專利名稱：用調控方法培養體細胞胚獲得人工種子貯藏的方法
技術領域：
本發明名稱用調控方法培養體細胞胚獲得人工種子貯藏的方法，屬于生物技術細胞工程領域。
人工種子(artificialseeds)又稱人造種子(syntheticseeds)，這一概念的出現與體細胞胚的實際應用緊密相關。體細胞胚增殖快，產量大，遺傳均一同時因其是雙極性結構，可直接形成再生植株，而不必經多次繼代，分步誘導根和芽。自從Murashige(1978)在第四屆國際植物組織和細胞培養會議上，提出體細胞胚可以包理制成人工種子以來，引起了不少科研工作者的極大興趣。人工種子與天然種子類似具有三個組成部分第一部，體細胞胚，相應于天然種子的合子胚;第二部分，含有營養物質的膠衣組成的人工胚乳，相應于天然種子的胚乳部分;第三部分，種子外包有一層疏水膜以保護胚和胚乳的人工種皮，類似于天然種子的種皮。
人工種子應能象天然種子一樣貯藏、播種萌發長成正常植株，而且人工種子對于農業生產有著誘人的應用前景。其優越性在于1、它能超越天然種子的生產，而不受空間和季節氣候的影響，實現大規模工廠化機械化生產;2、在制作過程中，可包制植物生長調節劑、固氮菌和抗蟲添加劑等，從而實現播種、植保、抗逆一體化;3、對無性繁殖植物雜種后代和工程植株進行快速繁殖等等。
人工種子的這些優點受到一些國家的政府和科技人員的極大重視。美國植物遺傳公司(PGI)Redenbaugh領導的一個人工種子研究小組的科學家，從1982年起花了一年半時間篩選了100多種物質，以尋求包制人工種子用的介質。1986年報導了用海藻酸鈉(Alginate)作為人工胚乳介質，這種物質在氯化鈣溶液中固化成球。后來為大家所采用。但仍有不少缺點，如粘連，較軟，貯存后發芽率降低、易失水和營養泄漏等等。1987年Fujii等人提出，在人工胚乳外包裹一層疏水的高分子膜作人工種皮，以避免人工胚乳破碎和很快風干。1988年美國加州植物遺傳公司的Nouaille和Petiaral獲人工種子包埋2項專利Gel-Coat技術和保護性多聚物;PGI公司又與紐約的Giba-Geigy分公司協作研究除草劑、殺蟲和殺菌劑等添加物。新澤西州的DNA植物技術公司與麻薩諸塞州的阿瑟·利特爾(ArthuD·Lettle)公司協作研究生物反應器生產體細胞胚，以及Guelph大學的Mchetsic將苜蓿體細胞胚脫水狀態保存，八個月仍有正常萌發率。美國植物基因公司的口號是“將來是我們的現在”！他們的主意是“沒有完全搞成功沒有關系，先賠上千萬美元，把專利申請上，將來會發財的”。歐洲共同體也非常重視。法國是世界上最早利用植物組織培養技術進行無性繁殖，實現試管苗商品化的國家。在農作物種子出口方面，在國際市場上僅次于美國占第二位。所以對人工種子的研究很重視。在歐洲共同體內已納入尤里卡計劃生物技術的人工種子研制就有二個課題。其中西紅柿人工種子由三家種子公司投資達二千萬法幣(合人民幣1200萬)。在日本也很重視，麒麟啤酒公司與美國PGI公司合作，聯合研制生產水稻和蔬菜的人工種子。我國政府在“863”高技術生物領域中也納入了人工種子研制的課題。北京大學、中山大學、中科院的化學所、植物所和遺傳所都承擔了這項研究任務。
人工種子的研制，十多年來在體細胞胚的發生，人工種皮材料的尋找和研制，以及人工種子的貯藏和防腐等方面做了大量的工作，取得了較好的進展，制作了包括模式植物在內的近二十來種人工種子。但從總體水平看仍處于試驗階段，還存在很多技術難題。如人工種子的貯藏問題就是其中之一。以往用常規方法培養的體細胞胚是處于旺盛生長狀態，制作人工種子后很難控制住它的生長，曾用液體石蠟浸泡，低溫下存放、鋁鉑和保鮮袋等貯藏，均未達到理想的效果。后來利用脫水控制人工種的生長，但萌發率下降明顯。這方面的研究，最早(1978，1980)是用胡蘿卜愈傷組織進行的。1985年Kitto等人將胡蘿卜體細胞胚的培養物包在樹脂薄片中，26℃干燥4天后，20個薄片中得到2棵植株，但未包的胚干燥后未成活。Gray等人(1987，1989)先后將鴨茅和葡萄體細胞胚脫水至天然種子含水量(12%)，然后在室溫23℃貯存21天，首次從單個未包裹的體細胞胚獲得再生植株以來，目前對貯藏研究較多的集中在體細胞胚上。Sanaratna等人(1989，1991)對紫花苜蓿和油菜小孢子胚，在脫水前用ABA處理，提高體細胞胚對脫水的忍耐力，他們認為苜蓿使用最適濃度為10μM。而油菜2-4mm的子葉期胚處理最適濃度為50μM。并對胚進行了熱激和冷激處理，認為熱激具ABA類似的效果。Anandarajsh等人(1990，1991)采用通過改變發育和成熟培養基中蔗糖、麥芽糖和銨離子濃度，企圖來提高胚對脫水的忍耐力。他們認為當蔗糖濃度由3%增加到6%時，能提高體細胞胚籽苗的活力，而不降低胚的產量和同步性。他們采用熱激(36℃10分鐘→30℃4分鐘→25℃10小時)與高蔗糖相結合的處理或在培養基中加10-5M ABA與高蔗糖結合處理，認為可提高苜蓿體細胞胚對干燥的忍耐力。但是他們報導體細胞胚在6%蔗糖的培養基上處理4天，經干燥后成活力和植株轉換率均為零，而熱激能提高存活力和植株轉換率。因此，他們認為迄今為止，熱激最有希望代替ABA。因為熱激可誘導蛋白質的瞬時合成，以適應壓力(Abernethy al et 1989)。最近，Fujii等人(1992)報導，將在含有5μM ABA的培養基上，25℃黑暗處理4星期左右的苜蓿體細胞胚，再轉換在含100μM GA3(24℃散射光下)的SH培養基上預發芽2-4天苜蓿體細胞胚用海藻酸鈉包裹。他們把包裹的和露裸的苜蓿體細胞胚同時播于大田與室內混合土盆栽進行比較觀察。未包的播于大田并覆蓋塑料杯的植株轉換率為25%，而播于室內混合土盆中的植株轉換率則為60%;而經包裹的體細胞胚植株轉換率分別為23%和40%。未包裹的體細胞胚播于大田并覆蓋塑料和尼絨布的植株轉換率分別為13%和9%;而經包裹的胚則分別為5%和14%。但播于大田未加任何覆蓋的植株轉換率僅為1%，這些最新資料表明，盡管研究者在包裝和播種處理方面做了很多嘗試，但并沒有涉及人工種子的貯藏問題。
本發明專利的目的及創新之點在于通過調控培養的方法獲得具有高活力的靜止狀態的胚。這為人工種子提供了一條胚貯藏的新途徑。由于是靜止狀態，在貯藏過程中無需特殊條件的控制，方法簡易、貯存容積小。
本發明的內容及方案1.調控培養對胡蘿卜體細胞胚生長發育的影響通過正常培養細胞大量增殖后，分成二組，一組仍作正常培養為對照組，另一組以提高懸浮培養基中的蔗糖濃度作調控培養，當培養10-20天時，處理組經調控培養全部胚處于Ⅲ級球形胚，而正常培養的對照組只有28.3%處于Ⅲ級小胚，多數為Ⅰ、Ⅱ級的子葉胚和魚雷胚。當培養45-55天時，對照組全部分化成具根芽的植株，而經調控培養的仍有74.8%處于Ⅲ級胚，Ⅰ、Ⅱ級胚總共為25.2%。由此可見，調控培養延緩了體細胞胚的生長發育的速度，同時也抑制了胚根的伸長。經110-130天的觀察調控培養中的體細胞胚仍無胚根伸長。調控培養有效地抑制了初生體細胞胚和高度同步化的次生體細胞胚的胚根伸長，使胚處于相對靜止狀態。
2.靜止狀態胚的特點靜止狀態胚短粗、手感硬呈鮮黃色;細胞排列致密，液泡消失，淀粉等貯存物質增多;鮮重比對照胚高2.12倍，干物質高3.8倍。調控培養45-50天時，淀粉積累達高峰，相當于對照組的1.9倍，而可溶性糖60-70天時達到高峰，相當于對照組的1.7倍。靜止狀態胚呼吸一直較低，僅為對照組最高時的1/40。
3.靜止狀態胚抗逆性強靜止狀態胚在含水量54%，室溫貯存4-5個月，植株轉換率為78%，而對照組貯存一個月便全失去活力。經慢脫水至17%，室溫貯存4-5個月，植株轉換率為67%，而正常培養的對照組不經貯存即失去活力。由此可見，調控培養的靜止狀態的體細胞胚具耐脫水和貯存抗逆性強之優點。而最為突出的優點是，由于生理上處于靜止狀態，胚根不伸長，在含水量較高(50%左右)的室溫下，也能貯存，而且植株轉換率較干胚還高。貯存過程無需特殊條件來控制胚的生長。
從經貯存的靜止狀態胚與正常培養未經貯存對照組胚的苗期生長來看，正常植株率前者比后者高1.4倍，植株高度為2倍，真葉數為10倍，根和根系均比對照組好，植株生長健壯。
優點及效果綜上所述，由調控培養法獲得的靜止狀態的體細胞胚，為人工種子有效貯藏開辟了胚貯藏的新途徑。我們認為，只要建立好的體細胞胚的發生系統，采用我們提供的調控培養方法，適時地轉入調控培養，即可獲得適于貯藏的具高活力的靜止狀態的體細胞胚。
實施例1材料日本用商用胡蘿卜(DaucascarotaL.)品種日本國分大長人參。
1.愈傷細胞的誘導，將胡蘿卜種子表面消毒后，播種在1/2MS瓊脂培養基上發芽，取5-7日齡實生苗的下胚軸和子葉，切成3-4mm的片段，接種在附加有1.5-2.0mg/L2.4-D的MS固體培養基上誘導愈傷細胞。
2.正常懸浮培養。取誘導8-12天膨大切段作起始材料，按每瓶6-8切段的接種量，轉接在裝有35ml的20-35S培養基(含20-35克/升蔗糖的MS無激素培養基)的100ML三角瓶中，置24-27℃下，以90-100rpm的轉速振蕩培養。每隔6-8天更換一次新鮮培養基。
3.調控培養。在正常培養10-20天后，細胞增殖加快。細胞長成形態小內含物豐富的胚性細胞團，當球形胚出現時，轉入高蔗糖40-60克/升(即每升含40-60克蔗糖的MS無激素培養基)的調控培養，(定時觀察胚的生長狀態)。其他培養條件同上述2，每隔6-8天更換一次培養基。調控培養時期體細胞胚生長發育延緩，細胞排列變致密，液泡逐漸消失，貯存物質增多，胚的硬度加大，胚根伸長受抑制處于呼吸較低的靜止狀態。
4.收獲靜止狀態胚。調控培養50-90天，體細胞胚包括初級體細胞胚和次生體細胞胚已處于胚根受抑制的靜止狀態，淀粉及可溶性糖已達高峰期后，及時收獲。經無菌濾紙吸干，放置無菌瓶中，用封口膜封住瓶口，室溫下貯存(有條件也可放在冰箱4℃貯存)，供制作人工種子或胚播種用。
實施例2材料美國商用胡蘿卜品種DanversHalflong。
1.愈傷細胞的誘導。種子經表面消毒后(70%酒精1分鐘，0.1%HgCl12分鐘)后播種在雙層濕濾紙上發芽，取5-6日齡的實生苗子葉或胚軸，切成3-4mm的片段，在含1-1.5mg/L2.4-D的MS固體培養基上誘導愈傷細胞，每20天左右繼代1次。
2.正常懸浮培養。取繼代2-3次疏松愈傷細胞作懸浮培養的起始材料，按每瓶200mg愈傷細胞的接種量，接種在裝有35ml的20-35S(含20-35克/升蔗糖的MS無激素培養基)的100ML三角瓶中，置24-27℃下，以90-100rpm的轉速振蕩培養。每隔6-8天更換一次新鮮培養基。
3.調控培養。在正常培養10-15天后，細胞增殖加快。細胞長成胚性細胞團，球形胚立即出現時，提高蔗糖濃度為70-90S(即每升含70-90克蔗糖的MS無激素培養基)進行調控培養，培養條件同正常培養。每隔6-8天更換一次新鮮培養基。隨著胚的生長及時分瓶或轉250ml錐形瓶進行培養。進入調控培養，體細胞胚的生長發育速度延緩，細胞逐漸脫水，液泡變小細胞排列致密硬度加強，內部貯存物質增多而呼吸降低胚伸長受抑制。
4.收獲靜止狀態的體細胞胚。經50-90天調控培養，初級體細胞胚和大量同步的次生體細胞胚均處于胚根生長受抑制的靜止狀態。淀粉和其他貯存物質已達到高峰期。及時收獲，經過濾收獲，濾紙吸干置無菌燒杯中，用封口膜封住燒杯口放置室溫貯存。
權利要求
1.一種用調控方法培養體細胞胚獲得人工種子貯藏的方法，其特征在于所述方法包括(1)取材日本商用胡蘿卜(Daucas carotaL·)品種日本國分大長人參；(2)愈傷細胞的誘導，將胡蘿卜種子表面消毒后，播種在1/2MS瓊脂培養基上發芽，取5-7日齡實生苗的下胚軸和子葉，切成3-4mm的片段，接種在附加有1.5-2.0mg/L，2.4-D的MS固體培養基上誘導愈傷細胞；(3)正常的懸浮培養，取上述(2)中誘導8-12天膨大切段作起始材料，按每瓶6-8切段的接種量轉接在裝有35ml的20-35S培養基(含20-35克/升蔗糖的MS無激素培養基)的三角瓶中，在24-27℃下，以90-100rpm的轉速振蕩培養。每隔6-8天更換一次新鮮培養基；(4)調控培養，按上述(3)培養10-20天后，當球形胚出現時，轉入高蔗糖40-90(即每升含40-90克蔗糖的MS無激素培養基)的培養基中進行調控培養，其他培養條件同上述(3)，每隔6-8天更換一次培養基；(5)收獲靜止狀態胚，按上述(4)調控培養50-90天后及時收獲，用無菌濾紙將體細胞胚(包括初級體細胞胚和次生體細胞胚)吸干，放置無菌瓶中，用封口膜封住瓶口在室溫或冰箱3-6℃貯存，供制作人工種子或胚播種使用。
2.根據權利要求1(1)中所述用調控方法培養體細胞胚獲得人工種子貯藏的方法，其特征在于取材為美國商用胡蘿卜品種Danvers Half long。
3.根據權利要求1(3)中所述用調控方法培養體細胞胚獲得人工種子貯藏的方法，其特征在于作正常懸浮培養時起始材料為繼代2-3次疏松愈傷細胞。
4.根據權利要求1所述用調控方法培養體細胞胚獲得人工種子貯藏的方法，其特征在于對已建立了懸浮培養能獲得大量的高質量的體細胞胚的農業作物以及蔬菜類品種，采用此調控培養方法就可以得到靜止狀態的體細胞胚。
全文摘要
采用我們發明的調控培養方法，使懸浮培養中的體細胞胚生長發育延緩，獲得呼吸較低，胚根生長受抑制的靜止狀態的體細胞胚。其特點是胚的細胞排列致密硬度增大；貯存物質積累增多，抗逆性強；脫水至含水量為50％左右，貯存4個月植株轉換率為78％；脫水至含水量17％，貯存4個月植株轉換率為67％；經貯存后的胚生長的植株較常規培養的體細胞胚生長的植株健壯。這種靜止狀態的體細胞胚具有耐貯藏容積小，無需特殊條件控制等優點，為人工種子貯存問題開辟了新途徑。
文檔編號C12N5/04GK1074482SQ9310027
公開日1993年7月21日 申請日期1993年1月15日 優先權日1993年1月15日
發明者黃美娟, 黃紹興, 朱澄, 蘇都莫日根 申請人:北京大學