多糖植物基因組dna提取方法
【專利摘要】本發明涉及一種多糖植物基因組DNA提取方法及使用該方法的試劑盒，該方法中使用兩個緩沖液系統，緩沖液系統1中含有GuSCN及其酸性緩沖系統，緩沖液系統2中含有PVP及包括SLS的緩沖液系統，使用這樣的緩沖液系統能夠有效充分地從多糖中提取分離DNA，避免多糖與DNA的共沉淀。
【專利說明】多糖植物基因組DNA提取方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種從富含多糖植物組織中提取DNA的技術。

【背景技術】
[0002]DNA是生物體中基本遺傳物質，分離高質量DNA是現代分子生物學的關鍵技術，在包括農業，林業，醫學等的領域，分離高質量DNA是各種分子生物學的關鍵步驟。因此，開發有效的DNA純化方案需要進一步深入研究。傳統的植物基因組DNA提取技術采用三組緩沖液系統并結合硅膠膜技術進行DNA分離純化，此方法可以純化部分植物組織DNA，但對于富含多糖組織的植物，很難從粘稠的多糖溶液中有效分離DNA，造成DNA損失，影響下游試驗。
[0003]現有技術中具有代表性的是硅膠膜法植物基因組提取技術，其是利用硅膠模選擇吸附特性并配合一定的裂解緩沖液系統，達到硅膠模對核酸的選擇吸附效果，并有效去除蛋白質等其他雜質污染。現有的植物基因組提取系統一般包括緩沖液體系1，緩沖液體系2，緩沖液體系3及硅膠膜，緩沖液體系1 一般含有Tris-cl，EDTA，SDS，用于植物組織裂解，緩沖液體系2及緩沖液體系3用于平衡整個緩沖體系PH值并沉淀核酸，并吸附于硅膠膜上，通過漂洗洗脫獲得較純的DNA溶液。由于硅膠模本身具有孔徑小，通過率有限的缺點，導致富含多糖的組織通過常規裂解緩沖系統裂解后，大量多糖組分留出，造成多糖與基因組DNA共同存在與緩沖體系中，通過硅膠膜漂洗洗脫步驟后，基本無DNA存留。
[0004]本發明摒棄了以往的三組緩沖液系統，采用全新的兩組緩沖液系統，能夠從粘稠多糖溶液中有效分離植物基因組DNA，獲得DNA純度較高，可以廣泛應用于PCR，克隆酶切，Northern blot等下游基因工程技術。


【發明內容】

[0005]本發明改變了傳統的植物基因組提取的緩沖系統(僅有兩個緩沖液體系)，能夠有效去除植物組織中的多糖，并分離DNA，通過乙醇沉淀后吸附于硅膠膜柱上，通過漂洗洗脫步驟獲得較純的DNA溶液。
[0006]通過本發明可以有效的改變多糖與基因組DNA共沉淀的弊端，有效的從多糖組織中分離DNA。
[0007]本發明采用傳統硅膠膜技術并結合獨特緩沖液配方使基因組DNA提純時間大大減少，純度及穩定性提高，其原理如下:
[0008]本發明緩沖液系統1中含有GuSCN及其酸性緩沖系統，有效破碎細胞，組織并抑制各種核酸酶活性，防止核酸降解同時有效釋放出基因組DNA。本裂解緩沖系統1中不含有苯酚氯仿等有毒有害物質，不會對環境造成污染。
[0009]本發明緩沖液系統2中含有PVP及SLS等緩沖液系統，有效的沉淀多糖植物組織中的多糖，并有效分離裂解釋放出來的DNA，通過乙醇沉淀后結合吸附到硅膠膜上。
[0010]本發明另一目的是提供一種全新有效從多糖組織的粘稠溶液中分離基因組DNA的試劑盒，其包括以下成分:
[0011]A.緩沖液系統 1:1-5M GuSCN ；0.2-1M檸檬酸鈉；0.1-0.5M檸檬酸；0.1-1.0M氯化鈉0.2-0.8M乙酸鈉(PH 4.2)冰乙酸
[0012]B.緩沖液系統 2:0.1 % -3% PVP40 ；0.1% -2% SLS ；0.2M_lMTris_CL ；0.2M-1MEDTA
[0013]C.漂洗緩沖液系統 1:2-6M GuHCL ;0.2M-1M Tris-CL ;0.2M-1MEDTA ;0.14Μ 氯化鈉；45%無水乙醇
[0014]D.漂洗緩沖液系統2:75%無水乙醇
[0015]E.洗脫緩沖液系統:0.1倍TE溶液
[0016]根據本發明所對應試劑盒提取步驟:
[0017]摒棄以往三步法提取過程，本發明僅需兩部提取多糖含量較高的植物組織DNA，第一步，植物組織裂解，將研磨完成的植物組織加入到裂解緩沖液系統1中，56°C溫浴10分鐘，此步用于植物組織充分裂解，釋放細胞內容物質，包括蛋白質，多糖，DNA等。第二步,多糖沉淀，將溫浴完成的細胞裂解混合液加入到緩沖液系統2中，顛倒混勻多次，此步中，組織裂解緩沖液中的多糖充分與緩沖液系統2混合沉淀，分離DNA。第三步，混合液中加入無水乙醇沉淀DNA并結合硅膠膜離心吸附DNA。第四步，漂洗硅膠膜柱，清除蛋白質等抑制物。第五步，洗脫回收DNA。
[0018]本發明的方法沒有從現有技術中得到啟示,是本申請的 申請人:經過創造性勞動得到的非顯而易見的技術方案。同時，與現有技術相比，本發明具有以下優點:
[0019]1、操作簡單，提純純度高；
[0020]2、有效處理富含多糖植物組織；
[0021 ] 3、步驟簡化，緩沖體系中無有毒有害物質，不會污染環境。
[0022]上述優點也無法從現有技術中得出，可見本發明取得了預料不到的技術效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1表示傳統植物基因組DNA提取技術流程；
[0024]圖2表示本發明的技術流程；
[0025]圖3表示實施例1中電泳檢測結果。

【具體實施方式】
[0026]對比例1
[0027]1.樣品處理:
[0028]A.材料收集存貯:收集的新鮮材料如果不能馬上使用，請將其放入液氮中冷卻，并且最終保存于_80°C，已經干燥了的材料可以在室溫中存貯。
[0029]B.如果條件允許的情況下，盡可能收集新鮮材料，新鮮材料中含有較少的多糖和多酚。
[0030]C.當從液體培養基中收集真菌時，首先通過離心的方式，將液體分離并收集到菌體。
[0031]2、將lOOmg左右新鮮樣品，或者不超過20mg干物質用液氮研磨。
[0032]3、加入400μ1 Buffer P1-A和4μ1 RNaseA(10mg/ml),確保研磨樣品中不存在塊狀組織，塊狀組織比較難裂解，會降低DNA獲得率，另外不要將Buffer P1-A和RNaseA在使用前進行混合。
[0033]4、65°C溫育10?15min，期間顛倒混勻2?3次，此步驟用于裂解細胞。
[0034]5、加入130 μ 1 Buffer PI_B混勻，并且在冰上冰浴5min (此步用于沉淀多糖、蛋白質)。
[0035]6、推薦步驟:將裂解液離心5min, 14000rpm(20000 Xg)。一些植物材料會在此步出現很多粘性物質，這些物質會在接下來的步驟中會剪切DNA，因此，最理想的狀態是在此步過程中將這些物質移除，離心后，將上清轉移至新的離心管中。
[0036]7、將裂解上清液轉入純化柱中，并放入收集管14000rpm(200(K)Xg)2min。一定確保純化柱中沒有殘留液體，核酸純化柱過濾掉大部分沉淀物和細胞殘質，但是也含有小部分穿過核酸純化柱。
[0037]8、小心轉移上一步所得到的液體到新離心管中。大約450 μ 1液體能夠被轉移，對于一些物種來說可以少于450 μ 1。
[0038]9、加入1.5倍體積的Buffer P1-C到裂解液中，并混勻。例如:加入450 μ 1裂解液，加入Buffer P1-C 675 μ 1，如果裂解液體積少于450 μ 1，則按比例減少Buffer P1-C的用量，加入Buffer P1-C后會有少量沉淀生成，但不影響后續實驗。使用Buffer PI_C前，確認是否加入無水乙醇，確保Buffer P1-C加入澄清裂解液并迅速混勻。
[0039]10、將上步所得液體加入到DNA純化柱中(大約每次加入量650 μ 1?700 μ 1)，大于8000rpm離心lmin，將收集的廢液遺棄，并重新將收集管套入純化柱中進行下一步。
[0040]11、重復步驟9，將剩余液體再加入到純化柱中，大于8000rpm離心lmin，棄掉廢液及收集套管。
[0041]12、將DNA純化柱放入一個新的收集套管中，加入300μ 1漂洗液WB，大于8000rpm離心lmin，棄掉廢液并將DNA純化柱重新放入套管中進行下一步，確認漂洗液WB中已經加入無水乙醇。
[0042]13、加入500 μ 1漂洗液WB到DNA純化柱中，14000rpm(20000Xg)離心2min，適當延長離心時間，致膜更加干燥。乙醇的存在對隨后的實驗有嚴重影響，因此膜的干燥很重要，離心后確保在進行洗脫前無乙醇的存在，隨后棄掉廢液及收集管。在使用漂洗液WB漂洗過后，DNA純化柱膜僅應有輕微的顏色。在離心后，小心移走DNA純化柱，確保不與收集管碰到，以確保不會有乙醇影響。
[0043]14、將DNA純化柱加入到一個新的離心管中，懸空滴加100 μ 1洗脫液ΕΒ到柱膜上，室溫溫育5min (15?25°C )，大于8000rpm離心lmin。用50 μ 1洗脫液ΕΒ洗脫DNA可以提高DNA濃度，但降低了總DNA獲得率。
[0044]15、重復上一步驟。一個新的離心管可以用于收集第二次洗脫的DNA或者使用原來的收集管繼續收集DNA。
[0045]實施例1
[0046]榆樹是目前已知的在植物中多糖含量最高的植物組織之一，由于多糖較為粘稠，傳統的緩沖體系與多糖結合后形成膠狀不溶物，無法完成進一步核酸純化，本發明針對此問題改進緩沖液系統，成功應用于榆樹基因組DNA分離純化。
[0047]榆樹基因組DNA提取:
[0048]采取新鮮榆樹組織0.lg左右，液氮研磨成細粉狀。
[0049]將研磨后的組織迅速倒入含有本發明緩沖液系統1的離心管中，充分混勻。
[0050]迅速加入本發明緩沖液系統2，混勻，利用一次性注射器反復吹打溶液，使粘稠的團塊分離，漩渦震蕩5min。
[0051]高速離心十分鐘，轉移上清并加入無水乙醇沉淀DNA，之后將溶液分多次加入到硅膠膜柱上。
[0052]漂洗硅膠膜柱。
[0053]洗脫DNA。
[0054]進行電泳檢測，結果如圖3所示。
[0055]由對比例1和實施例1可知，相對于現有技術，本發明的方法與試劑盒簡化操作步驟同時更為有效地將DNA從多糖中分離出來。
【權利要求】
1.一種多糖植物基因組DNA提取試劑盒，其包括至少兩個緩沖液系統，其特征在于:該試劑盒能夠有效充分地從多糖中提取分離DNA，避免多糖與DNA的共沉淀。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其中至少兩個緩沖液系統分別為緩沖液系統I和緩沖液系統2，緩沖液系統I中含有GuSCN及其酸性緩沖系統，緩沖液系統2中含有PVP及包括SLS的緩沖液系統。
3.如權利要求1或2中任一項所述的方法，其中緩沖系統I中不含有苯酚或氯仿或其它有毒有害物質。
4.如權利要求1-3中任一項所述的試劑盒，其包括: 緩沖液系統I:1-5M GuSCN;0.2-1M檸檬酸鈉；0.1_0.5M檸檬酸；0.1_1.0M氯化鈉.0.2-0.8M乙酸鈉(PH 4.2)冰乙酸；
緩沖液系統 2:0.1% -3% PVP40 ；0.1% -2% SLS ；0.2M-1M Tris-CL ；0.2M-1M EDTA ； 漂洗緩沖液系統 I:2-6M GuHCL ；0.2M-1M Tris-CL ；0.2M-1MEDTA ；0.14M 氯化鈉；45%無水乙醇； 漂洗緩沖液系統2:75%無水乙醇； 洗脫緩沖液系統:0.1倍TE溶液。
5.一種使用權利要求1-4中任一項的試劑盒的多糖植物基因組DNA提取步驟，包括:第一步，植物組織裂解，將研磨完成的植物組織加入到裂解緩沖液系統I中，56°C溫浴10分鐘，此步用于植物組織充分裂解，釋放細胞內容物質，包括蛋白質，多糖，DNA及其它物質；第二步，多糖沉淀，將溫浴完成的細胞裂解混合液加入到緩沖液系統2中，顛倒混勻多次，此步中，組織裂解緩沖液中的多糖充分與緩沖液系統2混合沉淀，分離DNA ;第三步，混合液中加入無水乙醇沉淀DNA并結合硅膠膜離心吸附DNA ;第四步，漂洗硅膠膜柱，清除蛋白質及其它抑制物；第五步，洗脫回收DNA。
6.一種多糖植物基因組DNA提取方法，其特征在于:該方法中使用包括至少兩個緩沖液系統，能夠有效充分地從多糖中提取分離DNA，避免多糖與DNA的共沉淀。
7.如權利要求6所述的方法，其中至少兩個緩沖液系統分別為緩沖液系統I和緩沖液系統2，緩沖液系統I中含有GuSCN及其酸性緩沖系統，緩沖液系統2中含有PVP及包括SLS的緩沖液系統。
8.如權利要求6或7中任一項所述的方法，其中緩沖系統I不含有苯酚或氯仿或其它有毒有害物質。
9.如權利要求6-8中任一項所述的方法，其中緩沖液系統I包括:1-5MGuSCN ；0.2_1M檸檬酸鈉；0.l-0.5M檸檬酸；0.1-1.0M氯化鈉0.2-0.8M乙酸鈉(PH 4.2)冰乙酸。
10.如權利要求6-9中任一項所述的方法，其中緩沖液系統2包括:0.1% -3% PVP40 ；.0.1% -2% SLS ；0.2M-1M Tris-CL ；0.2M-1M EDTA0
【文檔編號】C12N15/10GK104313012SQ201410471677
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月16日 優先權日:2014年9月16日
【發明者】張益文, 楊敏生, 王進茂, 張軍 申請人:河北農業大學, 張益文