一種重組免疫缺陷質粒和病毒以及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體公開了一種重組免疫缺陷質粒和病毒以及應用。本發明所述免疫缺陷質粒包括LTR、gag基因、SEQ ID No.1所示核苷酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因和nef基因。本發明通過在致病性的SIVmac239全長質粒框架上引入SEQ ID No.1所示核苷酸序列，構建出包含多個藥物靶點的免疫缺陷質粒，并在293T細胞中包裝產生免疫缺陷病毒，該病毒具有感染靶細胞的能力和高效的復制能力，能夠應用在研究艾滋病毒體內感染過程、病原特性、發病機理、免疫反應以及篩選抗HIV藥物和抗HIV藥物用藥策略中。CGMCC No.95792014.08.29
【專利說明】一種重組免疫缺陷質粒和病毒以及應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種重組免疫缺陷質粒和病毒以及應用。

【背景技術】
[0002] 艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)，是由于感染人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV)而 導致的一種免疫缺陷病，同時可并發一系列機會性感染及腫瘤，嚴重者可導致死亡的綜合 征。1983年人類首次發現HIV，至今已有三十余年，目前該病毒仍然嚴重威脅著人類的健康 和生命。疫苗和藥物是人類防治傳染性疾病的兩種主要思路和研究方向。直到目前為止， 艾滋病疫苗研發尚未成功，臨床上藥物治療仍然占據主導地位。
[0003] 目前用于臨床的抗艾滋病藥物普遍具有很強的毒副作用，嚴重損害了其他正常代 謝器官，加重了病人的痛苦。針對這些現狀，科研人員正在研究毒副作用小，更加有效的新 一代藥物和治療方案。抗HIV新藥研發及聯合用藥策略探索需要體內評價用靶標病毒。猴 /人嵌合免疫缺陷病毒（Simian/Human Chimeric Immunodeficiency Virus, SHIV)是目前廣 泛應用于藥物有效性實驗當中，其以猴免疫缺陷病毒SIV作為骨架，將其中env、tat和rev 基因由人免疫缺陷病毒的相應片段所替換。
[0004] 但是這些嵌合病毒仍然存在一定的局限性，含有的藥物靶點比較單一，不能綜合 評估多種藥物治療效果。此外，構建猴/人嵌合免疫缺陷病毒能否具有感染細胞的能力是 成功與否的重要標準，嵌入的基因以及位點的不適宜雖然在分子水平上能夠構建出正確的 病毒全長質粒，但是包裝成病毒后無感染能力，這其中需要極為精密的構建策略。


【發明內容】

[0005] 有鑒于此，本發明的目的是提供一種重組免疫缺陷質粒和病毒以及應用，使得所 述免疫缺陷質粒包裝成的病毒具有多個藥物靶點；
[0006] 本發明的另一個目的是提供一種重組免疫缺陷質粒和病毒以及應用，使得所述免 疫缺陷質粒包裝成的病毒具有感染靶細胞的能力；
[0007] 本發明的另一個目的是提供一種重組免疫缺陷質粒和病毒以及應用，使得所述免 疫缺陷質粒包裝成的病毒具有高效的復制能力。
[0008] 為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0009] 一種重組免疫缺陷質粒，其特征在于，包括LTR、gag基因 、SEQ ID No. 1所示核苷 酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因和nef基因。
[0010] 其中，所述env基因、tat基因和rev基因部分重疊，這屬于本領域公知。
[0011] 優選地，所述免疫缺陷質粒從5'端開始由LTR、gag基因 、SEQ ID No. 1所示核苷 酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因、nef基因和LTR組成。 質粒結構示意圖見圖1。
[0012] 更優選地，所述免疫缺陷質粒核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0013] 本發明利用基因重組技術，在致病性的SIVmac239全長質粒框架上引入SEQ ID No. 1所示核苷酸序列，其上同時包含了 HIV-1CRF01-AE亞型的蛋白酶基因 PR、逆轉錄酶基 因 RT和整合酶基因 IN，構建出一種新型的具有多個藥物靶點的線性免疫缺陷質粒，并且其 包裝成病毒后具有感染靶細胞的能力和高效的復制能力。
[0014] 此外，本發明還提供了所述免疫缺陷質粒的構建方法，包括：
[0015] 以點突變PCR在SEQ ID No. 1所示核苷酸序列兩端分別引入Apa I和Nhe I酶切 位點，然后連入T載體中；
[0016] 以SIVmac2395'端半長質粒p239SpSp5'為模板，通過重疊 PCR在Pol基因兩端引 入Apa I和Nhe I酶切位點，然后雙酶切獲得去掉Pol基因的p239SpSp5'質粒片段；
[0017] Apa I和Nhe I雙酶切連入SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的T載體，然后SEQ ID No. 1所示核苷酸序列與去掉Pol基因的p239SpSp5'質粒片段連接，最后連接SIVmac2393' 端半長質粒p239SpE3'，獲得所述重組免疫缺陷質粒。
[0018] 作為優選，上述以點突變PCR在SEQ ID No. 1所示核苷酸序列兩端分別引入Apa I 和Nhe I酶切位點，然后連入T載體中的步驟為：
[0019] 通過分別帶有Apa I和Nhe I酶切位點的上游引物（SEQ ID No. 3所示核苷酸序 列）和下游引物（SEQ ID No. 4所示核苷酸序列），以點突變PCR在SEQ ID No. 1所示核苷 酸序列兩端分別引入Apa I和Nhe I酶切位點，然后連入T載體；
[0020] F ：ATCCTTTAGCGGGCCCCAAATCACTCTTTG(Apa I) ；R ：CATGTGCTAGCCCTCATCCTGTCTAC TTGCCACAC(Nhe I)〇
[0021] 作為優選，上述以SIVmac2395'端半長質粒p239SpSp5'為模板，通過重疊 PCR在 Pol基因兩端引入Apa I和Nhe I酶切位點，然后雙酶切獲得去掉Pol基因的p239SpSp5' 質粒片段的步驟為：
[0022] 以SIVmac2395'端半長質粒p239SpSp5'為模板，通過分別帶有Apa I酶切位點的 兩對引物 2982-F 和 3736-R(SEQ ID No. 5-6 所示核苷酸序列）、3736-F 和 6307-R(SEQ ID No. 7-8所示核苷酸序列）擴增，然后以所獲得的擴增產物為模板，通過引物2982-0V-F和 6307-0V-R(SEQ ID No. 9-10所示核苷酸序列）擴增出pol基因5'端引入單酶切位點Apa I 的 3539bp P-12 片段；
[0023] 2982-F ：TTAGGGAGCCGTCAGGATCAGATAT, 3736-R ：AAGAGAGAATTGGGGCCCAGCAAATCCT CT(Apa I)；
[0024] 3736-F ： AGAGG AT T TGC TGGGCCC CAA T T C T CT CT T (Apa I) , 6307-R ： ACTGCTCCTTCCCCTTTCCACAATA ；
[0025] 2982-0V-F :AGGATCAGATATTGCAGGAACAACT，6307-0V-R GCCTTCTCTGTAATAGACCCGAAA A ；
[0026] 以SIVmac2395'端半長質粒p239SpSp5'為模板，通過分別帶有Nhe I酶切位點的 兩對引物 6307-F和 6591-R(SEQ ID No. 11-12 所示核苷酸序列）、6591-F和 7056-R(SEQ ID No. 13-14所示核苷酸序列）擴增，然后以所獲得的擴增產物為模板，通過引物6307-0V-F和 7056-0V-R(SEQ ID No. 15-16所示核苷酸序列）擴增出pol基因3'端引入單酶切位點Nhe I 的 899bp P-34 片段；
[0027] 6307-F ：AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA,6591-R = ATATTT TATGAGGCTAGCCCACCTCTCTAG(Nhe I)；
[0028] 6 59 I-F ： CTAGAGAGGTGGGCTAGCCTCATAAAATAT (Nhe I) , 7056-R ： CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT ；
[0029] 6307-0V-F :AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA，7056-0V-R : CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT。
[0030] 將P-12和P-34分別連入T載體中得到質粒T-12和T-34,質粒T-12和質粒 p239SpSp5'通過BsrG I和Pac I雙酶切連接反應將單酶切位點Apa I引入到p239SpSp5' 中，然后將所得質粒和質粒T-34通過Pac I和BstB I雙酶切連接反應將單酶切位點Nhe I 引入到p239SpSp5'中，Apa I和Nhe I雙酶切獲得去掉Pol基因的p239SpSp5'質粒片段。
[0031] 本發明還提供了由本發明所述免疫缺陷質粒在包裝細胞中包裝產生的免疫缺陷 病毒。
[0032] 作為優選，所述包裝細胞為293T細胞。更優選地，所述免疫缺陷病毒保藏編號為 CGMCC No. 9579,簡稱 Pol-SHIV。
[0033] 本發明所述免疫缺陷病毒具有感染性，使用病毒特異性抗體染色Pol-SHIV感染 CEMxl74細胞，流式細胞檢測結果顯示，未感染Pol-SHIV的CEMxl74細胞背景為1. 02%;而 感染Pol-SHIV的CEMxl74細胞，陽性細胞達到11. 30%。
[0034] 本發明所構建的免疫缺陷病毒接種TZM-bl細胞的熒光強度在2500-4000RLU之 間，大于細胞對照2. 5倍的cutoff值，說明本發明所述Pol-SHIV病毒能感染TZM-bl細胞， 該病毒是一個具有感染靶細胞能力的病毒，且與SIVmac239毒株具有相似的生物學特性。 在此基礎上，本發明進一步測定了免疫缺陷病毒的TCID 5tl為700TCID5(l/mL。
[0035] 同時，本發明所述免疫缺陷病毒SIV P27蛋白含量和逆轉錄酶活性均高于猴免疫 缺陷病毒，表明其具有高效的復制能力。因此，本發明還提供所述免疫缺陷質粒以及所述免 疫缺陷病毒在研究艾滋病毒體內感染過程、病原特性、發病機理、免疫反應以及篩選抗HIV 藥物和抗HIV藥物用藥策略中的應用。
[0036] 由以上技術方案可知，本發明通過在致病性的SIVmac239全長質粒框架上引入 SEQ ID No. 1所示核苷酸序列，構建出包含多個藥物靶點的免疫缺陷質粒，并在293T細胞中 包裝產生免疫缺陷病毒，該病毒具有感染靶細胞的能力和高效的復制能力，能夠應用在研 究艾滋病毒體內感染過程、病原特性、發病機理、免疫反應以及篩選抗HIV藥物和抗HIV藥 物用藥策略中。
[0037] 生物材料保藏信息說明：
[0038] Pol-SHIV，分類命名：含HIV-IPol基因的雜交免疫缺陷病毒，于2014年8月29日 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 9579。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0039] 圖1示本發明所述免疫缺陷質粒結構示意圖；其中元件A表示SEQ ID No. 1所示 核苷酸序列；
[0040] 圖2示本發明所述免疫缺陷質粒的酶切鑒定圖；其中M為DL10K，1為EcoR I酶切 條帶，2為Apa I酶切條帶，3為Nhe I酶切條帶；
[0041] 圖3示CEMxl74細胞表面病毒蛋白表達的流式細胞儀圖譜；其中，A為未感染 CEMxl74細胞；B為Pol-SHIV感染CEMxl74細胞第9天。

【具體實施方式】：
[0042] 本發明公開了一種重組免疫缺陷質粒和病毒以及應用，本領域技術人員可以借鑒 本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技 術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的免疫缺陷質粒和病毒及 應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍 內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0043] 下面結合實施例，進一步闡述本發明。
[0044] 實施例1 :構建本發明所述免疫缺陷質粒
[0045] 通過分別帶有Apa I和Nhe I酶切位點的上游引物（SEQ ID No. 3所示核苷酸序 列）和下游引物（SEQ ID No. 4所示核苷酸序列），以點突變PCR在SEQ ID No. 1所示核苷 酸序列兩端分別引入Apa I和Nhe I酶切位點，然后連入T載體；
[0046] F ：ATCCTTTAGCGGGCCCCAAATCACTCTTTG(Apa I) ；R ：CATGTGCTAGCCCTCATCCTGTCTAC TTGCCACAC(Nhe I)〇
[0047] 以SIVmac2395'端半長質粒p239SpSp5'為模板，通過分別帶有Apa I酶切位點的 兩對引物 2982-F 和 3736-R(SEQ ID No. 5-6 所示核苷酸序列）、3736-F 和 6307-R(SEQ ID No. 7-8所示核苷酸序列）擴增，然后以所獲得的擴增產物為模板，通過引物2982-0V-F和 6307-0V-R(SEQ ID No. 9-10所示核苷酸序列）擴增出pol基因5'端引入單酶切位點Apa I 的 3539bp P-12 片段；
[0048] 2982-F ：TTAGGGAGCCGTCAGGATCAGATAT, 3736-R ：AAGAGAGAATTGGGGCCCAGCAAATCCT CT(Apa I)；
[0049] 3736-F ： AGAGG AT T TGC TGGGCCC CAA T T C T CT CT T (Apa I) , 6307-R ： ACTGCTCCTTCCCCTTTCCACAATA ；
[0050] 2982-0V-F :AGGATCAGATATTGCAGGAACAACT，6307-0V-R GCCTTCTCTGTAATAGACCCGAAA A ；
[0051] 以SIVmac2395'端半長質粒p239SpSp5'為模板，通過分別帶有Nhe I酶切位點的 兩對引物 6307-F和 6591-R(SEQ ID No. 11-12 所示核苷酸序列）、6591-F和 7056-R(SEQ ID No. 13-14所示核苷酸序列）擴增，然后以所獲得的擴增產物為模板，通過引物6307-0V-F和 7056-0V-R(SEQ ID No. 15-16所示核苷酸序列）擴增出pol基因3'端引入單酶切位點Nhe I 的 899bp P-34 片段；
[0052] 6307-F ：AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA,6591-R = ATATTT TATGAGGCTAGCCCACCTCTCTAG(Nhe I)；
[0053] 6 59 I-F ： CTAGAGAGGTGGGCTAGCCTCATAAAATAT (Nhe I) , 7056-R ： CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT ；
[0054] 6307-0V-F :AGAAGGGGAGGAATAGGGGATATGA，7056-0V-R : CATCATGCCAGTATTCCCAAGACCT。
[0055] 將P-12和P-34分別連入T載體中得到質粒T-12和T-34,質粒T-12和質粒 p239SpSp5'通過BsrG I和Pac I雙酶切連接反應將單酶切位點Apa I引入到p239SpSp5' 中，然后將所得質粒和質粒T-34通過Pac I和BstB I雙酶切連接反應將單酶切位點Nhe I 引入到p239SpSp5'中，Apa I和Nhe I雙酶切獲得去掉Pol基因的p239SpSp5'質粒片段。 [0056] Apa I和Nhe I雙酶切連入SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的T載體，然后SEQ ID No. 1所示核苷酸序列與去掉Pol基因的p239SpSp5'質粒片段連接，最后連接SIVmac2393' 端半長質粒p239SpE3'，獲得所述重組免疫缺陷質粒。
[0057] 實施例2 :所述免疫缺陷質粒的大量制備
[0058] 將所述免疫缺陷質粒轉化JM109菌株，30°C平板培養18?20小時后，挑取單菌 落接種到5mL含有氨芐的LB液體培養基中。30°C，180rpm震蕩培養12?14小時后，取 I. 5mL菌體培養液進行質粒小提，酶切鑒定無誤后，將剩余的3. 5mL菌體培養液全部接種到 IL含有氨芐的2X YT液體培養基中。30°C、180rpm震蕩培養12小時后，取I. 5mL菌體培養 液再次進行小提，酶切鑒定無誤后，參照Qiagen公司的的說明書，將IL的菌液用Endofree Plasmid Giga Kit進行質粒的大量制備。步驟如下：
[0059] (1)將菌液于4°C，6000rpm離心15min，棄去上清,將沉淀重懸于500ml冰預冷的 STE溶液中，4°C，6000rpm離心15min，棄去上清；
[0060] (2)菌體沉淀重懸于125ml的Buffer Pl中，振蕩至無沉淀團塊出現，加入125ml 的Buffer P2,輕輕的顛倒離心管數次，室溫下靜置5min，待裂解充分后加入125ml的 Buffer P3,顛倒離心管數次，充分混勻；
[0061] (3)將混勻后的裂解產物倒入濾器（Mega-Giga Cartridge)中，室溫下靜置20min 以上，打開真空泵加壓抽濾，待液體抽濾完畢后，加入50ml的Buffer FWB2,用無菌玻璃棒 輕輕攪動沉淀團塊，繼續進行抽濾；
[0062] (4)在裂解液中加入30ml的Buffer ER，顛倒混勻，冰浴30min，待溶液澄清后加入 預先用75ml的Buffer QBT平衡好的制備柱；
[0063] (5)待裂解液完全通過DNA制備柱后，用600ml的Buffer QC洗脫雜質，待液體全 部過柱后，以IOOml的洗脫液Buffer QN洗脫DNA ;
[0064] (6)收集DNA洗脫液，加入70ml的異丙醇，充分混勻后，于12°C，IOOOOrpm離心 50min ；
[0065] (7)小心倒去上清，用IOml 70%乙醇洗滌沉淀，棄去乙醇洗液，離心管倒置在紙 巾上自然干燥；
[0066] (8)加入5ml-10ml的生理鹽水溶解質粒DNA ;
[0067] (9)分光光度計測定質粒DNA的濃度，根據測定的質粒濃度稀釋為終濃度為1 μ g/ μ 1(或 0.4yg/y l，40ng/y 1)，-20°C保存。
[0068] 結果得到2. 205mg的所述免疫缺陷質粒，使用三個限制性內切酶（EcoR I，Apa I 和Nhe I)酶切所述免疫缺陷質粒，酶切產物電泳圖見圖2,結果顯示：EcoR I不能酶切該質 粒，Apa I把質粒剪切成兩段，長度分別為7725bp和5476bp，Nhe I把質粒剪切成兩段，長 度分別為9865bp和3336bp，證明成功構建序列正確的免疫缺陷質粒。同時使用PCR方法特 異性擴增所述免疫缺陷質粒中的SEQ ID No. 1所示核苷酸序列，序列測定發現質粒保持穩 定。
[0069] 實施例3 :本發明所述免疫缺陷質粒的轉染包裝
[0070] 使用實施例2制備的所述免疫缺陷質粒轉染293T細胞，獲得具有感染性的完整病 毒顆粒，使用6孔板進行293T細胞培養并獲得病毒顆粒，具體步驟如下：
[0071] (1)用10 %完全DMEM培養基將293T細胞鋪入6孔板中（5 X IO5/孔），過夜培養， 細胞密度達到70%，目的是為了培養較長時間。
[0072] (2)每孔用2ml不含抗生素的完全DMEM培養基換液，繼續培養2小時。
[0073] (3)將5 μ g所述免疫缺陷質粒DNA稀釋于650 μ 1無血清、無抗生素的DMEM培養 基，輕輕混勻。
[0074] (4) 10 μ I Lipofectamine 2000試劑（使用前輕輕混勻）稀釋于650 μ 1無血清、 無抗生素的DMEM培養基，室溫孵育5分鐘。
[0075] (5)將稀釋的質粒DNA和稀釋的Lipofectamine 2000試劑（總體積為I. 3ml)混 合，輕輕混勻，室溫20分鐘，注意：溶液可能會混濁，但不會影響轉染。
[0076] (6)直接將混合液分別加入每孔細胞中，輕輕搖動孔板混勻，5% C02, 37°C培養5 小時。
[0077] (7)取2ml新鮮的2%完全培養基換液，5% C02, 37°C培養40小時。
[0078] (8)收集每孔上清，用0.45 μ M濾器過濾后，獲得包含所述免疫缺陷病毒的上清。
[0079] 用SIV Ρ27抗原檢測試劑盒測定，轉染上清檢測到高水平的SIVP27抗原含量，SIV Ρ27抗原含量大于33. llng/mL，證明轉染出能高水平表達的免疫缺陷病毒Pol-SHIV。所述 免疫缺陷病毒Pol-SHIV于2014年8月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編 號為 CGMCC No. 9579
[0080] 實施例4 :本發明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV感染CEMxl74細胞試驗
[0081] 使用病毒特異性抗體染色Pol-SHIV感染CEMxl74細胞，流式細胞檢測結果見圖3。 A為未感染Pol-SHIV的CEMxl74細胞背景1. 02% ;B為感染Pol-SHIV的CEMxl74細胞，感 染第9天，陽性細胞達到11. 30%。表明本發明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV具有感染性。
[0082] 實施例5 :本發明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的TCID5tl滴定
[0083] 對所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV在TZM-bl細胞中單循環感染周期（48小時培養） 的 TCID5tl 進行測定，將對照的 relative luminescence units(RLU)的 2. 5 倍定為 Cutoff 值。步驟如下：
[0084] (1)將所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV從液氮中取出后4°C緩慢融化，用完全DMEM培 養基2倍稀釋病毒，取100 μ 1病毒稀釋液加入96孔培養板中，設四孔重復。
[0085] (2) IOml 含 45 μ g/ml DEAE 的完全培養基實驗前補充 30 μ I Indinavir。
[0086] (3)消化一瓶TZM-bl細胞，離心，用3ml完全培養基懸浮細胞，取Iml細胞懸浮液， 加3ml完全培養基以及8ml含45 μ g/ml DEAE完全培養基，混勻，每孔加100 μ 1。
[0087] (4)用封口膜封住平板四周，37 °C，5 % CO2孵育48小時。
[0088] (5)除去培養基，200 μ I I XPBS洗一遍。加入50 μ I CCRL裂解液，室溫400rpm 振蕩30分鐘。鏡下觀察細胞是否裂解完全。
[0089] (6)將細胞裂解液轉移到黑色96孔讀數板中（0ptiplate-96F)，避免氣泡產生。
[0090] (7)避光在96孔讀數板中每孔加入50 μ I Iuciferase底物，輕輕振蕩混勻。
[0091] (8)將96孔讀數板上機（1420Multilabel Counter)，計數熒光強度。
[0092] (9)半數細胞感染劑量TCID5tl可運用Reed-Muench法公式計算：
[0093] TCID5tl = CPE>50 %病毒稀釋度+(>50 %的百分數-50)八50 %的百分數-〈50 %的 百分數）
[0094] TZM-bl細胞表達功能性TAT蛋白，激活熒光素酶報告基因的表達，并且感染細胞 的病毒量與細胞產生的熒光素酶活性成正比，而沒感染病毒細胞的熒光素酶活性很差。根 據該原理檢測本發明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的感染性，結果發現細胞對照的熒光強 度為638RLU，Pol-SHIV轉染上清1:2稀釋后，接種TZM-bl細胞的熒光強度在2500-4000RLU 之間，大于細胞對照2. 5倍的cutoff值，說明本發明所述Pol-SHIV病毒能感染TZM-bl細 胞，該病毒是一個具有感染靶細胞能力的病毒，且與SIVmac239毒株具有相似的生物學特 性。在此基礎上，進一步測定了轉染上清的TCID 5tl，經計算，本發明構建質粒轉染上清中含 有 700TCID5Q/mL 的病毒。
[0095] 實施例6 :本發明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的生物活性鑒定
[0096] 所測樣品為：本發明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV、猴免疫缺陷病毒SIVmac239。
[0097] 1、測定 SIVP27 蛋白
[0098] 取 450 μ L樣品加入 50 μ L Lysing Buffer，振蕩混勻。用 300 μ L IXPlate Wash Buffer洗板，扣干，洗6次。加入梯度稀釋的標準品，每孔200 μ L，留一孔作空白對照，力口 入處理好的樣品20(^1^。封板，371：孵育2小時。洗板。加入10(^1^31￥?27〇6七6(^(^ Antibody,空白孔不加。封板，37 11C孵育1小時；洗板。加入IOOyL Streptavidin Peroxidase Working Solution,空白孔不加。封板，37°C孵育30分鐘；洗板。加入IOOyL Substrate Working Solution,不封板，室溫孵育30分鐘，用酶標儀讀數，結果見表1。
[0099] 2、測定逆轉錄酶活性
[0100] 取樣品于4°C、8000Xg離心IOmin去除細胞碎片；上清移入新的離心管。將PEG 與含病毒上清以1:2體積比小心混勻，冰上置放過夜。4°C，8000Xg離心10min。棄上清 并盡量移去PEG。用50-60 μ L裂解液（solution 4)重懸沉淀，15-25°C放置30min，以完 全裂解病毒。取40 μ L移入一新離心管,加入20 μ L反應液（solution 3a)于病毒裂解液 中，37°C孵育1?15h。取微孔板固定好并標記名稱，將60 μ L逆轉錄液移入微孔板，加蓋于 37°〇孵育111。仔細移去微孔板內上清，用250^洗液（8〇11^ 〇116)清洗5次，每次308，最 后盡量去凈上清。每孔加入20(^1^311衍-016-?00工作液（8〇11^丨〇1153)，55:58 = 1:100 稀釋，加蓋37°C孵育lh。盡量移去上清，用250 μ L洗液（solution 6)清洗5次，每次30s， 最后盡量去凈上清。每孔加入ABTS基質液（Solution 7)或含基質增強劑的ABTS基質液 (solution 7a) 200 μ L 15?25°C孵育至顯色，酶標儀讀數，結果見表1。
[0101] 表1本發明所述免疫缺陷病毒Pol-SHIV的生物活性鑒定
[0102]

【權利要求】
1. 一種重組免疫缺陷質粒，其特征在于，包括LTR、gag基因、SEQ ID No. 1所示核苷酸 序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因和nef基因。
2. 根據權利要求1所述免疫缺陷質粒，其特征在于，從5'端開始由LTR、gag基因 、SEQ ID No. 1所不核苷酸序列、vif基因、vpr基因、vpx基因、tat基因、rev基因、env基因 、nef 基因和LTR組成。
3. 根據權利要求1或2所述免疫缺陷質粒，其特征在于，所述免疫缺陷質粒核苷酸序列 如 SEQ ID No. 2 所示。
4. 一種重組免疫缺陷質粒的構建方法，其特征在于，包括： 將SEQ ID No. 1所示核苷酸序列連入去掉Pol基因的SIVmac239全長質粒片段中，獲 得所述重組免疫缺陷質粒。
5. 根據權利要求4所述構建方法，其特征在于，包括： 以點突變PCR在SEQ ID No. 1所示核苷酸序列兩端分別引入Apa I和Nhe I酶切位點， 然后連入T載體中； 以SIVmac2395'端半長質粒p239SpSp5'為模板，通過重疊 PCR在Pol基因兩端引入 Apa I和Nhe I酶切位點，然后雙酶切獲得去掉Pol基因的p239SpSp5'質粒片段； Apa I和Nhe I雙酶切連入SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的T載體，然后SEQ ID No. 1 所示核苷酸序列與去掉Pol基因的p239SpSp5'質粒片段連接，最后連接SIVmac2393'端半 長質粒p239SpE3'，獲得所述重組免疫缺陷質粒。
6. 權利要求1-3任意一項所述免疫缺陷質粒在包裝細胞中包裝產生的免疫缺陷病毒。
7. 根據權利要求6所述免疫缺陷病毒，其特征在于，所述包裝細胞為293T細胞。
8. 根據權利要求7所述免疫缺陷病毒，保藏編號為CGMCC No. 9579。
9. 權利要求1-3任意一項所述免疫缺陷質粒在研究艾滋病毒體內感染過程、病原特 性、發病機理、免疫反應以及篩選抗HIV藥物和抗HIV藥物用藥策略中的應用。
10. 權利要求6-8任意一項免疫缺陷病毒在研究艾滋病毒體內感染過程、病原特性、發 病機理、免疫反應以及篩選抗HIV藥物和抗HIV藥物用藥策略中的應用。
【文檔編號】C12N15/66GK104263745SQ201410471676
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月16日 優先權日:2014年9月16日
【發明者】王衛, 鞠斌, 董志會, 叢喆, 鮑琳琳, 魏強, 秦川 申請人:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所