專利名稱：一種橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發生植株再生方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組織培養方法，具體地說，涉及一種以橡膠 樹試管苗無菌根作為外植體，通過體細胞胚發生途徑獲得再生植株的方法。
背景技術：
橡膠樹是多年生的異花授粉喬木，栽培于熱帶地區。橡膠樹的主 產品天然橡膠是重要的工業原料和戰略物資，在國民經濟中占有重要 地位。由于我國熱帶地區可種植橡膠樹的土地資源有限，且天然橡膠 屬于不可替代的稀缺資源。因此，選育和推廣高產橡膠樹，是提高單 位面積產量、確保我國天然橡膠總產量逐步提高的關鍵。
隨著植物組織培養技術的發展，從上世紀七十年代以來，橡膠樹 組織培養技術也蓬勃開展，以期利用生物技術拓寬橡膠樹育種途徑， 改良其性狀，加速育種進程。目前橡膠樹不同外植體來源的組織培養， 如花藥、未授粉胚珠、子房、內珠被、子葉培養均獲得成功，獲得了 再生植株。但橡膠樹根的組織培養還未見報道。
在其它植物中，從木本植物的根進行離體培養研究成功地誘導出
再生植株的報道較少。1990年Son等用銀白楊試管苗的根系切取外植 體，經組織培養得到了再生植株。1991年法國的Pedrotti等進行了櫻桃 的根系離體培養，通過間接愈傷組織誘導和直接芽誘導，成功地培養 出植株。1992年Bhat等切取酸檸檬的根在MS培養基中進行組織培養， 有低頻的植株再生。1996年Sankhla等把合歡種子在無菌條件下誘導 萌發，取15 20天齡的幼苗的根作為外植體，經組織培養得到再生植 株。
在橡膠樹栽培實踐中，最早使用的種植材料是實生樹，實生樹來自自然授粉的種子，具有生長快、經濟壽命長、抗逆性強的優點，但 存在株間差異大、平均產量低(僅為芽接樹的1/3)、不能保持母本優 良性狀的缺點。
目前生產上普遍種植芽接樹，使用的橡膠樹繁殖的主要方法是嫁 接，即橡膠樹種植材料主要是用芽接苗；芽接樹減少了株間產量的差 異，大幅度提高了產量。但是砧木與接穗間存在相互作用，砧木對接 穗的影響不僅表現在生長、產量、生理生化特性及組織結構上，而且 還表現在內源植物激素方面，產量的變化與內源激素之間存在某種 聯系。
近年來，發現一些具有優良性狀的砧木，對芽接樹的產量、抗寒、 速生等性狀有重要影響。 一般在我國大規模種植的高產橡膠樹品種如
熱研7-33-97，單株年產干膠6 7公斤。但目前在云南發現有些品種有 超高產的橡膠樹，單株年產干膠100公斤以上，在西雙版納傣族自治 州景洪巿也有單株年產干膠98公斤的橡膠樹。橡膠樹育種工作者取一 些超高產橡膠樹的芽條與實生苗砧木進行嫁接后，并未發現嫁接苗長 大后在產量上出現超高產的情況。
從同一母本植株取芽條進行嫁接的芽接樹，其接穗的遺傳性狀是
相同的；而作為砧木的實生苗，由種子萌發而來，在有性生殖過程中 發生了基因分離，因而實生苗砧木的遺傳背景差別很大。芽接樹成年 后，普通高產橡膠樹之間產量差別小，但超高產橡膠樹和普通高產橡 膠樹之間產量差別則很大，相差幾倍到十幾倍，這與砧木的遺傳性狀 有關。
在科研和生產過程中，迫切需要對這些具有優良性質的砧木進行 擴大繁殖。但由于確定砧木具有優良品性要等到開割以后，需要7年 以上時間，此時在砧木上難以找到芽點或芽眼，優良砧木難以通過常 規育種方法擴大繁殖。

發明內容
本發明的目的是利用橡膠樹優良品種的試管苗無菌根為外植體， 經體細胞胚發生途徑獲得再生植株，以建立優良砧木離體培養無性繁 殖體系、獲得在遺傳上整齊一致的砧木。
為了實現本發明目的，本發明所述的橡膠樹試管苗無菌根體細
胞胚發生植株再生方法，包括如下步驟
1) 根的選擇和處理選取橡膠樹花藥培養經過胚狀體發生途徑 得到的試管苗的無菌幼根，切成長度約1.0~ 1.5cm的根段；
2) 愈傷組織的誘導和繼代培養把根段接種于胚性愈傷組織誘 導培養基，暗培養25 -40天；然后轉入繼代培養基，暗培養15-30 天，培養溫度為25~28°C;
3) 體細胞胚的誘導將繼代培養后的胚性愈傷組織轉移到體細 胞胚誘導培養基，進行暗培養20 50天，培養溫度為25-28°C，以 誘導出體細胞胚；
4) 植株再生再將成熟體細胞胚轉移到出苗培養基，光照培養， 培養溫度在25 28。C之間，培養20 50天，長成完整植株。
本發明所述的根的選擇和處理，是選取長勢較好，且來源于性 狀優良的橡膠樹品種，經過橡膠樹花藥培養胚狀體發生途徑得到的 試管苗的無菌幼根，直徑為0.8-1.2mm，切成長度為1.0 ~ 1.5cm的 根段，作為根段外植體材料，用于誘導胚性愈傷組織。
本發明所述的愈傷組織的誘導和繼代培養是將根段外植體接 種于胚性愈傷組織誘導培養基，進行暗培養，誘導出胚性愈傷組織。 培養溫度為25~28°C，暗培養25 40天，根段在胚性愈傷組織誘導 培養基中膨大，部分愈傷化，出現白色非胚性愈傷組織和鮮黃色胚 性愈傷組織。
然后將鮮黃色胚性愈傷組織轉入繼代培養基，進行暗培養，培 養溫度為25-28。C，暗培養15 30天。鮮黃色胚性愈傷組織進一步增殖。
本發明所述的愈傷組織誘導培養基為改良的MS培養基，將MS
培養基中的無水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、七水硫酸鎂的含
量調整為無水氯化鈣150~400mg/L、磷酸二氫鉀350 ~ 500mg/L、四 水硫酸錳15 ~ 40mg/L、七水硫酸鎂400 ~ 600mg/L;并添加2,4-D( 2,4-二氯苯氧乙酸)1 ~ 5mg/L、KT( 6-糠氨基嘌呤，又名激動素)1 ~ 5mg/L、 6-BA ( 6-節氨基嘌呤)0.5 ~ 5.0mg/L、 Phytagel (植物凝膠)2 ~ 3g/L、 蔗糖50 ~ 90g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
所述的繼代培養基為改良的MS培養基，并添加2,4-D 1 ~ 3mg/L、 KT l~3mg/L、 NAA (萘乙酸)l~3mg/L、 Phytagel 2~3g/L、蔗糖 5 0 ~ 90g/L 、椰子水40 ~ 90ml/L 。
本發明所述的體細胞胚的誘導是將鮮黃色胚性愈傷組織經過繼 代培養后，轉移到體細胞胚誘導培養基上進行暗培養，以誘導出體細 胞胚，暗培養20 50天，培養溫度為25~28°C。鮮黃色胚性愈傷組
織表面出現了長勢旺盛的乳白色的小體細胞胚， 一 塊胚性愈傷組織可 誘導出一至數十個體細胞胚。體細胞胚在此培養基上可進一步發育。 所述的體細胞胚誘導培養基是改良的MS培養基，并添加6-BA 0.5 ~ 2.0mg/L、 KT 0.5 ~ 3.0mg/L、 NAA 0.1 ~ 1.0mg/L、 GA3 0.1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2 ~3g/L、蔗糖50 90g/L、活性碳1 ~ 2g/L、椰子 水40 ~ 90ml/L。
本發明所述的植株再生方法，是將成熟子葉型體細胞胚轉移到出 苗培養基，光照培養，以促其萌發，長成完整植株，培養溫度為25 28°C,培養20-50天。
所述的出苗培養基為改良的MS培養基，并添加KT 0.5 ~ 4.0mg/L、 NAA0.1 ~ 1.0mg/L、 GA3 (赤霉素)0.1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2~3g/L、蔗糖50-90g/L、活性碳1-2g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
本發明以橡膠樹根為外植體材料建立的植株再生體系，為橡膠樹研究領域一直關心的砧穗關系開辟了新的研究途徑。橡膠樹的砧木一 直釆用實生苗，遺傳背景差異大，用高產芽接樹的根通過組織培養方 法建立砧木自根無性系，可以為研究和生產提供優良砧木材料，為研 究砧木和接穗相互作用提供實驗系統，為選擇最優的砧穗組合提供了 可能，為研究橡膠樹超高產的機理打下基礎。
本發明設計的愈傷組織誘導、繼代培養、體細胞胚誘導和分化出 苗培養基和添加物及培養條件，適合于橡膠樹品種用本發明方法培養 出再生植株。
本發明工藝流程簡單，成本低，體細胞胚誘導率高，再生植株健 壯，具有很好的應用前景。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。 實施例l
預先按要求配制好各種培養基。選取長勢較好，且來源于性狀優
良的橡膠樹品種(如橡膠樹無性系熱研87-6-62),經過橡膠樹花藥培 養胚狀體發生途徑得到的試管苗的幼根，直徑為lmm，在無菌條件 下切成長度為1.2cm的根段。
把根段接種于愈傷組織誘導培養基，暗培養25天，培養溫度為 26±rC,以誘導出愈傷組織。所述愈傷組織誘導培養基為改良的MS 培養基，將MS培養基中的無水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、 七水硫酸鎂的含量調整為無水氯化鉤250mg/L、磷酸二氫鉀400mg/L、 四水硫酸錳35mg/L、七水硫酸鎂500mg/L,并添加2，4-D 4mg/L、 KT 2.5mg/L、 6-BA3mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖70g/L、椰子水50ml/L。
把誘導出的鮮黃色愈傷組織轉入繼代培養基進行暗培養，培養溫 度為26士rC，暗培養15 30天，鮮黃色胚性愈傷組織進一步增殖。 所述繼代培養基為改良的MS培養基，添加2，4-D 2.5mg/L、KT 2mg/L、 NAA2mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖70g/L、椰子水50ml/L。再把經過繼代培養誘導出的鮮黃色胚性愈傷組織轉移到體細胞
胚誘導培養基上，進行暗培養30天，培養溫度為26士rc,以誘導出
體細胞胚。體細胞胚在體細胞胚誘導培養基上可以進一步發育，生長
為成熟的體細胞胚。體細胞胚誘導培養基為改良的MS培養基，添加 6-BA lmg/L、 KT 1.5mg/L、 NAA 0.5mg/L、 GA3 0.5mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖70g/L、活性碳lg/L、椰子水50ml/L。
最后將成熟子葉型體細胞胚轉移到出苗培養基上，光照培養，培 養溫度為26±1°C,以促其萌發，長成完整植株。成熟的子葉型體細 胞胚轉入出苗培養基后，20天后開始陸續萌發，形成的再生小植株 健壯、主根發達。出苗培養基為改良的MS培養基，添加KT1.5mg/L、 NAA 0.5mg/L、 GA3 0.5mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖70g/L、活性碳lg/L、 椰子水50ml/L。
雖然，上文中已經用 一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳 盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本 領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎 上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1. 一種橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發生植株再生方法，其特征在于，包括如下步驟1)根處理選取橡膠樹花藥培養經過胚狀體發生途徑得到的試管苗的幼根，直徑為0.8～1.2mm，切成長度為1.0～1.5cm的根段；2)胚性愈傷組織的誘導和繼代培養把根段接種于胚性愈傷組織誘導培養基，暗培養25～40天，誘導出胚性愈傷組織；再轉入繼代培養基，暗培養15～30天，培養溫度為25～28℃；3)體細胞胚的誘導將繼代培養后的胚性愈傷組織轉移到體細胞胚誘導培養基，培養溫度為25～28℃，暗培養20～50天，誘導出體細胞胚；4)植株再生再將成熟體細胞胚轉移到出苗培養基，光照培養，培養溫度為25～28℃，培養20～50天，長成完整植株。
2. 根據權利要求l所述的橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發生植株 再生方法，其特征在于，所述胚性愈傷組織誘導培養基為改良的MS 培養基，將MS培養基中的無水氯化鈣、磷酸二氫鉀、四水硫酸錳、 七水硫酸鎂的含量調整為無水氯化鉤150 ~ 400mg/L、磷酸二氫鉀 350~ 500mg/L、四水硫酸錳15 ~ 40mg/L、七水硫酸鎂400 ~ 600mg/L， 并添加2，4-D 1 ~ 5mg/L、 KT 1 ~ 5mg/L、 6-BA0.5 ~ 5.0mg/L、 Phytagel 2~3g/L、蔗糖50 90g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
3. 根據權利要求l所述的橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發生植株 再生的方法，其特征在于，所述繼代培養基為改良的MS培養基，添 加2，4-D 1 ~ 3mg/L、 KT 1 一 3mg/L、 NAA 1 ~ 3mg/L、 Phytagel 2 3g/L、 蔗糖50 90g/L、椰子水40 90ml/L。
4. 根據權利要求l所述的橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發生再生 植株的方法，其特征在于，所述體細胞胚誘導培養基為改良的MS培 養基中添加6-BA 0.5 ~ 2.0mg/L、 KT 0.5 ~ 3.0mg/L、 NAA 0.1 ~/L、 GA3 0.1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2 ~ 3g/L、蔗糖50 90g/L、活 性碳l ~ 2g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
5.根據權利要求1所述的橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發生植 株再生方法，其特征在于，所述出苗培養基為改良的MS培養基中添 加KT 0.5 ~ 4.0mg/L、 NAAO.l ~ 1.0mg/L、 GA3 0,1 ~ 1.0mg/L、 Phytagel 2 ~ 3g/L、蔗糖50 ~ 90g/L、活性碳1 ~ 2g/L、椰子水40 ~ 90ml/L。
全文摘要
本發明提供了一種橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發生植株再生方法，主要包括選擇橡膠樹試管苗無菌幼根，直徑為0.8～1.2mm，切成長度為1.0～1.5cm的根段，在胚性愈傷組織誘導培養基暗培養25～40天；再轉入繼代培養基，暗培養15～30天；然后轉移到體細胞胚誘導培養基暗培養20～50天；最后轉移到出苗培養基，光照培養，培養20～50天，培養溫度為25～28℃，長成完整植株。本發明所提供的橡膠樹試管苗無菌根體細胞胚發生植株再生方法，工藝流程簡單，可以取用優良橡膠樹品種的樹根為外植體，經體細胞胚發生途徑誘導再生植株，建立優良砧木離體培養無性繁殖體系。
文檔編號C12N5/04GK101411306SQ20081022600
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月3日 優先權日2008年11月3日
發明者波 于, 周權男, 孫愛花, 哲 李, 林位夫, 汪秀華, 黃華孫, 黃天帶 申請人:中國熱帶農業科學院橡膠研究所