一種利用黃孢原毛平革菌選擇性產生木質素降解酶的方法
【專利摘要】本發明涉及一種利用黃孢原毛平革菌選擇性產生木質素降解酶的方法。本發明提供了利用黃孢原毛平革菌產生木質素降解酶的方法，包括如下步驟：在含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基中發酵黃孢原毛平革菌，收集發酵產物，即得到木質素降解酶；本發明的實驗證明，采用本方法進行木質素降解酶發酵，不需在培養過程中通入純氧或含高濃度氧氣的空氣，只需控制培養基中的碳氮源濃度和加入非浸沒量的載體，即可在空氣條件下選擇性獲得木質素降解酶。本發明方法條件控制簡單，獲得的木質素降解酶選擇性強。
【專利說明】一種利用黃孢原毛平革菌選擇性產生木質素降解酶的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種利用黃孢原毛平革菌選擇性產生木質素降解酶的方法。

【背景技術】
[0002]白腐真菌是一種高等絲狀真菌，在分類上大多數屬于擔子菌綱，生長在樹木或木材上，因引起木質白色腐爛而得名。白腐真菌降解木質素，是因為它能夠產生木質素降解酶，并分泌到細胞外。木質素降解酶對木質素的降解是以自由基為基礎的鏈反應過程，具有極強的底物非特異性和氧化性，這種降解機制使木質素降解酶不僅能夠降解木質素，還能夠降解環境中的許多異生物質和持久性有毒有機污染物(Barr&Aust，1994 ；Cameron etal.，2000 ；Gao et al.，2010)。因此，白腐真菌及其木質素降解酶在環境污染控制及其生物修復等方面具有重要的應用價值。
[0003]黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是白腐真菌產生木質素降解酶和降解環境污染物研究的模式菌種(Wesenberg et al., 2003 ；Singh&Chen, 2008),屬非裙菌目(Phyllophorales)、伏革科(Corticiaceae)和顯革菌屬(Phanerochaete)。P.chrysosporium木質素降解酶系統主要包括木質素過氧化物酶(LiP, ECl.11.1.14)、猛過氧化物酶(MnP, ECl.11.1.13)和產H2O2的氧化酶。木質素過氧化物酶和猛過氧化物酶是糖基化的含鐵的多種同功酶，木質素過氧化物酶能夠催化對非酚類木質素型式化合物和芳香族污染物的氧化，錳過氧化物酶能夠催化對木質素、木質素衍生物和很多酚類的木質素型式化合物的氧化。黃孢原毛平革菌木質素降解酶的合成受到多種營養和環境因素的復雜調節，木質素降解酶能夠在受到氮、碳或硫營養限制時激發產生，在高氧條件下表現活躍(Faison&Kirk, 1985 ；Dosoretz et al., 1990)。高氧條件被認為可以改善氧在菌絲中的傳質，特別是在胞外多糖積累的情況下，從而誘導酶的合成。一般認為黃孢原毛平革菌不產生漆酶。
[0004]木質素降解酶的應用依賴于酶的高水平發酵。黃孢原毛平革菌木質素降解酶發酵的研究，主要包括以下方面(Ikehata et al., 2004 ；Singh&Chen, 2008):(1)發酵的營養條件(包括合適的碳源、氮源、微量元素、溶解氧和誘導物等)；(2)發酵的環境條件(如溫度、pH、攪拌和固定化條件等)；和(3)反應器發酵放大的研究。木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶是緊密相關的酶類，在白腐真菌中通常同時產生。不過，二者的催化機制有所不同，對不同結構的底物具有不同的降解能力(Cameron et al., 2000 ；Martinez, 2002) 0由于兩種過氧化物酶的產生受到營養和環境因素影響的程度存在差異，兩種酶的合成在共同的調節性質之外可能存在各自的特征。因此，利用營養和環境條件對酶合成調節的差異，有可能實現兩種過氧化物酶的選擇性產生。過氧化物酶的選擇性產生有助于木質素降解酶合成和調節機制的研究，同時對于滿足具有不同結構特征有機污染物的降解需要具有重要的應用意義。至今，利用黃孢原毛平革菌選擇性產生木質素降解酶的報道還很罕見。Bonnarme和Jeffries (1990a, b)發現錳離子(Mn2+)對黃孢原毛平革菌木質素降解酶合成具有不同的調節效應，通過控制培養基中Mn2+濃度在氣升式反應器中實現了黃孢原毛平革菌木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶的選擇性產生，不過，要求純氧通入是其發酵過程的一個限制。李華鐘等(2002)同樣研究了黃孢原毛平革菌在Mn2+濃度調節下木質素降解酶的選擇性產生，不過效果尚不夠理想，且仍受純氧供應的限制。
[0005]除了 Mn2+控制，目前，還沒有見到利用其他調節手段實現黃孢原毛平革菌木質素降解酶選擇性產生的報道，尤其是在空氣環境中。木質素降解酶在空氣條件下的有效合成對于酶的大規模發酵具有成本效益和更大的可行性。


【發明內容】

[0006]本發明的一個目的是提供一種利用黃孢原毛平革菌產生木質素降解酶的方法。
[0007]本發明提供的方法，包括如下步驟:在含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基中發酵黃孢原毛平革菌，收集發酵產物，即得到木質素降解酶；
[0008]所述含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基為將所述固定化培養載體加入用于培養白腐真菌的液體培養基中，且使其堆積高度高于所述液體培養基液面，處于非浸沒狀態，得到的培養基。
[0009]上述方法中，所述含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基中固定化培養載體的含量大于等于1.8g/100mL。
[0010]上述方法中，所述含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基中固定化培養載體的含量為 1.8g/100mL-3.0g/100mL,具體為 1.8g/100mL、2.2g/100mL、2.6g/100mL 或3.0g/100mL。
[0011]上述方法中，所述液體培養基為碳限制液體培養基，用其發酵產生的木質素降解酶為木質素過氧化物酶；
[0012]所述碳限制液體培養基具體為C原子和N原子的摩爾比小于等于3.8的碳限制液體培養基。
[0013]上述方法中，所述碳限制液體培養基中的C原子來源于葡萄糖，N原子來源于酒石酸銨；
[0014]每IL所述碳限制培養基由終濃度為5.04g/L葡萄糖、終濃度為4.05g/L酒石酸銨、終濃度為2.0g/L KH2PO4、終濃度為0.5g/L MgSO4、終濃度為0.lg/L CaCl2、終濃度為lmg/L維生素B1、終濃度為1.5mM藜蘆醇、pH 4.4且終濃度為20mM乙酸緩沖液和70mL/L微量元素溶液組成；
[0015]所述微量元素溶液由終濃度為3g/L MgS04、終濃度為0.5g/L MnS04、終濃度為1.0g/L NaCl、終濃度為 0.lg/L FeSO4.7H20、終濃度為 0.lg/L CoCl2、終濃度為 0.lg/LZnSO4.7H20、終濃度為 0.lg/L CuS04、終濃度為 10mg/L AlK(SO4)2.12H20、終濃度為 10mg/LH3BO3、終濃度為10mg/L Na2MoO4.2H20、終濃度為1.5g/L次氮基三乙酸鹽和水組成。
[0016]上述方法中，所述液體培養基為氮限制液體培養基，用其發酵產生的木質素降解酶為錳過氧化物酶；
[0017]所述氮限制液體培養基具體為C原子和N原子的摩爾比大于等于152.7的氮限制液體培養基。
[0018]上述方法中，所述氮限制液體培養基中的C原子來源于葡萄糖，N原子來源于酒石酸銨；
[0019]每IL所述氮限制液體培養基為用終濃度為10.08g/L葡萄糖、終濃度為0.203g/L酒石酸銨替換掉所述碳限制液體培養基中的葡萄糖和酒石酸銨，其余組分與所述碳限制液體培養基相同。
[0020]上述方法中，所述液體培養基的pH值均為4.4 ；
[0021]所述固定化培養載體為惰性材料，具體為聚氨酯泡沫塊；所述聚氨酯泡沫塊的邊長尤其具體為0.5cm。
[0022]本發明的另一個目的是提供一種利用黃孢原毛平革菌產生木質素降解酶的試劑盒。
[0023]本發明提供的試劑盒，包括上述含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基。
[0024]上述方法中，所述木質素降解酶為木質素過氧化物酶或錳過氧化物酶。
[0025]上述方法或試劑盒中，所述黃孢原毛平革菌為BKM-F-1767，所述培養基的pH均為4.0-5.0，所述發酵培養條件為:溫度為37oC，轉速為160rpm發酵培養。
[0026]本發明的實驗證明，本發明采用黃孢原毛平革菌作為木質素降解酶發酵菌株，發酵培養基采用碳限制液體培養基(C/N比不大于3.8，即葡萄糖/NH4+不大于28/44mM)，或氮限制液體培養基(C/N比不小于152.7，即葡萄糖/NH4+不小于56/2.2mM)，采用惰性材料作為固定化培養載體，使載體在培養基中處于非浸沒狀態，在空氣環境下振蕩培養，在碳限制培養液中主要獲得木質素過氧化物酶，在氮限制培養液中主要獲得錳過氧化物酶。采用本方法進行木質素降解酶發酵，不需在培養過程中通入純氧或含高濃度氧氣的空氣，只需控制培養基中的碳氮源濃度和加入非浸沒量的載體，即可在空氣條件下選擇性獲得木質素降解酶。本發明方法條件控制簡單，獲得的木質素降解酶選擇性強。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為黃孢原毛平革菌在空氣環境下固定化培養時在碳限制下木質素過氧化物酶的產生。
[0028]圖2為黃孢原毛平革菌在空氣環境下固定化培養時在氮限制下木質素降解酶的產生.(a)木質素過氧化物酶；(b)錳過氧化物酶。
[0029]圖3為黃孢原毛平革菌在碳限制下在聚氨酯泡沫塊上固定化培養時的掃描電鏡照片(FEI QUANTA 200).(a) 30 X ;(b)100X。

【具體實施方式】
[0030]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0031]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0032]下述實施例中培養基的pH均為4.0-5.0。
[0033]實施例1、黃孢原毛平革菌在碳限制下選擇性產生木質素過氧化物酶
[0034]1、碳限制液體培養基的配制
[0035]采用碳限制液體培養基，培養基是基于典型的Tien和Kirk培養基(1988)稍加修改而成，培養基C/N比(摩爾比)為3.8，具體組成如下:
[0036]碳限制液體培養基由終濃度為5.04g/L (28mM)葡萄糖、終濃度為4.05g/L(NH4+44mM)酒石酸銨、終濃度為2.0g/L KH2PO4、終濃度為0.5g/L MgSO4、終濃度為0.lg/LCaCl2、終濃度為lmg/L維生素B1、終濃度為1.5mM藜蘆醇、終濃度為20mM(pH 4.4)乙酸緩沖液，70mL/L微量元素溶液和去離子水組成；pH為4.4。
[0037]微量元素溶液由終濃度為3g/L MgS04、終濃度為0.5g/L MnS04、終濃度為1.0g/LNaCl、終濃度為0.lg/L FeSO4.7Η20、終濃度為0.lg/L CoCl2、終濃度為0.lg/L ZnSO4.7Η20、終濃度為 0.lg/L CuS04、終濃度為 10mg/L AlK(SO4)2.12H20、終濃度為 10mg/L H3BO3、終濃度為10mg/L Na2MoO4.2H20、終濃度為1.5g/L次氮基三乙酸鹽和水組成。
[0038]2、黃孢原毛平革菌在碳限制下選擇性產生木質素過氧化物酶
[0039]采用邊長0.5cm的聚氨酯泡沫塊作為固定化培養載體，采用的載體量分別為1.0、1.4、1.8,2.2、2.6和3.0g，將載體置于裝有10mL碳限制液體培養基的250mL錐形瓶中，載體的堆積高度對應著不同的浸沒和非浸沒狀態；分為如下兩組培養方式:
[0040]不同載體量的浸沒培養:向10mL碳限制液體培養基中分別加入1.0和1.4g固定化培養載體，且使其堆積高度低于液面，處于浸沒狀態，得到不同載體量的浸沒培養體系；
[0041]不同載體量的非浸沒培養:向10mL碳限制液體培養基中分別加入1.8,2.2,2.6和3.0g固定化培養載體，且使其堆積高度高于液面，處于非浸沒狀態，得到不同載體量的非浸沒培養體系；
[0042]將上述不同載體量的浸沒培養體系和不同載體量的非浸沒培養體系分別滅菌(115°C,30min)后，將生長在30°C PDA平板(200g 土豆浸出液/L，20g葡萄糖/L，20g瓊月旨/L)上的黃抱原毛平革菌 BKM-F-1767 抱子(Tien, M., Kirk, T.K.Lignin peroxidase ofPhanerochaete chrysosporium.Methods in Enzymology.1988，161:238-249,公眾可從清華大學獲得)無菌接入培養基中，接種后孢子濃度約為1.0 X 15孢子/mL。
[0043]將上述接入孢子的不同載體量的浸沒培養體系和接入孢子的不同載體量的非浸沒培養體系，在空氣環境(不另外充入純氧)，溫度為37°C，轉速為160rpm條件下發酵培養，得到培養液即為發酵產物木質素降解酶溶液。培養液樣品經離心(9000r/min，10min，4°C )得到上清液，用于木質素降解酶酶活檢測。
[0044]將上清液進行木質素過氧化物酶活性分析，木質素過氧化物酶活性采用以藜蘆醇為底物的方法測定，每Imin氧化I μ mol藜蘆醇成藜蘆醛所需的酶量定義為I個酶活力單位。
[0045]木質素過氧化物酶的產生結果如圖1所示。
[0046]載體量為1.0和1.4g的浸沒培養體系培養BKM-F-1767的發酵上清液，沒有檢測到酶活；
[0047]載體量不小于1.8g的非浸沒培養體系培養BKM-F-1767的發酵上清液，最大酶活隨載體量增大而增大，在3.0g載體時，獲得最高酶活為87.5U/L。
[0048]將不同培養條件下發酵產物上清液同時進行錳過氧化物酶活性檢測，錳過氧化物酶活性采用以Mn2+為底物的方法分析，每Imin氧化I μ mol Mn2+所需的酶量定義為I個酶活力單位。無論采用何種載體量，培養過程均沒有錳過氧化物酶產生。
[0049]因此，黃孢原毛平革菌在空氣環境下非浸沒固定化培養時，在碳限制下能夠選擇性產生木質素過氧化物酶。
[0050]黃孢原毛平革菌在碳限制下在聚氨酯泡沫塊上固定化培養時的掃描電鏡照片，如圖3所示。
[0051]實施例2、黃孢原毛平革菌在氮限制下選擇性產生錳過氧化物酶
[0052]1、氮限制液體培養基的配制
[0053]采用氮限制液體培養基，培養基C/N比(摩爾比)為152.7，具體組成如下:
[0054]氮限制液體培養基配方為將終濃度為10.08g/L (56mM)葡萄糖、0.203g/L(NH4+2.2mM)酒石酸銨替換掉碳限制液體培養基中的葡萄糖和酒石酸銨，其余組分與實施例I中的碳限制液體培養基相同；pH為4.4。
[0055]2、黃孢原毛平革菌在氮限制下選擇性產生錳過氧化物酶
[0056]培養條件和分析方法與實施例1相同，僅是培養基替換為氮限制液體培養基。
[0057]木質素降解酶產生結果如圖2所示，在載體量不小于1.Sg時檢測到木質素過氧化物酶酶活(2.2g載體時酶活最大)；載體量小于1.Sg時，沒有檢測到木質素過氧化物酶酶活，但在所有載體條件下最高酶活均不超過20U/L(圖2a)；
[0058]與之相對照，在載體量不小于1.8g時，錳過氧化物酶顯著生成，在2.2g載體時，最高酶活達到338.7U/L(圖2b);載體量小于1.Sg時，沒有檢測到錳過氧化物酶酶活。
[0059]因此，黃孢原毛平革菌在空氣環境下非浸沒固定化培養時，在氮限制下能夠選擇性產生錳過氧化物酶。
【權利要求】
1.一種利用黃孢原毛平革菌產生木質素降解酶的方法，包括如下步驟:在含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基中發酵黃孢原毛平革菌，收集發酵產物，即得到木質素降解酶； 所述含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基為將所述固定化培養載體加入用于培養白腐真菌的液體培養基中，且使其堆積高度高于所述液體培養基液面，處于非浸沒狀態，得到的培養基。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基中固定化培養載體的含量大于等于1.8g/100mL。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于: 所述含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基中固定化培養載體的含量為1.8g/100mL>2.2g/100mL>2.6g/100mL 或 3.0g/100mL。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于: 所述液體培養基為碳限制液體培養基，用其發酵產生的木質素降解酶為木質素過氧化物酶； 所述碳限制液體培養基具體為C原子和N原子的摩爾比小于等于3.8的碳限制液體培養基。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于: 所述碳限制液體培養基中的C原子來源于葡萄糖，N原子來源于酒石酸銨； 每IL所述碳限制培養基由終濃度為5.04g/L葡萄糖、終濃度為4.05g/L酒石酸銨、終濃度為2.0g/L KH2PO4、終濃度為0.5g/L MgSO4、終濃度為0.lg/L CaCl2、終濃度為lmg/L維生素B1、終濃度為1.5mM藜蘆醇、pH 4.4且終濃度為20mM乙酸緩沖液和70mL/L微量元素溶液組成； 所述微量元素溶液由終濃度為3g/L MgSO4、終濃度為0.5g/L MnSO4、終濃度為1.0g/LNaCl、終濃度為0.lg/L FeSO4.7Η20、終濃度為0.lg/L CoCl2、終濃度為0.lg/L ZnSO4.7Η20、終濃度為 0.lg/L CuS04、終濃度為 10mg/L AlK(SO4)2.12H20、終濃度為 10mg/L H3BO3、終濃度為10mg/L Na2MoO4.2H20、終濃度為1.5g/L次氮基三乙酸鹽和水組成。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于: 所述液體培養基為氮限制液體培養基，用其發酵產生的木質素降解酶為錳過氧化物酶； 所述氮限制液體培養基具體為C原子和N原子的摩爾比大于等于152.7的氮限制液體培養基。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于: 所述氮限制液體培養基中的C原子來源于葡萄糖，N原子來源于酒石酸銨； 每IL所述氮限制液體培養基為用終濃度為10.08g/L葡萄糖、終濃度為0.203g/L酒石酸銨替換掉所述碳限制液體培養基中的葡萄糖和酒石酸銨，其余組分與所述碳限制液體培養基相同。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于: 所述液體培養基的PH值均為4.4 ； 所述固定化培養載體為惰性材料，具體為聚氨酯泡沫塊；所述聚氨酯泡沫塊的邊長尤其具體為0.5cm。
9.一種利用黃孢原毛平革菌產生木質素降解酶的試劑盒，包括權利要求1-8中的所述含有處于非浸沒狀態的固定化培養載體的培養基。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于:所述木質素降解酶為木質素過氧化物酶或錳過氧化物酶。
【文檔編號】C12R1/645GK104263705SQ201410471747
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月16日 優先權日:2014年9月16日
【發明者】文湘華, 喻國策, 錢易, 王建龍 申請人:清華大學