一種國槐子葉體細胞胚誘導的快速繁殖方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種國槐子葉體細胞胚誘導的快速繁殖方法，屬于植物生物技術領 域。
【背景技術】
[0002] 國槐（Sophora japonica Linn)，別名家槐、中國槐，屬蝶形花亞科、槐屬，是理想 的行道樹種和庭院綠化樹種。而且，國槐材質優良，花、果實、根皮、樹皮可入藥，種子可榨油 制皂，具有較高的經濟價值，應用前景十分廣闊。同時，國槐又是嫁接龍爪槐、金枝槐、聊紅 槐、蝴蝶槐等觀賞品種的唯一砧木樹種，苗木需求大。國槐主要以種子繁殖為主，但其開花 結果具有大小年現象，且種子易受病蟲害危害，干癟、空洞現象嚴重。常規的育種方法，依靠 種子或扦插繁殖，難以滿足生產的需求。
[0003] 近年來，利用生物技術培育具有抗性如抗逆、抗蟲、抗病等新型品種是國槐育種的 新趨勢。到目前為止，對槐樹的形成層培養、莖培養、葉片培養、胚培養、未授粉子房的培養 均已獲得了完整的植株，對原生質的培養也取得了一定的進展。袁秀云等利用國槐的子葉 和下胚軸產生了不定芽，王喆之等利用花藥培養形成了單倍體植株，Han K. H等（1993， 1997)將直徑為0.5~1.0cm的枝條消毒后，取出形成層接入愈傷誘導培養基中誘導愈傷，再 將愈傷組織轉入分化培養基中，獲得了叢生芽，將成苗轉入生根培養基中，可誘導生根。上 述的方法存在的缺點：由于國槐為多年生木本植物，其再生率普遍較低，出芽少，直接影響 了國槐的遺傳轉化。利用植物體胚誘導技術不但能達到保存母株優良基因、快速繁育的目 的，還是提高基因遺傳轉化或誘變育種的重要途徑。目前，有關國槐的體細胞胚誘導技術研 究的較少，可以參考的現有技術比較少。查閱文獻，可以看到別的樹種也有人在做體胚誘 導，國槐為多年生喬木，基因組龐大，鑒于基因型的限制，沒有參考價值。
[0004] 國槐的離體葉片、根尖等均可誘導產生胚狀體。其前提條件是首先要建立一個穩 定的高頻再生系統，只有這樣，才能提供充足的無菌離體材料。在山東地區，國槐小峰的危 害非常嚴重，要采集國槐種子，必須在國槐花序剛剛形成花蕾時采集，必須在國槐花序剛剛 形成開始至授粉形成果莢期間在要采摘的國槐樹及其周邊均要噴灑農藥，防止國槐小蜂寄 存在種子中。果莢膨大成熟后，既可米收種子。專利CN 102499086 A公開了一種刺槐的繁殖 方法，由于國槐與刺槐分屬不同的屬，物種差別較大，不能參考刺槐莢果的體細胞培養方法 得到國槐子葉的體細胞培養。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的就是為了解決上述問題，提供一種國槐子葉體細胞胚誘導的快速繁 殖方法，以解決國槐再生率低下的問題。
[0006] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0007] -種國槐子葉體細胞胚誘導的快速繁殖方法，包括以下步驟：
[0008] (1)將國槐子葉接種在體細胞胚誘導培養基上培養形成愈傷組織，所述體細胞胚 誘導培養基為：Α+3·0~5.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸）+0.5~l.Omg/L BA+0.5~ 1.0mg/L NAA(蔡乙酸）+0.1 ~0.5mg/L TDZ+0.5~1.0mg/L谷氛醜胺+0.5~1.0mg/L CH(水 解酪蛋白）+5 · Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0009] (2)將上述愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基上，培養形成叢生芽小苗，所述不定 芽誘導培養基為：A+0 · 1~0 · 5mg/L ΒΑ+0 · 1~0 · 5mg/L ΝΑΑ+0 · 5~1 · Omg/L谷氛醜胺+0 · 5~ 1 · Omg/L CH(水解酪蛋白）+5 · Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0010] (3)將叢生芽小苗切成愈傷塊轉接到試管苗增殖培養基上進行增殖快繁培養，所 述試管苗增殖培養基配方:MS+1.0~2. Omg/L BA(6-芐基腺嘌呤)+ 1.0~2. Omg/LIBA(吲哚 丁酸)+5 · Og/L 瓊脂+30g/L 蔗糖，pH值5 · 8 ~6 · 0;
[0011] (4)將增殖培養的叢生芽從基部切開，轉入壯苗培養基中，進行壯苗培養，所述壯 苗培養基為:MS+5 · Og/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH值5 · 8~6 · 0;
[0012] (5)將壯苗培養后的小苗切成單株轉接到生根培養基上培養后，即可煉苗移栽，所 述生根培養基為：1/2MS+0· 1 ~0·5mg/L ΙΒΑ+0~0·05mg/L NAA+5·0g/L瓊脂+20g/L蔗糖，pH 值5.8~6.0，所述I/2MS是MS全量減半。
[0013] (6)煉苗移栽。
[0014]優選:所述國槐子葉的采集方法：
[0015] (1)選取當年生國槐種子(優選：國槐種子為無病蟲害的當年成熟種子，用洗潔精 仔細清洗后，流水沖洗1小時。優點：以減少外植體消毒過程中的污染。），去除果莢，清洗干 凈后準備消毒；
[0016] (2)將國槐種子消毒（優選：于超凈工作臺上，用體積分數為70%酒精浸泡30~ 60s，無菌水沖洗2~3次，再用質量分數為0.1%升汞(氯化汞)溶液消毒8~12min，然后用無 菌水沖洗4~6次。）后，用手術刀片和鑷子輕輕剝去種皮，將子葉取出，用手術刀劃3~4個傷 □ 〇
[0017] 優選:上述各步驟中培養條件除特殊說明外，均為培養室溫度白天25±2°C，夜晚 18 ± 2 °C，光照強度1000~15001X，光照時間16h/d。
[0018]優選:A配方為改良過的MS與B5培養基組合，包括MS培養基中的常量營養元素、微 量營養兀素和B5培養基的有機試劑。
[0019] 優選:MS培養基包括常量營養元素、微量營養元素和有機試劑。
[0020] 優選:所述MS培養基的常量營養元素的組分和其對應的濃度如下:硝酸鉀1900mg/ L，硝酸銨1650mg/L，七水硫酸鎂370mg/L，無水磷酸二氫鉀170mg/L，二水氯化|丐44〇11^凡，乙 二胺四乙酸二鈉37 · 3mg/L，七水硫酸亞鐵27 · 8mg/L。
[0021] 優選：所述MS培養基的微量營養元素的組分和其對應的濃度如下：四水硫酸錳 22.311^/1^，硫酸鋅8.611^/1^，硼酸6.211^/1^，碘化鉀0.8311^/1，鉬酸鈉0.2511^/1^，硫酸銅 0 · 025mg/L，氯化鈷 0 · 025mg/L。
[0022] 優選:A配方所述的B5有機試劑的組分和其對應的濃度如下：鹽酸硫胺素100mg/L， 煙酸I 〇mg/L，鹽酸吡咳醇10mg/L，肌醇1000mg/L。
[0023]優選:所述MS培養基的有機試劑的組分和其對應的濃度如下:甘氨酸20mg/L，鹽酸 硫胺素 l〇mg/L，煙酸1 · 0mg/L，鹽酸吡咳醇1 · 0mg/L，肌醇100mg/L。
[0024]優選:步驟(8)中煉苗移栽的具體步驟為:將試管苗封口膜綁繩松開，在培養室適 應1~2d，轉入遮光度50%的溫室中，去掉封口膜，煉苗2~3d，待小苗葉片上的氣孔可自主 開合后，用鑷子輕輕將小苗夾出，清水洗去基部殘留的培養基，移栽到裝有混合育苗基質的 花盆中，保持相對濕度在80%以上。
[0025]優選：所述花盆混合育苗基質的成分以體積比計為：珍珠巖：鋸末：腐殖土 = 30: 30:40。
[0026]優選:利用間歇噴霧裝置或人工噴水保持相對濕度。具體要求為:噴水一定為非常 細小的霧狀水，使葉面保持濕潤，而花盆中基質狀態為用手攥不滴水，松手不散開。如此馴 化煉苗5~IOd后，長出新根，新芽萌出，逐漸減少饒水次數并進行常規管理。
[0027]本發明的有益效果：
[0028] 體細胞胚發生的因素包括內因和外因，內因包括物種和基因型，外因主要涉及培 養基中附加成分的種類和濃度。即使是同一屬的植物，由于基因型不同，體細胞胚發生頻率 相差極大，原因如下：一是不同基因型體細胞胚發生頻率不同，二是不同基因型的最適誘導 條件不同。外植體的生理狀態和發育程度都直接影響體細胞胚的發生，一般生理代謝旺盛 而分化程度較低的組織有利于體細胞胚的誘導。
[0029] 對于體細胞胚誘導的快速繁殖方法所使用的培養基中必需的生長素、細胞分裂 素、赤霉素、脫落酸，還原性氮鹽和外源氨基酸，PH值，光照、溫度等其他因素，他們的作用方 向、作用程度都不相同。誘導植物體細胞胚發生的因素眾多，但它們的作用程度不盡相同， 各種因子通過轉錄與翻譯水平復雜而精確地調控，使體細胞胚發生的相關基因在時間上和 空間上得以選擇性激活和表達，只有各種因素配合使用時才能快速、高效地誘導出體細胞 胚。
[0030] 發明人綜合考慮