物細胞加熱至約35℃至70℃的溫度達10至120分鐘，由此破壞腈水合酶和酰胺酶活性，保存腈酶活性(US.5,814,508)。這種熱處理所得催化劑避免了當相應的α-羥基腈的轉化不完全時，生成所不想要的副產物(分別為乙醇酰胺或2-羥基異丁酰胺)。若突變體和轉化全微生物細胞缺乏不希望有的腈水合酶和酰胺酶活性，無需熱處理步驟。
已經制備了敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)菌株的兩種突變體(US5,858,736)，僅產生非常低水平的不希望有的腈水合酶活性，后者負責脂族二腈的非區域選擇性腈水解作用。這些突變菌株，敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)和敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)在用作本發明催化劑之前不需要細胞的熱處理。
含有A.facilis腈酶活性并且缺乏腈水合酶和酰胺酶活性的轉化微生物細胞也包括在本發明中。大腸桿菌SS1001(ATCC PTA-1177)和大腸桿菌SW91(ATCC PTA-1175)是這樣的轉化微生物細胞催化劑的實例。
敏捷食酸菌菌株72W(ATCC 55746)的生長融化一小瓶冷凍的敏捷食酸菌菌株72W(ATCC 55746)菌種，將1mL內容物置于500mL無菌接種培養基上(組分列在下表1和2中)。在2L燒瓶內，使接種物在30℃下生長24-30h，同時在250rpm下搖動。
表1接種培養基組分 最終濃度 組分 最終濃度磷酸二氫鉀1.5g/L 磷酸一氫鉀 3.4g/L硫酸銨1.5g/L 檸檬酸三鈉二水合物 1g/L硫酸鎂七水合物0.4g/L 痕量金屬溶液(見下) 1mL/LAmberex 695(Universal Foods) 1g/L 甘油(單獨滅菌) 8g/L表2痕量金屬溶液組分 儲備液濃度鹽酸 10mL/L氯化鈣二水合物11.4g/L硫酸錳一水合物1.23g/L硫酸銅五水合物0.63g/L氯化鈷六水合物0.16g/L硼酸 0.91g/L硫酸鋅七水合物1.77g/L鉬酸鈉二水合物0.05g/L硫酸氧釩二水合物 0.08g/L硝酸鎳六水合物0.04g/L亞硒酸鈉 0.04g/L硫酸亞鐵七水合物 6.0g/L將搖瓶接種物無菌轉移至預先滅菌的Braun Biostat C發酵罐內，其中含有發酵培養基(組分列在下表3中)。在下列條件下生長32℃，pH6.8-7.0，溶解氧的飽和度25％。接種時，發酵罐含有8.5L發酵培養基加218g營養溶液，所得甘油的起始濃度大約7g/L。營養溶液包括下列組分，將它們單獨滅菌，冷卻后合并磷酸二氫鉀19.6g的去離子水(0.25L)溶液；硫酸鎂七水合物3.3g加硫酸4mL的去離子水(0.15L)溶液；痕量金屬溶液(組分列在上表2中)67mL加400g甘油的去離子水(0.80L)溶液。接種后18h，開始加入營養溶液。最初，營養溶液的加入速率為0.4g/min(0.15g甘油/min)。培養物的OD550為大約8-9。在26h，加入速率增加至0.9g/min(0.3g甘油/min)。OD550為大約16-18。最后在第34h增加加入速率至1.8g/min(0.6g甘油/min)。保持該速率至結束(約42h)。最終的OD550為大約65-75。
表3發酵培養基組分儲備液濃度磷酸二氫鉀 0.39g/LDifco酵母提取物 5.0g/L磷酸一氫鉀 0.39g/L離心回收細胞，為濕細胞糊，冷凍貯存備用。將濕細胞糊冷凍干燥，所得干細胞重量通常為濕細胞重量的24％。為了用作生物催化劑，首先可選地將A.facilis 72W(ATCC 55746)細胞在0.35M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中加熱至50℃達1h，以使腈水合酶活性失活。
敏捷食酸菌72W的腈酶活性用于生產α-羥基酸除了腈酶以外，A.facilis 72W全細胞還含有腈水合酶和酰胺酶。腈水合酶轉化α-羥基腈為α-羥基酰胺(例如轉化乙醇腈為乙醇酰胺)，后者是引起收率下降的所不想要的副產物(實施例2)。為了避免這種副產物，可以對A.facilis 72W全細胞催化劑進行熱處理，以除去腈水合酶/酰胺酶活性，所得微生物催化劑對乙醇酸具有高選擇性，不會產生乙醇酰胺(實施例1)。乙醇酸和2-羥基異丁酸的生產濃度可以達到1mM至5M，優選200mM至2M。酶活性穩定持續長時間。
全微生物細胞可以用作催化劑，無需任何預處理，例如透化。作為替代選擇，全細胞可以被本領域技術人員熟悉的方法所透化(例如用甲苯、洗滌劑處理或者冷凍融化)，以提高材料向細胞內外擴散的速率。
酶催化劑可以被固定在聚合物基質(例如藻酸鹽、角叉菜膠、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺凝膠(PAG))中或者固定在可溶性或不溶性載體(例如celite)上，以促進催化劑的回收和再利用。將細胞固定在聚合物基質中或者可溶性或不溶性載體上的方法已有廣泛的報道，是本領域技術人員熟知的。還可以從該全細胞中分離腈酶，直接用作催化劑，或者可以將腈酶固定在聚合物基質中或者可溶性或不溶性載體上。這些方法已有廣泛的報道，是本領域技術人員熟知的(Methods inBiotechnology，Vol.1Immobilization of Enzymes and Cells；Gordon F.Bickerstaff，Editor；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997)。
酶催化劑在反應混合物中的濃度取決于酶催化劑的比催化活性，根據所需反應速率加以選擇。水解反應中全微生物細胞催化劑的濕細胞重量通常從0.001g至0.100g濕細胞/每mL總反應體積，優選0.002g至0.050g濕細胞/每mL。全微生物細胞催化劑的比活性(IU/克濕細胞wt)是這樣測定的，使用已知重量的全微生物細胞催化劑，在25℃下測量0.10M乙醇腈溶液向乙醇酸轉化的比率。酶活性的IU被定義為每分鐘轉化一微摩爾底物為產物所需酶活性的量。
對水解反應的溫度加以選擇，以優化反應速率和酶催化劑活性的穩定性。反應溫度可以從懸浮液的凝固點(ca.0℃)以上至70℃，優選的反應溫度范圍從5℃至35℃。全微生物細胞催化劑懸浮液可以這樣制備，將細胞懸浮在蒸餾水中，或者懸浮在含有緩沖劑(例如磷酸的鈉或鉀鹽)的水性反應混合物中，其中反應的初始pH在5.0與10.0之間，優選在6.0與8.0之間。隨著反應的進行，反應混合物的pH可能由于從對應的α-羥基腈的腈官能度生成α-羥基酸的銨鹽而改變。反應可以進行至α-羥基腈完全轉化而無需pH控制，或者可以在反應過程中加入適合的酸或堿，以保持所需的pH。
所得乙醇酸可以這樣分離，利用普通技術人員熟知的工藝，處理已經除去包括細胞在內的不溶物的反應混合物。這類工藝包括但不限于濃縮、離子交換、電透析、萃取和結晶。產物可以銨鹽的形式分離，或者在酸化之后以乙醇酸的形式分離。
已知丙酮合氰化氫在水中可逆地離解為氰化氫和丙酮(Stewart等，J.Am.Chem.Soc.623281-5(1940))，隨著反應混合物的pH降低，有利于生成丙酮合氰化氫的平衡。酶催化的丙酮合氰化氫水解的最佳pH是盡可能低的能保留酶活性的pH，通常為，但不限于，pH4.5-6.0。在反應結束時剩余的丙酮可以被回收和用于生產丙酮合氰化氫。使丙酮再循環用作起始反應物，可以提高丙酮合氰化氫向2-羥基異丁酸的總體轉化率。
所得2-羥基異丁酸可以這樣分離，利用普通技術人員熟知的工藝，處理已經除去包括細胞在內的不溶物的反應混合物。這類工藝包括但不限于濃縮、離子交換、蒸餾、電透析、萃取和結晶。產物可以銨鹽的形式分離，或者(在酸化之后)以2-羥基異丁酸的形式分離。
實施例下列實施例進一步詳細說明本發明。應當理解，這些實施例顯示本發明優選的實施方案，不過僅供例證。本領域技術人員從上述討論和這些實施例能夠確定本發明的必要特征，并且在不背離其精神和范圍的前提下能夠對發明進行各種改變和修飾，以適應各種用途和條件。
實施例1-4中，乙醇腈向反應產物乙醇酸和乙醇酰胺的轉化是用HPLC測定的，其中使用Bio-Rad HPX-87H有機酸分析柱(30cm×7.8mmdia.)，柱前溫度50℃，洗脫劑0.010N H2SO4，使用折光率檢測器。
實施例5和6中，丙酮合氰化氫的回收百分率和2-羥基異丁酸、2-羥基異丁酰胺與丙酮的百分產率是基于丙酮合氰化氫在反應混合物中的初始濃度的，是用HPLC測定的，其中使用折光率檢測器和Bio-Rad HPX-87H有機酸分析柱(30cm×7.8mm dia.)，柱前溫度50℃，洗脫劑0.010N H2SO4，流速1mL/min。
實施例1利用敏捷食酸菌72W的腈酶活性轉化乙醇腈為乙醇酸將0.62g(濕細胞糊)敏捷食酸菌72W細胞(ATCC 55746)在9.38mL0.100M磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中的懸浮液置于15mL聚丙烯離心管內，將細胞懸浮液在50℃下加熱1h(使不希望有的腈水合酶和酰胺酶活性完全失活)，然后在水浴中冷卻至25℃。將懸浮液離心，潷出上清液；將細胞粒狀沉淀再懸浮在9.48mL 0.020M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中，在25℃下混合15min，然后將懸浮液離心。潷出上清液。將所得細胞粒狀沉淀再懸浮在9.38mL 0.020M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中。然后向該管加入0.106mL 55wt％乙醇腈水溶液(乙醇腈在懸浮液中的最終濃度為0.10M)，在25℃旋轉平臺上混合所得懸浮液。先將分析樣本(0.200mL)用6N HCl調至pH2.5以終止反應，離心，用0.2微米濾器過濾上清液。用HPLC分析所得濾液的乙醇腈、乙醇酸和乙醇酰胺。2h后，乙醇腈已經完全轉化為乙醇酸，沒有乙醇酰胺生成。
在初始濃度的乙醇腈完全轉化之后，向反應混合物加入另外0.312mL 55wt％乙醇腈水溶液(向反應混合物加入另外0.30M乙醇腈，總計0.40M)，繼續反應。14h后，另外的乙醇腈幾乎完全轉化為乙醇酸，向反應混合物加入另外0.624mL 55wt％乙醇腈水溶液(另外0.60M乙醇腈，總計1.0M)。40h后，觀察到1.0M乙醇腈完全轉化為乙醇酸，沒有乙醇酰胺生成。
實施例2(對比)使用具有腈酶和腈水合酶/酰胺酶活性的敏捷食酸菌72W細胞轉化乙醇腈為乙醇酸和乙醇酰胺重復實施例1所述反應，但是在用于反應之前沒有將A.facilis72W細胞在磷酸鹽緩沖液中的懸浮液在50℃下加熱1h以使細胞的腈水合酶和酰胺酶活性失活。在25℃下混合0.52g(濕細胞糊)A.facilis72W細胞(ATCC 55746)在9.48mL 0.020M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中的懸浮液，所述緩沖液含有0.106mL 55wt％乙醇腈水溶液(乙醇腈在懸浮液中的最終濃度為0.10M)。2h后，乙醇腈的轉化完全，乙醇酸和乙醇酰胺的收率分別為大約61％和39％。
反應2h后，向反應混合物加入另外0.312mL 55wt％乙醇腈水溶液(向反應混合物加入另外0.30M乙醇腈，總計0.40M)。4h后，剩余大量另外的乙醇腈，乙醇酸與乙醇酰胺的濃度比為ca.3.4∶1。向反應混合物加入另外0.624mL 55wt％乙醇腈水溶液(另外0.60M乙醇腈，總計1.0M)。22h后，剩余ca.40％乙醇腈，乙醇酸與乙醇酰胺的濃度比為ca.9∶1。
實施例3使用敏捷食酸菌突變體72-PF-15(ATCC 55747)或72-PF-17(ATCC 55745)轉化乙醇腈為乙醇酸重復實施例1所述反應，但是使用突變體菌株A.facilis 72-PF-15或72-PF-17代替A.facilis 72W。將0.50g(濕細胞糊)A.facilis 72-PF-15或72-PF-17在8.44mL 0.020M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中的懸浮液置于15mL聚丙烯離心管內。然后向該管加入1.06mL55wt％乙醇腈水溶液(乙醇腈在懸浮液中的最終濃度為1.0M)，在25℃旋轉平臺上混合所得懸浮液。先將分析用懸浮液樣本(0.200mL)用6NHCl調至pH2.5以終止反應，離心，用0.2微米濾器過濾上清液。足夠的時間后，乙醇腈完全轉化為乙醇酸，沒有副產物乙醇酰胺生成。
實施例4使用大腸桿菌轉化體SS1001(ATCC PTA-1177)或SW91(ATCCPTA-1175)轉化乙醇腈為乙醇酸重復實施例1所述反應，但是使用大腸桿菌轉化體SS1001或SW91代替A.facilis 72W。將0.50g(濕細胞糊)大腸桿菌SS1001或SW91在8.44mL 0.020M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中的懸浮液置于15mL聚丙烯離心管內。然后向該管加入1.06mL 55wt％乙醇腈水溶液(乙醇腈在懸浮液中的最終濃度為1.0M)，在25℃旋轉平臺上混合所得懸浮液。先將分析用懸浮液樣本(0.200mL)用6N HCl調至pH2.5以終止反應，離心，用0.2微米濾器過濾上清液。足夠的時間后，乙醇腈完全轉化為乙醇酸，沒有副產物乙醇酰胺生成。
實施例5利用敏捷食酸菌72W的腈酶活性轉化丙酮合氰化氫為2-羥基異丁酸將0.34g(濕細胞糊)敏捷食酸菌72W細胞(ATCC 55746)在5.61mL100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中的懸浮液置于15mL聚丙烯離心管內，將細胞懸浮液在50℃下加熱0.5h(使不希望有的腈水合酶和酰胺酶活性完全失活，同時保存腈酶活性)，然后在水浴中冷卻至25℃。然后向該管加入51.0mg丙酮合氰化氫(丙酮合氰化氫在懸浮液中的最終濃度為0.10M)，在25℃旋轉平臺上混合所得懸浮液。將分析樣本(0.180mL)與0.020mL 1.0M丙酸(HPLC外標)混合，離心，用HPLC分析上清液的丙酮合氰化氫、丙酮、2-羥基異丁酸和2-羥基異丁酰胺。21h后，2-羥基異丁酸、2-羥基異丁酰胺和丙酮的收率分別為21.6％、0％和71.3％，沒有丙酮合氰化氫剩余。
實施例6使用大腸桿菌轉化體SS1001轉化丙酮合氰化氫為2-羥基異丁酸將0.66g(濕細胞糊)大腸桿菌轉化體SS1001(ATCC PTA-1177)在5.29mL 50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中的懸浮液置于15mL聚丙烯離心管內，然后加入51.0mg丙酮合氰化氫(丙酮合氰化氫在懸浮液中的最終濃度為0.10M)，在25℃旋轉平臺上混合所得懸浮液。將分析樣本(0.180mL)與0.020mL 1.0M丙酸(HPLC外標)混合，離心，用HPLC分析上清液的丙酮合氰化氫、丙酮和2-羥基異丁酸。8h后，2-羥基異丁酸、2-羥基異丁酰胺和丙酮的收率分別為23.0％、0％和65.6％，沒有丙酮合氰化氫剩余。
權利要求
1.從對應的α-羥基腈生產α-羥基酸的方法，包含(a)使α-羥基腈在適合的水性反應混合物中與以來自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的腈酶活性為特征的催化劑接觸；和(b)分離在(a)中所生成的鹽或酸形式的對應的α-羥基酸。
2.權利要求1的方法，其中該α-羥基酸是乙醇酸或2-羥基異丁酸，該對應的α-羥基腈是乙醇腈或丙酮合氰化氫。
3.權利要求1或2的方法，其中該催化劑是全微生物細胞、透化微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞組分、部分純化的酶或純化的酶的形式。
4.權利要求3的方法，其中該催化劑是全微生物細胞的形式，選自敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC55745)、被轉化以表達敏捷食酸菌72W腈酶活性的全微生物細胞和在步驟(a)之前被加熱至一定溫度的敏捷食酸菌72W，該加熱破壞腈水合酶活性和酰胺酶活性，保存腈酶活性。
5.權利要求4的方法，其中被轉化以表達敏捷食酸菌72W腈酶活性的全微生物細胞是大腸桿菌SS1001(ATCC PTA-1177)或大腸桿菌SW91(ATCC PTA-1175)。
6.從乙醇腈生產乙醇酸的方法，包含(a)使乙醇腈在適合的水性反應混合物中與以來自敏捷食酸菌72W(ATCC 55747)的腈酶活性為特征的催化劑接觸；和(b)分離在(a)中所生成的鹽或酸形式的乙醇酸。
7.從丙酮合氰化氫生產2-羥基異丁酸的方法，包含(a)使丙酮合氰化氫在適合的水性反應混合物中與以來自敏捷食酸菌72W的腈酶活性為特征的催化劑接觸；和(b)分離在(a)中所生成的鹽或酸形式的2-羥基異丁酸。
8.權利要求6或7的方法，其中以腈酶活性為特征的催化劑是全微生物細胞的形式，選自敏捷食酸菌72-PF-15(ATCC 55747)、敏捷食酸菌72-PF-17(ATCC 55745)、被轉化以表達敏捷食酸菌72W腈酶活性的全微生物細胞和在步驟(a)之前被加熱至一定溫度的敏捷食酸菌72W，該加熱破壞腈水合酶活性和酰胺酶活性，保存腈酶活性。
9.權利要求6或7的方法，其中以來自敏捷食酸菌72W的腈酶活性為特征的催化劑是大腸桿菌SS1001(ATCC PTA-1177)或大腸桿菌SW91(ATCC PTA-1175)。
10.權利要求1、2、4、5、6或7的方法，其中該催化劑是完整微生物細胞、透化微生物細胞、微生物細胞提取物的一種或多種細胞組分、部分純化的酶或純化的酶的形式。
11.權利要求8的方法，其中該催化劑被固定在可溶性或不溶性載體之中或之上。
12.被轉化以表達來自敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)的腈酶活性的宿主細胞。
13.從對應的α-羥基腈生產α-羥基酸的方法，包含(a)使α-羥基腈在適合的水性反應混合物中與權利要求10的轉化宿主細胞接觸；和(b)分離在(a)中所生成的鹽或酸形式的α-羥基酸。
全文摘要
本發明涉及使用具有腈酶活性的催化劑從對應的α－羥基腈生產α－羥基酸的方法。更具體而言，本發明涉及敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈酶水解乙醇腈為乙醇酸或者水解丙酮合氰化氫為2－羥基異丁酸的用途。使乙醇腈在水性混合物中與具有敏捷食酸菌72W腈酶活性的催化劑反應，以高濃度、高收率選擇性地得到乙醇酸。
文檔編號C12P7/54GK1549860SQ02805521
公開日2004年11月24日 申請日期2002年2月20日 優先權日2001年2月23日
發明者S·喬漢, R·迪科西莫, R·D·法倫, J·E·加瓦甘, M·S·佩尼, S 喬漢, 佩尼, 加瓦甘, 法倫, 莆髂 申請人:納幕爾杜邦公司