專利名稱：控制誘導體細胞突變的方法及其在蛋白質組學中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物學，更特別地涉及采用對生物界特異定向突變的調整領域。更具體地，本發明涉及活體外誘導體細胞突變，以及這樣一種技術在今后有可能獲得改進而得到的應用。
對于一種特別實施方式，本發明涉及對BL2 Burkitt淋巴瘤的誘導突變。
本發明的技術背景為了簡化起見，下文涉及BL2 Burkitt淋巴瘤。但應強調這只是便于公開所涉及的技術和要求保護的發明構思，并不因此而限制本發明。
BL2I型Burkitt淋巴瘤細胞系具有中心母細胞(centroblastiques)的B細胞特性。這種細胞系是生發中心中心母細胞的最接近永生相應物。已通過在Burkitt淋巴瘤免疫球蛋白VH基因中存在的體細胞突變證實了其生發中心源。
著重指出了在適當培養物中BL2細胞的同質性和穩定性(Denépoux S.等人，《免疫(immunity)》，第6卷，第35-46頁，1997年)。曾提出，按照中心母細胞表型應認為，BL12是由經受多個體細胞突變段的生發中心中心母細胞轉變得到的。
另外，估計B細胞在中心母細胞段經受超突變(Pascual V.等人，《J.Exp.Med.》，180，329-339(1994))。
用T-相關抗原刺激B細胞后，在生發中心發生免疫球蛋白的過突變現象。
特別地，Denépoux S.等人(同前述)確定了，淋巴瘤細胞，尤其是BL2細胞在其表面受體聚集和與T-輔助細胞或擴增細胞共培養后，在培養一星期后可能啟動超突變過程。由這篇文章可得出，正是通過重復激活BL2細胞，可以增加這種細胞的突變頻率。這些作者還強調指出，在活體外內誘導BL2突變不影響IgM的不變區，沒有顯示出由抗原定向的選擇性。
Yélamos J等人在《自然(Nature)》，第376卷，第225-229頁(1995)中也描述了一些實驗，這些實驗易于證明免疫球蛋白的V基因片段對于超突變不是必不可少的，還證明構建人工突變底物應加以簡化。
盡管有這些發展，但直到今天還沒有提出有效的辦法研究這些現象，還未獲得這些現象的實際結果，特別是在令人滿意的快速實施條件下在腫瘤病變過程的診斷和/或跟蹤以及治療后也未獲得這些現象的實際結果。
因此需要一些能夠實施快速可信的體細胞超突變試驗方法。更具體地需要一些能夠提出誘導體細胞突變模型的方法，這些方法可應用于V基因，還可應用于在腫瘤病變過程中，特別是人體內可能涉及的其它基因，例如像Bcl-6和Fas Ligand(FasL)基因。
然而，人們現在發現，淋巴瘤細胞，特別是BL2細胞，可以啟動加速超突變過程，現有技術的數據則相反，按照這些數據，可比過程很長，實施也令人厭倦。
更確切地，現在出乎意料地發現，對于使用BL2細胞模型，在適合于待突變細胞的培養條件與培養基中，往所述細胞中添加至少一種抗CD19、抗CD21和抗IgM抗體的三元組合，可以在異常快速有效的條件下，在合適細胞中活體外實施誘導體細胞突變。
因此，本發明的目的是一種在試管中或在活體外誘導體細胞突變的方法，該方法包括(1)在適合于待突變細胞的培養條件與培養基中，往所述細胞中添加至少一種抗CD19、抗CD21和抗IgM抗體的三元組合，而(2)所述的抗IgM抗體進行生物素化(biotinylés)，并且使用與載體，有利地與全部或部分地由磁珠組成的載體偶合的鏈霉親和素進行特異性聚集。
根據一個特征，本發明的誘導體細胞突變是在短時間內，實際上在約1小時30分鐘時間內進行的。
根據有利的特征，本發明的方法不包括與其它類型細胞，尤其是與T細胞進行共培養。
事實上，人們觀察到，根據本發明推薦的方法，其中使用與載體，例如優選地磁珠偶合的鏈霉親和素進行生物素處理的抗IgM抗體進行特異性聚集，以及至少抗CD19、抗CD21和抗IgM三種抗體的組合，在這些抗體存在下，培養細胞在活體外在非常短的時間內達到快速突變，這個時間與根據現有技術活體外達到突變所指出的時間是無法比擬的。
根據一種實施方案，本發明的方法可以包括一種選自抗IgM和抗CD19抗體組合、抗IgM和抗CD21抗體組合，以及它們的任何比例混合物的抗IgM抗體組合。
根據另外一個特征，BL2 Burkitt淋巴瘤進行誘導突變可以使用本發明的方法。
本發明還有一個目的是這種誘導體細胞突變方法應用于在蛋白質和/或基因上進行活體外超誘變性試驗。
根據一種實施方式，這種應用可用于B淋巴瘤，特別是人的B淋巴瘤，更具體地用于誘導BL2 Burkitt淋巴瘤突變。
根據一種特別優選的實施方式，本發明的系統可用于誘導G0/G1期的BL2 Burkitt淋巴瘤突變。
本發明還有一個目的是一種誘導體細胞突變試劑盒，其特征在于它包括一種如前面定義的體細胞突變誘導系統。
本發明的另外一個目的是這種試劑盒在定性和/或定量鑒定mutasome組分，特別地通過分析蛋白質定性和/或定量鑒定mutasome組分中的應用。
在一種實施方式中，本發明試劑盒的應用包括鑒定翻譯后誘導修飾，特別地通過鑒定、分離和分析mutasome組分，尤其在所述誘導時出現的蛋白質組分鑒定翻譯后誘導修飾。
根據一種優選的實施特征，這種應用包括提供至少一種基因，特別是希望誘導突變的有益蛋白質編碼基因，而試劑盒中包括所述的基因，該試劑盒裝有IgG重鏈或輕鏈編碼基因的啟動子和增強子，并且所述基因轉染到淋巴瘤細胞中，特別是BL2 Burkitt淋巴瘤細胞中。
根據一種有利的實施方式，為了使任何序列突變，優選地在突變試劑盒中用Ig的啟動子和增強子環繞待突變序列。
下面參看一個實施例描述本發明，該實施例是純說明性的，并且目的在于使本技術領域的技術人員獲得能實施本發明的實際指示。基于這些指示和專門知識，本技術領域的技術人員能構想類似或等效的試驗系統而不超出本發明的范圍，還能構想與這里描述的相同或不同的各種不同的具體應用。
為了在BL2細胞上在活體外誘導體細胞突變，可按如下進行-BL2細胞培養條件提供BL2細胞，并按照每ml為105個細胞在完全培養基中在37℃與5％CO2條件下保持24h。
這種培養基是RPMI 1640培養基，用10％FCS以及100U/ml(單位/ml)青霉素和100μg/ml鏈霉親和素補足。
-刺激用RPMI培養基洗滌這些細胞，在溫度4-10℃下，以約1500轉/分離心7分鐘除去所有微量血清。
再按照每500μl為106個細胞將這些BL2細胞溶于RPMI培養基中。
在15ml瓶中，把106個細胞加入冰中，再添加·20μl與FITC偶合的抗CD19(由Immunotech提供)，·20μl與PE偶合的抗CD21(由Becton Dickinson提供)和·4μl與生物素偶合的抗IgM(由Immunotech提供)。
攪拌直至得到均勻混合物后，將該混合物放到冰上，放置約20分鐘。
然后，用10ml RPMI培養基(在4℃)洗滌這種混合物中的細胞，再在1500轉/分條件下離心7分鐘。然后將如此洗滌細胞溶于裝在Eppendorf管(1.5ml)中的500μl RPMI里，添加20μl以商品名Dynal銷售的偶合鏈霉親和素的磁珠。讓其管在輪上在約4℃下轉動15分鐘。
用約4μl完全培養基處理這些細胞和固定這些細胞的珠，該培養基添加了ADCM(由法國，le Centre de transfusion de Lyron提供)，然后把這些處理的細胞分配到有24孔的測定板上進行細胞培養(按照每個孔約2×105個細胞)。
讓這些細胞在37℃下培育約1小時30分鐘。然后將整個孔的內容物再放到1.5ml Eppendorf管中，再在2000轉/分條件下離心10分鐘。
取出離心產物，除去上清液，將離心管座浸入液氮中。
采用本技術領域技術人員已知的通常使用的經典分子技術，進行DNA突變試驗。
對所得到的結果與對VH不同基因和/或使用除BL2之外的其它細胞進行平行研究結果進行分析表明，于是可以在活體外在BL2細胞中對通過刺激表面受體基團而重排的VH基因誘導突變。
變通地，可以例如用原核生物序列，例如抗新霉素基因置換Ig序列，并且可以使用BL2達到類似突變。
于是，根據本發明可以確定-在沒有與T細胞共培養的情況下，用抗原受體和一組共受體刺激后，在約1小時30分鐘可以誘導突變；-平均約三分之一細胞經受超突變機制；-在放線菌素D存在下進行本發明的誘導突變，該放線菌素D完全抑制了轉錄；-用羥基脲將這些細胞保持在G0/G1期時，則誘導這些突變；-采用淘洗制備G0/G1期細胞時，在約30分鐘內也誘導這些突變。
這些結果與現有技術的說明背道而弛，這些結果表明可以在沒有轉錄和姊妹染色單體的情況下進行超突變過程。
實際上，于是可以用兩種尺寸凝膠研究蛋白質缺失和出現，但也可以研究它們的翻譯后修飾。
另外，在適當細胞，例如BL2 Burkitt淋巴瘤中，通過刺激表面受體，可以預誘導根據本發明如此實施的體細胞突變。還非常很可能地在活體內產生這類的刺激。
本發明的方法與手段能根本性達到更優良的條件，并且能夠可靠地研究與試驗確定基因，特別是免疫球蛋白基因的超突變現象。
通過實施本發明的手段可以達到的某些發展和某些應用匯集如下。很清楚的是，這種列舉不是限制性的，并且還可以考慮其它的應用。
作為實例，重要的是在直到現在還未能實現的條件下，根據本發明可以確定在生發中心中B細胞惡性轉變時體細胞超突變的作用與重要性是什么樣的。
本發明通過提供一種誘導體細胞突變的簡單快速獨特模型，能夠證明在沒有轉錄和姊妹染色單體的情況下可以進行超突變過程。
本發明以能安排一個特別應用于人的B淋巴瘤的簡單試驗作為目的，可以提供獲得蛋白質和基因水平的超突變信號的手段。
直到今天其它還未解決的問題尤其是超突變和可能存在的高誘變聚合酶的分子機制問題，以及存在的輔助因子問題。
事實上應該提及，這些輔助因子，即能將超突變過程對準在確定免疫反應階段重排VH和VL基因的mutasome組分，這些因子是人們不知道的。本發明的試驗系統可獲得跟蹤這樣一種超突變過程動力學的快速可信手段，并且對于本技術領域的技術人員來說，基于本說明書所闡明的專門知識，該系統能夠實現特別可應用于人的B淋巴瘤的經濟的快速試驗。
本發明另外一個目的因此是誘導超突變并能進行相關試驗的試劑盒或所有工具，其中誘導快速超突變的工具包括一組如前面描述的抗體。
更一般地，本發明提供的工具能研究和跟蹤在DNA和蛋白質水平體細胞突變過程的最前面的分子段。
簡言之，借助本發明的實施工具，例如在BL2細胞中，可以通過同源染色體重組修飾基因或使其基因失活。因此本發明的技術因此能在細胞，特別地在BL2細胞中實施，這樣能夠改善這些細胞的誘變性能，而且還試驗了這樣的分子在B細胞和Burkitt淋巴瘤生理學中可能起的作用。
使用本發明的工具，作為非限制性實例，因此可以達到某些基因在BL2中的過表達，并由此改善了該細胞的誘變細胞性能，而在該過程中似乎牽涉的分子的轉染可能特別是涉及AID、MSH2、MSH6或RAD30A和/或RAD30B類酶。
在細胞周期G1期可誘導這些突變，并且在重排VH基因的DNA股上產生這些突變，在其中一個子細胞中通過復制而可能固定。
本發明另外還能確定在免疫球蛋白基因的這樣一種體細胞超突變(SHM)過程中pol iota的決定性作用，pol iota是一種Y組DNA聚合酶。
為了產生缺少pol iota的BL2的克隆(它是RAD30酵母中兩種人的同源染色體中的一種，該酵母具有極易產生錯誤的聚合酶的活性，具有填滿DNA不足缺失的活性)，采用了與曾研制使AID(采用激活誘導的胞苷脫氨基酶)的基因失活方法類似的基因失活方法。曾描述過AID分子，具體地Muramatsu，M等人，類別轉換重組和超突變需要激活誘導的胞苷脫氨基酶(AID)，可能的RNA編輯酶，《細胞(cell)》，102，553-63(2000)；和Revy，P等人，激活誘導的胞苷脫氨基酶(AID)缺失引起Hyper-IgM綜合癥(HIGM2)的常染色體隱性形態，《細胞(cell)》，102，565-75(2000)。
由pol iota的雜合性克隆產生了兩種pol iota克隆-/-(54和267)。使用適當的結構可使兩種等位基因失活。兩種iota克隆-/-具有與原始BL2細胞系相同的增殖速度，并且有類似的有絲分裂指數和細胞周期分布圖(profil)，還沒有染色體畸變或易位。使用對人的pol iota高多克隆兔抗體時，在iota克隆-/-54和267的細胞提取物Western斑點中未檢測到任何的pol iota的表達。pol iota表達可通過pIRES載體轉染再飽和，這種轉染在CMV啟動子控制下可引起完全人pol iota的DNAc表達在進行的這些實驗中，在采用Western斑點定量分析的固有變化限內，這些表達百分率可與對正常BL2細胞系觀測的表達百分率相比。在多次嘗試后，無論在正常基底(背景)上還是在缺失pol iota的基底上都不可能達到過表達pol iota的克隆。接下的分析選擇了每種靶細胞的兩種修復克隆。
可以采用兩種不同的方法誘導BL2細胞系中重排VH基因的超突變。第一種方法涉及在共培養基中抗IgM與輔助T克隆或輔助T細胞系的雜交鍵或交聯，在這種情況下如果產生突變，則在培養3天后觀察到這些突變(見Denépoux，S等人，同上；Poltoratsky，V等人，Ig體細胞超突變時在激活BL2細胞中易于出錯聚合酶的表達，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》98，7676-81(2001))。在本試驗中，CB15細胞系是一種在共培養基中用Saimiri皰疹病毒轉化的T細胞，應用這種CB15細胞系和IgM雜交鍵合，接著用鏈霉親和素珠進行生物素處理的抗IgM抗體聚集，可以改變這種SHM誘導系統。第二種方法只涉及表面三種受體IgM、CD19和CD21，或IgM+CD19和/或IgM+CD21組合的交聯或雜交鍵合，接著用鏈霉親和素珠進行生物素處理的抗IgM抗體同樣聚集，在這種情況下，在僅僅培育90分鐘后觀察到突變。根據這兩種方法，僅一個誘變循環達到的突變頻率是類似的，即每對堿基為4-6×10-4(見下面表1)。BL2細胞系在其保持培養基中時也具有重排VH基因非常低的連續突變頻率，實際上在培養基中2-3個月后每對堿基不超過10-4次突變。
無論在T細胞培養中，還是在有上述三種抗體的試驗中，超突變時誘導缺失pol-iota 54或267的克隆時，未觀察到突變頻率的任何可檢測的增加在刺激前對222個序列中的5個序列刺激后，在298個V序列中只顯示7次突變。相反地，在與正常BL2具有的可比水平下，在這些克隆中通過pol iota的cDNA再表達可修復誘導突變在刺激前對547個V序列中的6個V序列刺激后，在547個V序列中產生83次突變。另外，在表達pol iota的這些克隆中修復的突變示意圖是與BL2突變示意圖相似的，并且有高的GC堿基對導向和轉換傾向(見表2)。如正常BL2一樣，pol iota的修復克隆Cμ基因在誘導后顯示未突變。
表1在缺失pol iota和pol iota完全的BL2亞-克隆中V基因突變頻率

注突變頻率以每個核苷酸的突變表示，括號中表示每個序列化V基因的總突變數(416pb)。
表2對于pol iota表達，修復BL2的pol iota細胞系-/-V4-39-JH5基因中產生突變中核苷酸取代百分數

注對含有9個插入子的總計83次突變(表1列出的)，分析出在416pb的VDJ序列中有七十四個靶堿基取代物。由V片段堿基組成校正取代物百分數。黑體字的數字涉及在修復pol iota克隆中誘導的突變，而括號中是誘導正常BL2的相對值。
本發明的另一個目的是DNA聚合酶pol iota應用于特別在B淋巴瘤上，尤其在Burkitt BL2淋巴瘤上蛋白質和/或基因水平的超誘變性活體外試驗中的超誘變性調節。
本發明還有一個目的是改進的DNA聚合酶pol iota，特別是根據本技術領域技術人員已知的技術在更換其中至少一種天然氨基酸后修復的DNA聚合酶pol iota，應用于提高這樣一些試驗中的超誘變性。根據本發明，有利地，可以隨機地誘變環狀II區可進行這種pol iota改進，以便更換其中的至少一個氨基酸，然后修復酶的功能。
本發明還有一個目的是如前面描述的誘導體細胞突變試劑盒，該試劑盒還裝有使pol iota基因失活和/或通過pol iota的cDNA表達修復它們的工具。
在下面實驗部分會更詳細地說明鑒定這種pol iota作用。
在BL2細胞系中誘導V基因超突變按照兩種不同的操作方式誘導了V基因超突變。采用第一種操作方式時，根據前面描述的方案進行表面受體IgM、CD19和CD21的雜交鍵合。第二種激活方式基于與CB15細胞系共培養，該細胞系是用Saimiri皰疹病毒轉化的輔助T細胞系。CB15在RPMI 1640培養基(Invitrogen)中培養，該培養基補充了10％胎牛血清(Hyclone)、青霉素/鏈霉素(Invitrogen)和50單位/ml IL2(Sigma)。CB 15用4000拉德輻照，在加2％Caryoser(CTS，里昂)的完全培養液中制成懸浮液，然后按照每個孔500000個細胞放到24孔板或凹槽中，它們用抗CD3覆蓋一夜(OKT3，Janseen-Cilag，2.5μg/孔)。2×106BL2細胞與生物素處理的抗IgM抗體(0.6mg/ml，Caltag Laboratories)在0.5ml RPML中在冰上培養20分鐘，然后與鏈霉親和素共軛的磁珠(Dynabeads M280，Dynal)在轉動盤上在低的溫度下交聯20分鐘。BL2按照100000個細胞/ml在加2％Caryoser的RPMI培養液中制成懸浮液，然后按照每個孔0.5ml放到24孔中，孔中裝有輻照的CB15和抗CD3(BL2∶CB15比為1∶10)。在37℃培養3天后取出這些細胞，使用稱之DNeasy tissue kit(Qiagen)的合適試劑盒提取DNA，在V4-39-JH5基因擴增后分析這些突變。通過電泳圖的多次校準，并使用AutoAssembler軟件鑒定這些突變。
BL2中的pol iota基因去激活作用使用含有所有編碼外顯子的180kb AC021325的HTGS克隆回收人的pol iota染色體組序列。使用BL2的染色體組DNA使產生靶結構所使用的DNA片段擴增，并且首先用ACP TOPO-XL(Invitrogen)的克隆選擇盒進行克隆，如果SaII和Xhol的位點添加到ACP引物，則使用它們切割，如果不包括限制位點，則呈MluI-NotI片段形式，以及在pBSK載體(Stratagene)的相應位點中進行克隆，載體中在polylieur的SacI位點添加SfiI和MluI位點。新霉素和潮霉素抗性基因插入在5′和3′環繞片段之間。下面的ACP引物用于其擴增第一等位基因5′，5′-iota-5′片段，CACTCGAGTACCAGCCGTCTGGTGTTTG，
和5′-iota-3′，CAGTCGACTACAGFCTCCAGTCGCTC(3.1kb)；3′，3′-iota-5′片段，CACTCGAGCTCAAATCCAGAGCTAAAAG，和3′-iota-3′，CAGTCGACATAGTTGCAGGTAACCACC(2.5kb)；第二等位基因5′，5′-iota2-5′片段，CACTCGAGAGAGCGACTGGAGACTGTAG，和5′-iota2-3′，ACGTCGACAGGAAGAATGCAGAGTGACG(1.8kb)；3′，3′-iota2-5′片段，CTCAGTCGACGGTGGTTACCTGCAACTATG，和3′-iota2-3′，CCAAGTCTCTCAACAACTGG(3.8kb)。
使用Pfu turbo聚合酶(Stratagene)使第一結構的5′片段擴增，使用Herculase(Stratagene)使第二結構的3′片段擴增(94℃30秒，62℃為30秒，68℃為12分鐘，40個循環)，第一結構的3′片段使用ACP Expand LongTemplate PCR系統(Roche)的系統(根據供應商的條件40個循環，包括在延長的時間里的增量)，以及第一結構的5′片段使用ACP Advantage 2 PCR試劑盒的試劑盒(94℃30秒，64℃30秒，68℃4分鐘)。如Bertocci，B等人，《免疫(immunity)》，9，257-65(1998)所描述的那樣進行了30μg用NotI或MluI線性化的結構的轉染。使用下述位于該結構外的和新霉素和潮霉素抗性基因內的引物，在10個克隆庫上用ACP進行了該基因靶克隆的篩選第一等位基因，iota-5′-試驗，ATGACCCAAGCTCAAGACAGC和néoR在5′中CATAGCGTTGGCTACCCGTG，和3′-iota2-3′和反néoR，在3′中CACGGGTAGCCAACGCTATG；第一等位基因，iota-5′-試驗，和hygroR，GCTGTGTAGAAGTACTCGCC(Expand Long Template PCR系統，Roche)。
對于第一等位基因，在518個轉染子上的克隆中得到同源重組。
對于第二等位基因，535中2個克隆被正確定向。
人們將這種這種低頻率歸因于在靶載體結構中一般準確度的ACP酶的應用。在鼠的ES細胞中觀察到菌株對同源重組的這樣一種特定多形性活性，其中序列差0.6％顯然是由靶效率除以50得到的。另外，使用只是用DNA聚合酶Pfu turbo(Stratagene)擴增的結構此后在BL2上進行的其它基因失活，給出靶頻率在1-2％內，而DNA聚合酶Pfu turbo是一種其誤差頻率在使用的擴增條件下低于每對堿基10-4的酶。
BL2的缺失pol iota克隆的轉染使用pol iota表達載體轉染缺失pol iota克隆，通過擴增總長度人poliota的cDNA(McDonald，J.P.等人，《染色體組(Genomics)》，60，20-30(1999))與使用下述引物構成的5′-iota，GCGGATCCACGACGAGGAAGACG，和3′-iota，GCGGATCCTACGCTTTGTGCCAG(下畫線的是BamHI位點)。如前面所描述的那樣，根據本技術領域的技術人員已知的經典技術進行了克隆轉染和選擇。
采用RT-ACP和Western blot分析BL2克隆使用對pol iota的多克隆抗體(第15個KLH-共軛肽，在C-端末端)，經典地進行Western blot。
還證實，根據本技術領域的技術人員已知的技術還可以改善poliota(具體參見Prakash技術)，研制出該酶的pol éta，它如pol iota具有環狀II區(《環指》《Ring Finger》)，其中通過所述II區的隨機突變形成，可以使這個《環指》區具有的至少一個氨基酸發生突變，其結果是顯著增加如此突變酶的活性。
因此，本發明還有一個目的是如前面描述的誘導體細胞突變的試劑盒，該試劑盒包括通過其環狀II區的隨機突變形成如此改善的pol iota酶，以便使其中的至少一種氨基酸改變，其結果是改善其性能，然后采用如前面指出的工具修復該酶。
這種系統在前面公開的各種不同的實施方案中因此能夠特別地鑒定為改善有意義蛋白質性能而必需的突變。例如，BL2中轉染的啟動子-增強子表達盒里實施的胰島素編碼基因非限制性說明性的情況下，它可以產生許多分子，其中具有較好性能的分子優選地固定在其底物上。然后進行編碼這種優選蛋白的突變基因的基因排序，和采用允許這種性能改善的已知修飾氨基酸工具進行鑒定，這樣可以采用本發明的方法非常快速地鑒定這些突變，這些突變能夠獲得性能更優良的胰島素。
權利要求
1.在活體外誘導體細胞突變的方法，其特征在于它包括(1)在適合于待突變細胞的培養條件與培養基中，往所述細胞中添加至少一種抗體組合，該組合包括選自抗IgM和抗CD19抗體組合、抗IgM和抗CD21抗體組合、以及抗IgM、抗CD19和抗CD21抗體組合的抗IgM抗體，而(2)所述的抗IgM抗體進行生物素處理，并且使用與載體偶合的鏈霉親和素進行特異性聚集。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的載體是全部或部分地由磁珠組成的。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于使用Burkitt BL2淋巴瘤為待突變細胞。
4.根據權利要求1-3中任一權利要求所述的方法，其特征在于通過添加一定比率的DNA聚合酶pol iota控制所述的體細胞突變。
5.根據權利要求1-4中任一權利要求所述的方法，其特征在于通過轉染載體pIRES，使得在CMV啟動子控制下達到pol iota的cDNA表達由此修復預先失活的DNA聚合酶pol iota。
6.根據權利要求1-5中任一權利要求所述的方法在實施蛋白質和/或基因水平超誘變性活體外試驗中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于它應用于B淋巴瘤，特別是應用于人的B淋巴瘤。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于它用于在Burkitt BL2淋巴瘤上誘導突變。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于它用于在G0/G1期的Burkitt BL2淋巴瘤上誘導突變。
10.根據權利要求6-9中任一權利要求所述的應用，其特征在于它還包括DNA聚合酶pol iota應用于調節在蛋白質和/或基因水平的超誘變性活體外試驗中的超誘變性，特別是B淋巴瘤，尤其Burkitt BL2淋巴瘤上的超誘變性。
11.根據權利要求10所述的應用，其特征在于使用經改進的DNA聚合酶pol iota，即在更換至少其中一種天然氨基酸后修復的DNA聚合酶pol iota。
12.根據權利要求11所述的應用，其特征在于通過隨機誘變形成環狀II區進行所述的pol iota改進，以便更換其中至少一種氨基酸。
13.誘導體細胞突變的試劑盒，其特征在于它包括誘導體細胞突變的工具，其中包括至少一種抗體組合，這種組合包括選自抗IgM和抗CD19抗體組合、抗IgM和抗CD21抗體組合、以及抗IgM、抗CD19和抗CD21抗體組合的抗IgM抗體。
14.根據權利要求13所述的試劑盒，其特征在于所述的抗IgM抗體被生物素化，并且通過與載體偶合，特別是與磁珠偶合的鏈霉親和素進行特異性聚集。
15.根據權利要求13或14所述的試劑盒，其特征在于它還包括用于pol iota基因失活和/或通過pol iota的cDNA表達修復其基因的工具。
16.根據權利要求15所述的試劑盒，其特征在于它包括經改進的DNA聚合酶pol iota，即在更換其中至少一種天然氨基酸后修復的DNA聚合酶pol iota。
17.根據權利要求16所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA聚合酶pol iota是一種通過隨機誘變形成環狀II區以便更換其中至少一種氨基酸而被改進的pol iota酶。
18.誘導體細胞突變的試劑盒，其特征在于它包括實施如權利要求1-5中任一權利要求所述的方法的工具。
19.根據權利要求13-18中任一權利要求所述的試劑盒在定性和/或定量鑒定，特別是采用蛋白質分析鑒定mutasome組分中的應用。
20.根據權利要求19所述的應用，其特征在于它包括鑒定所誘導的翻譯后修飾，特別是通過鑒定、分離和分析mutasome組分，尤其在所述誘導時出現的蛋白質組分。
21.根據權利要求19所述的應用，其特征在于它包括提供至少一種基因，特別是希望在其上誘導突變的蛋白質編碼基因，而試劑盒中包括所述的基因，該試劑盒裝有IgG重鏈或輕鏈編碼基因的啟動子和增強子，并且所述基因轉染到淋巴瘤細胞中，特別是BL2 Burkitt淋巴瘤細胞中。
22.根據權利要求19-21中任一權利要求所述的應用，其特征在于為了使任何序列突變，優選在突變試劑盒中，用Ig的啟動子和增強子環繞待突變序列。
23.根據權利要求19-21中任一權利要求所述的應用，其特征在于為了使任何序列突變，采用同源重組把所述序列插入免疫球蛋白的位點上，更換兩個重排位點的全部或部分V基因。
全文摘要
本發明涉及一種in vitro或ex vitro誘導體細胞突變的方法，該方法包括(1)在適合于所述細胞的培養條件下和培養基中，往待突變細胞中添加至少一種抗IgM和抗CD19和/或抗DC21抗體組合，(2)所述的抗IgM抗體進行生物素化處理，通過與載體偶合的鏈霉親和素進行特異性聚集。有利地，通過抑制和再激活和/或刺激DNA聚合酶pol iota控制和/或調節這些突變。本發明特別應用于BL2 Burkitt淋巴瘤上突變的快速控制誘導。
文檔編號C12N15/90GK1863911SQ02828181
公開日2006年11月15日 申請日期2002年12月17日 優先權日2001年12月18日
發明者克洛德-阿涅絲·雷諾, 讓-克洛德·魏爾 申請人:耐克爾研究院