獲取綿羊激活素ii型受體基因及其突變體的方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種獲取綿羊激活素II型受體(ActRIIB)基因及其突變體的方法與應用，包括克隆ActRIIB基因編碼區全長cDNA序列；ActRIIB及其定點突變型慢病毒載體的構建；穩定表達ActRIIB及突變體的細胞系篩選。本發明在細胞水平發現ActRIIB突變體對綿羊原代成肌細胞具有增殖作用，為進一步探索ActRIIB在家畜肌肉細胞生長分化過程所涉及的分子機制研究奠定基礎。
【專利說明】獲取綿羊激活素11型受體基因及其突變體的方法與應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及動物基因工程領域，具體是一種獲取綿羊激活素 II型受體基因及其 突變體的方法與應用。

【背景技術】
[0002] 激活素是最早在性腺發現的糖蛋白激素，屬于轉化生長因子TGF-β超家族成員， 1986年首次從牛的卵泡液中分離、純化。激活素受體ActR屬于TGF-β超家族成員的絲氨 酸/蘇氨酸蛋白激酶型受體，根據其結構和功能上的特性，激活素受體可分為兩類，激活素 I型和II型受體。激活素 II型受體是一種糖蛋白，也是一種結構激活型的受體。它由510 個氨基酸組成，含有一個富含半胱氨酸的N端胞外配體結合結構域l_135aa，一個疏水跨膜 區和一個胞內絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域159-510aa，包括兩個亞型，即激活素 II型受體A 和激活素 II型受體B。序列比對結果顯示，激活素 IIB型受體在不同物種間存在很高的同 源性，牛的ActRIIB與人、小鼠的序列同源性分別為93%和91%。
[0003] ActRIIB與配體結合后募集I型受體形成配體受體復合物從而啟動下游信號轉 導，II型受體起著配體結合和特異性識別的雙重功能，因此II型受體的結構和功能備受關 注。已有研究證明Myostatin的信號轉導途徑與TGF-β家族成員相似，都是通過I型和 II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異源二聚體來進行信號轉導。和TGF-β家族成員一樣， Myostatin引發的信號傳導首先要與II型受體結合，然后再與I型受體結合，一旦異源二聚 體受體復合物形成，II型受體使I型受體磷酸化，磷酸化的受體I進一步使細胞內的轉錄 因子Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3會進一步和Smad4結合，并進入細胞核，從而調節 靶基因的表達。 ActRIIB有多種配體，如Myostatin,它屬于TGF-beta超家族成員，是公認的肌肉生長 的負調控因子，可通過與其結合調節肌肉生長，目前拮抗肌肉生長抑制素已被證明可增加 動物的瘦肌肉質量。而激活素受體IIB突變體與MSTN結合后形成的復合物不能與I型受 體結合，從而能夠達到阻斷MSTN下游信號傳導、抑制MSTN的功能。
[0004] ActRIIB在Myostatin信號轉導中的作用得到了體內實驗的進一步支持。Johns Hopkins大學的Se-Jin Lee等建立表達非活性結構域ActRIIB的轉基因小鼠，這種非活性 結構域的受體雖然能夠和Myostatin結合，但由于缺乏胞內激酶結構域，使得ActRIIB不 能與I型受體結合，因此不能激活Smad蛋白功能從而阻斷Myostatin生物學功能，導致轉 基因小鼠體重與對照小鼠相比增加25%。此外，通過轉基因表達的ActRIIB突變體能夠與 MSTN競爭性結合，阻斷或減弱MSTN與細胞膜上的內源性ActRIIB的結合，從而抑制下游 信號傳導，最終阻斷或減弱MSTN對肌肉生長的抑制作用，造成轉基因小鼠肌肉異常增生肥 大。Samuel Μ等用可溶性的ActRIIB注射8周的C57BL/6小鼠，28天后注射小鼠的平均 體重比對照組增加了 16 %。2005年Se-Jin Lee等又報道了將可溶性的Activin IIB受 體注射入野生型小鼠體內，2周內小鼠肌肉比對照組增加60%。ActRIIB突變體在轉基因 鼠上的表達引起骨骼肌肥大，說明ActRIIB受體在調節肌肉肥大方面起著關鍵作用。2010 年，Xiaolan Zhou等運用生物工程技術制造了一個叫sActRIIB的可溶性受體蛋白，即一個 可以同時阻斷myostatin和activin A的大分子實驗藥物，并將其注射到正常的小鼠肌肉 和癌癥模型小鼠肌肉內，結果發現盡管對腫瘤生長速率沒有影響，而且對脂肪的損耗以及 炎癥因子的增高也沒有影響，但有效地逆轉了肌肉消融，結果導致結腸癌小鼠的存活期大 大延長。此外，Raouia等的研究證實，ActRIIB突變體蛋白與天然的ActRIIB蛋白相比，前 者能顯著增加肌原細胞數量。這些結果提示ActRIIB突變體可能通過抑制Myostatin的基 因表達促進肌肉生長。
[0005] 由于目前已經報道的針對ActRIIB突變體阻斷myostatin促進肌肉生長的研究結 果大多集中在低等脊椎動物和小鼠上，在畜禽等大動物上的研究未見報道，而且目前缺乏 綿羊ActRIIB全長序列，因此，克隆綿羊激活素 II型受體基因，解析ActRIIB基因及其突 變體在家畜肌肉細胞生長過程中的作用，為今后研制促肌肉生長制劑或轉基因動物奠定基 礎，也為提高家畜產肉性能提供新的思路。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種獲取綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的方法與 應用，以解決上述【背景技術】中提出的問題。
[0007] 為實現上述目的，本發明提供如下技術方案： 一種獲取綿羊激活素 II型受體基因全長編碼區及其突變體的方法，包括ActRIIB編碼 區全長cDNA序列克隆；ActRIIB基因的定點突變及慢病毒載體的構建；穩定表達ActRIIB 及突變體細胞系的篩選；所述克隆ActRIIB基因編碼區全長cDNA序列，采集綿羊肝臟組 織，用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA并反轉錄，設計克隆引物P1 :5' -GGCACCGCGGAACAT GACGGCGCCCTGGGCGGCCC-3'，P2 :5' -GTGTCCTGGGCTTAGATGCTC GACTC-3'，通過 RT-PCR 方法 擴增綿羊ActRIIB全長編碼區序列，將符合預期大小片段克隆至pMD 18T載體，測序，陽性 質粒命名為pMD 18T-ActRIIB ;所述的ActRIIB及其定點突變型慢病毒載體的構建，以pMD 18T-ActRIIB 質粒為模板，以引物 P3 :5' -ATAGGATCCGCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTG-3' (Bam Η I)， P:5, -GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGATGCTCGACTC-3' (Notl)，將 ActRIIB亞克隆至慢病毒表達載體pLEX-MCS中，獲得慢病毒表達載體pLEX-ActRIIB，可表 達全長形式的綿羊ActRIIB。
[0008] 以引物 P5 :5 ' -GCCGGATCCATGGCCCTCGCCCTCCTCTG-3 '（BamHI)，P6 :5 ' -CCCCTCGAG TTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTACACCTGGGGGTT CTCCTCG-3'（Xhol)，亞克隆入慢病毒 載體pLEX-MCS，獲得慢病毒表達載體pLEX-dnActRIIB，可表達截短的ActRIIB，即第7-100 位氨基酸序列。將上下游分別是Agel和Xhol酶切位點的IgG-Fc基因片段，與經Agel和 Xhol雙酶切的pLEX-dnActRIIB大片段進行連接，獲得重組質粒pLEX-dnActRIIB-IgG Fc， 可表達帶 IgG-Fc 標簽的截短型 ActRIIB(7-100aa)質粒 dnActRIIB-IgG Fc。
[0009] 利用Stratagene定點突變試劑盒將dnActRIIB-IgG Fc序列的第79位氨基酸 賴氨酸（L)分別定點突變為脯氨酸（P)和谷氨酸（E)，L79P定點突變正向引物是P7 : 5 ' -GAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT-3'，反向引物是 P8 :5' -AGTTGAAGTCGTCCGGCCAGCAG CCCTTC-3'，L79E 定點突變正向引物分別是 P9 :5' -CAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACGACTTCAACT GC-3 '，反向引物是 P10 :5 ' -GCAGTTGAAGTCGTCCTCCCAGCAGCCCTTCTTG-3 '。分別構建獲得 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E 慢病毒重組表達質粒； 所述穩定表達ActRIIB基因及突變體細胞系的篩選，是將構建的ActRIIB基因及突變 體的慢病毒重組表達質粒轉染293T細胞，進行慢病毒的包裝，并感染分離培養的綿羊原代 成肌細胞，獲得穩定表達綿羊ActRIIB全長及突變體的成肌細胞系。
[0010] 作為本發明進一步的方案：所述的綿羊ActRIIB基因的三種突變體，突變形式為 氨基端截短及其單堿基突變。
[0011] 作為本發明進一步的方案：所述穩定表達ActRIIB基因及突變體細胞系的 篩選具體步驟是：a、293T細胞培養：條件37 °C，5%的C02，完全培養液（DMEM+10%的 胎牛血清)，六孔板每孔鋪6-7 X 105個細胞，20小時后細胞匯合度達到80-90% ;b、 Lipofectamine 2000脂質體轉染：加入25〇μ?預熱的Opti-MEM培養基后，按下列比例分 別加入轉染質粒 pLEX-ActRIIB、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E 2 μ g、包裝質粒 psPAX2 1· 5 μ g、包膜質粒 pMD2. G 0· 5 μ g、 輕輕混勻；另取25〇μ? Opti-MEM培養基，向其中加入8μ?脂質體，室溫放置5min后，將上 述稀釋好的DNA與脂質體混合，置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養基清洗 待轉染細胞一次，將脂質體和DNA復合物加入細胞；將細胞培養板放回37°C培養箱中孵育； 2-4小時后，移去脂質體和DNA復合物，在每孔加入2ml新鮮的完全培養液，重新將細胞培 養板放回37°C培養箱中培養；c、病毒包裝：培養48h后收集含慢病毒的上清液，用0. 45Mm 過濾器過濾，收集濾過液，此時病毒能夠直接用來感染或_70°C凍存；收集細胞，提取蛋白 進行Western blotting檢測ActRIIB全長和ActRIIB突變體的表達；d、病毒感染：6孔板 中每孔鋪4. 5-5 X 105個綿羊原代成肌細胞；次日待匯合度達到70%左右時，棄去培養液，力口 入50〇μ?病毒（c步驟濾過液)、50〇μ?完全培養液、同時加入1PL polybrene，將細胞置于5% C02、37°C培養箱中培養；e、穩定細胞系篩選：病毒感染24h后棄去病毒液，0. 05%胰酶消化 6孔板中的細胞轉入10cm培養皿中，待細胞完全貼壁后，加入0. 25μ g/mL Puromycin進行 篩選；為了獲得穩定整合外源基因的表達細胞系，每隔2-3天更換含Puromycin的選擇性 培養基，同時設置正常細胞對照組，對照組細胞全部死亡，實驗組存活下來的細胞即是感染 外源基因的細胞；7-10天即可獲得穩定轉染的細胞，將其繼續擴大培養，取部分細胞進行 Western blotting 檢測。
[0012] 作為本發明進一步的方案：所述克隆綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的應 用，即ActRIIB及突變體對綿羊原代成肌細胞生長的作用，將上述篩選的穩定表達ActRIIB 全長及突變體的細胞系，分別以2 X 103個細胞/每孔接種至96孔板中，每種細胞設4個重 復，同時設置空白對照組，利用Cell Counting Kit-8法測定細胞生長曲線；每隔24h向實 驗組及對照組孔各加入1〇μ1的CCK- 8試劑，37°C培養箱內孵育4h，酶標儀測定450 nm波 長處的吸光度，連續測定7天，計各細胞系4孔重復的平均值，以細胞培養天數為橫坐標、 〇D45(l值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
[0013] 本發明的有益效果是：本發明獲得了綿羊ActRIIB基因序列，為綿羊ActRIIB基因 的序列釋放提供相關數據；獲得綿羊ActRIIB基因融合至IgG分子穩定結構域即Fc結構域 的可溶性ActRIIB突變體，其包括氨基端截短的ActRIIB突變體和單堿基突變的突變體。 目前關于綿羊激活素受體IIB基因及突變體研究還未見任何報道，而本發明在細胞水平發 現ActRIIB及突變體對綿羊原代成肌細胞的增殖作用，為進一步探索ActRIIB突變體在家 畜肌肉細胞生長分化過程中的作用以及ActRIIB突變體阻斷MSTN信號通路的分子機制研 究奠定基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1是綿羊ActRIIB基因 PCR擴增； 圖2是pLex-ActRIIB重組質粒酶切檢測； 圖3是pLex-dnActRIIB-Fc重組質粒酶切檢測； 圖 4 是 pLEX-ActRIIB、pLEX-dnActRIIB-Fc 突變體的 western blot 檢測； 圖5是細胞生長曲線測定。

【具體實施方式】
[0015] 下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發明保護的范圍。
[0016] 本發明的實施例中所用到的材料包括：慢病毒載體PLEX-MCS由美國克羅拉多大 學李川源教授實驗室贈送；細胞：293T、綿羊成肌細胞由本實驗室分離保存；動物材料：綿 羊肝臟采自烏魯木齊市華凌家畜屠宰市場。Trizol、大腸桿菌感受態菌株DH5 α、鼠抗ΗΑ單 抗、小量質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自北京天根公司；IRDye? 800CW標記的羊抗 鼠 IgG抗體購自美國LI-COR Biosciences公司；高保真DNA聚合酶、Tag DNA聚合酶、反轉 錄酶、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、IPTG等試劑均購自大連TaKaRa公司；中量質粒提取 試劑盒購自 QIAGEN公司；QuickChange site-Directed Mutagenesis kit 購自 Stratagene 公司；LipofectamineTM 2000 購自 Invitrogen 公司；高糖 DMEM、Opti-MEM 購自 GIBCO 公 司；胎牛血清購自HYCL0NE公司；CCK-8試劑購自Dojindo公司；其他試劑均為國產分析純 產品。所述基因的克隆及其慢病表達毒載體的構建，選用的試劑盒、試劑均為市售產品。
[0017] 本發明實施例中，一種獲取綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的方法，包括以 下步驟：克隆ActRIIB基因編碼區全長cDNA序列；ActRIIB基因的定點突變及慢病毒載體 的構建；穩定表達ActRIIB及突變體細胞系的篩選。所述克隆ActRIIB基因編碼區全長 cDNA序列，首先是采集綿羊肝臟組織，用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA并反轉錄，參考 NCBI 數據庫中公布牛的 ActRIIB 序列（GenBank Accession No. U57707)，設計綿羊 Ovine ActRIIB克隆引物，通過RT-PCR方法擴增綿羊ActRIIB全長編碼區序列，將符合預期大小片 段克隆至pMD 18T，測序，陽性質粒命名為pMD 18T-ActRIIB。所述的ActRIIB及其定點突 變型慢病毒載體的構建，以pMD 18T-ActRIIB質粒為模板，以引物P3 :5，-ATAGGATCCGCACCG CGGAACATGACGGCGCCCTG-3'（BamH I)，P4 :5'-GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGG TAGATGCTCGACTC-3'（Notl)，將ActRIIB亞克隆至慢病毒表達載體pLEX-MCS中，獲得慢病毒 表達載體pLEX-ActRIIB，可表達全長形式的綿羊ActRIIB。
[0018] 以引物 P5 :5，-GCCGGATCCATGGCCCTCGCCCTCCTCTG-3'（BamHI)，P6 :5，-CCCCTCGAG TTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTACACCTGGGGGTT CTCCTCG-3'（Xhol)，亞克隆入慢病毒 載體pLEX-MCS，獲得慢病毒表達載體pLEX-dnActRIIB，可表達截短的ActRIIB，即第7-100 位氨基酸序列。
[0019] 將上下游分別是Agel和Xhol酶切位點的IgG-Fc基因片段，與經Agel和Xhol雙 酶切的pLEX-dnActRIIB大片段進行連接，獲得重組質粒pLEX-dnActRIIB-IgG Fc，可表達 帶 IgG-Fc 標簽的截短型 7-lOOaa ActRIIB 序列 dnActRIIB-IgG Fc。
[0020] 利用Stratagene定點突變試劑盒將dnActRIIB-IgG Fc序列的第79位氨基酸賴 氨酸L分別定點突變為脯氨酸P和谷氨酸E，經測序鑒定后分別構建pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E慢病毒重組表達質粒。所述穩定表達ActRIIB基 因及突變體細胞系的篩選，是將上述構建的ActRIIB及突變體的慢病毒重組表達質粒轉染 293T細胞，進行慢病毒的包裝，并感染綿羊原代成肌細胞，獲得穩定表達綿羊ActRIIB全 長及突變體的成肌細胞系：a、293T細胞培養：條件37°C，5%的C0 2，完全培養基（DMEM+10% 的胎牛血清)，六孔板每孔鋪6-7 X 105個細胞，20小時后細胞匯合度達到80-90% ;b、 Lipofectamine 2000脂質體轉染：加入25〇μ?預熱的Opti-MEM培養基后，按下列比例分 別加入轉染載體 pLEX-ActRIIB、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E 2ug、包裝質粒 psPAX2 1.5ug、包膜質粒 pMD2G 0.5ug、輕輕 混勻；另取25〇μ? Opti-MEM培養基，向其中加入8PL脂質體，室溫放置5min后，將上述 稀釋好的DNA與脂質體混合，置于室溫孵育20min ;在此期間，用Opti-MEM培養基清洗待 轉染細胞一次，將脂質體和DNA復合物加入細胞；將細胞培養板放回37°C培養箱中孵育； 2-4小時后，移去脂質體和DNA復合物，在每孔加入2ml新鮮的培養液，重新將細胞培養板 放回37°C培養箱中培養；c、病毒包裝：培養48h后收集含慢病毒的上清液，用0. 45Mm過濾 器過濾，收集濾過液，此時病毒能夠直接用來感染或_70°C凍存。收集細胞，提取蛋白進行 Western blotting檢測ActRIIB全長和ActRIIB突變體的表達。d、病毒感染：6孔板中每孔 鋪4.5-5 X105個綿羊原代成肌細胞；24h待匯合度達到70%左右時，棄去培養液，加入500ul 收集病毒、500ul完全培養基、同時加入luL polybrene，終濃度達到10ug/mL，將細胞置于 5% C02、37°C培養箱中培養；e、穩定細胞系篩選：病毒感染24h后棄去病毒，將6孔板中的細 胞，0. 05%胰酶消化轉入10cm培養皿中，待細胞完全貼壁后，加入0. 25 μ g/mL Puromycin進 行篩選。為了獲得穩定整合外源基因的表達細胞系，每隔2-3天更換含Puromycin的選擇 性培養基，同時設置正常細胞對照組，對照組細胞全部死亡，實驗組存活下來的細胞即是感 染外源基因的細胞。通常7-10天即可獲得穩定轉染的細胞，將其繼續擴大培養，取部分細 胞進行Western blotting檢測。本發明所述的綿羊ActRIIB基因的三種突變體，突變形式 為氨基端截短和單堿基突變。
[0021] 本發明實施例中，所述克隆綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的應用，即穩定 表達ActRIIB基因及突變體的細胞系對綿羊原代成肌細胞生長的作用，是將上述篩選的穩 定表達ActRIIB全長及突變體蛋白的細胞，分別以2 X 103個細胞/每孔接種至96孔板中， 每種細胞設4個復孔，同時設置空白對照組，利用Cell Counting Kit-8法測定細胞生長曲 線。每隔24h向實驗組及對照組細胞每孔各加入1〇μ?的CCK- 8試劑，37°C培養箱內孵育 4h，酶標儀測定450 nm波長處的吸光度，連續測定7天。求4孔的平均值，以細胞培養天數 為橫坐標、〇D45(l值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
[0022] 本發明獲得了綿羊ActRIIB基因序列，為綿羊ActRIIB基因的應用奠定基礎；還包 括獲得綿羊ActRIIB基因融合至IgG分子穩定結構域即Fc結構域的可溶性ActRIIB突變 體，其包括氨基端截短的ActRIIB突變體和單堿基突變的突變體。目前還未見任何關于綿 羊激活素受體IIB基因及突變體研究報道，而本發明在細胞水平發現ActRIIB及突變體對 綿羊原代成肌細胞的增殖作用，為進一步探索ActRIIB突變體在家畜肌肉細胞生長分化過 程中的作用以及ActRIIB突變體阻斷MSTN信號通路的分子機制研究奠定基礎。
[0023] 實施例1克隆ActRIIB基因編碼區全長cDNA序列 (1)實驗樣品采集與總RNA提取 采集綿羊肝臟組織，裝入凍存管中并迅速置于液氮中保存帶回。取約l〇〇mg組織樣在 液氮中研碎后移至1.5 mL離心管中，加入1 mL Trziol試劑，室溫靜置5 min,按照Trizol 試劑盒使用說明進行總RNA的提取。
[0024] (2) RT-PCR 按照大連寶生物公司的反轉錄試劑盒說明書，對綿羊肝臟組織RNA進行反轉錄，反轉 錄體系參照說明書進行。
[0025] (3)引物設計 參考NCBI數據庫中公布的牛的ActRIIB序列（GenBank Accession No. U57707), 利用 01ig〇6. 0 軟件設計綿羊 Ovine ActRIIB 克隆引物，P1 :5' -GGCACCGCGGAACATGACG GCGCCCTGGGCGGCCC-3'，P2 :5' -GTGTCCTGGGCTTAGATGCTCGACTC-3'，如序列表中序列表 5 所 示，通過RT-PCR方法擴增綿羊ActRIIB全長序列。
[0026] (4) PCR 擴增 ?〇?擴增體系：5父811打61'1(^1^(1階132.5111111、44 1^?1、？2均141^、10|^〇1/1，高保 真DNA聚合酶0. 5 μ L，cDNA 2 μ L補水至50 μ L ;PCR擴增程序：95°C預變性10min ;95°C變 性30 s，60°C退火45s，72°C延伸90 s，35個循環；最后72°C延伸10 min。PCR產物用1% 的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳結果見圖1。
[0027] (5)克隆和測序 將綿羊ActRIIB基因的擴增產物進行回收純化后，利用T4 DNA連接酶將其與pMD-18T 載體連接，轉化E.coli DH5ci ;利用氨芐青霉素平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法 鑒定，陽性克隆測序由上海生物工程有限公司完成；測序鑒定后的陽性質粒命名為PMD 18T-ActRIIB，測序結果見序列表中序列表1，同時將此序列提交至GeneBank，登陸號為： JX422071. 1。
[0028] 實施例2 ActRIIB基因的定點突變及慢病毒載體的構建 請參閱圖2與圖3,根據實施例1獲得的綿羊ActRIIB全長序列，設計引物Pl，P2, 將目的基因克隆至慢病毒表達載體中，獲得綿羊ActRIIB基因慢病毒載體；同時以PMD 18T-ActRIIB質粒為模板，設計引物P3, P4,構建截短的7-100aa ActRIIB序列并插入慢 病毒載體PLEX-MCS，命名pLEX-dnActRIIB ;將實驗室現有的IgG-Fc基因片段經Agel和 Xhol雙酶切，膠回收目的基因片段，與同樣Agel和Xhol雙酶切的pLEX-dnActRIIB進 行連接，獲得重組質粒pLEX-dnActRIIB-IgG Fc，通過雙酶切及測序鑒定重組質粒；利用 Stratagene公司突變試劑盒將dnActRIIB-IgG Fc序列的第79位氨基酸賴氨酸L分別 定點突變為脯氨酸P和谷氨酸E，經測序鑒定后分別構建pLEX-dnActRIIB-IgG FC-L79P、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E慢病毒重組表達質粒。具體步驟如下： (1)弓丨物設計： 根據測序結果設計克隆ActRIIB至慢病毒表達載體的引物，上游引物P3 :5'-ATAGGATC ￡GCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTG-3，BamH I，下游引物 P4 :5，-GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTG GGACGTCGTATGGGTAGATGCTCGACTC-3' Not I :同時設計 h.游引物P5 :5'_GCCGGATCCATGGCCCT CGCCCTCCTCTG -3' BamH I，下游引物 P6 :5 ' -CCCCTCGAGTTMGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGT AG TACACCTGGGGGTTCTCCTCG-3' Xho I，黑色正體為 HA-Tag，構建截短的 7-100aa ActRIIB 序列并插入慢病毒載體pLEX-MCS，如序列表6所示。
[0029] (2)構建慢病毒表達載體： ①慢病毒表達載體pLEX-ActRIIB的構建： 以pMD 18T-ActRIIB為模板，分別利用特異性上下游引物P1、P2進行PCR反應，其反應 體系為：1KL pMD 18T-ActRIIB 質粒，2·5μ? 10XPCR buffer，2PL dNTP 均 2.5mM，上下游 引物 10 mM 均 ?μ?，?μ? DMS0，lUTaq 酶，用 ddH20 調整至 25μ?。PCR 反應條件為：95°C 5min， 95°C 30 s，61°C 45 s，72°C 90 s，35 個循環，72°C 10 min;取 PCR 擴增產物 5μ? 經 1% 瓊 脂糖凝膠電泳檢測。BamH I和Not I雙酶切、膠回收目的片段，與同樣BamH I和Not I雙 酶切的pLEX-MCS載體進行連接，連接產物轉化E. coli DH5a ;利用氨芐青霉素進行平板篩 選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定。經過測序驗證后，獲得重組質粒pLEX-ActRIIB。
[0030] ②慢病毒表達載體pLEX-dnActRIIB-Fc的構建： a、以pMD 18T-ActRIIB質粒為模板，利用特異性上游引物P5、下游引物P6進行PCR反 應，其反應體系為：1PL pMD-18T-ActRIIB 質粒，2·5μ? 10XPCR buffer，2PL dNTP(2.5mM each)，上下游引物10 mM均?μ?，?μ? DMS0，1U Taq酶，用ddH20調整至25μ?。PCR反應條 件為：95°C 5min，95°C 30 s，61°C 30 s，72°C 30 s, 35 個循環，72°C 10 min;取 PCR 擴 增產物5PL經瓊脂糖凝膠電泳檢測。BamH I和Xho I雙酶切、膠回收目的基因片段，與同 樣BamH I和Xho I雙酶切的pLEX-MCS載體進行連接，連接產物轉化E. coli DH5a ;利用 氨芐青霉素進行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定，測序鑒定，獲得重組質粒 pLEX-dnActRIIB。
[0031] b、將上下游分別是Agel和Xhol酶切位點的IgG-Fc基因片段，與經Agel和Xhol 雙酶切的PLEX-dnActRIIB大片段進行連接，連接產物轉化E. coli DH5a ;利用氨芐青 霉素進行平板篩選，并以PCR法和限制性酶切法鑒定。經過測序驗證后，獲得重組質粒 pLEX-dnActRIIB-IgG-Fc，測序結果見序列表中序列表2。
[0032] (3) ActRIIB基因定點突變 ①引物設計 利用 //www. genomics, agilent. com/primerDesignProgram. jsp 在線設計弓|物， 將ActRIIB基因序列的第79位氨基酸賴氨酸（L)分別定點突變為脯氨酸（P)和谷氨酸（E)。 L79P的上下游引物分別為：上游引物P7 :5'-GAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT-3';下游引 物 P8 :5' -AGTTGAAGTCGTCCGGCCAGCAGCCCTTC-3' ；L79E 的上下游引物分別為：上游引物 P9 : 5' -CAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACGACTTCAACTGC-3'；下游引物 P10 :5' -GCAGTTGAAGTCGTCCTCCC AGCAGCCCTTCTTG-3'，如序列表中序列表7所示。
[0033] ②PCR擴增 利用Stratagene定點突變試劑盒進行PCR擴增，體系為：10 XBuffer 5 μ L, dNTP (2.5禮63(*)、4以1^上下游引物均1.25 41^邛1^乂-(11^(^1?1184(3質粒1以1^邛包譏釷3冊 DNA聚合酶1.0 yL，補水至50 yL;PCR反應程序：95°C預變性30 s;95°C變性30 s，55°C 退火60s，68°C延伸12min，16個循環；最后4°C 5 min。
[0034] ③消化 取1. 0 μ L Dpnl內切酶加入上述50 μ L PCR擴增產物中混勻，37°C水浴3h。
[0035] ④轉化 a、取50yL XL Ι-Blue感受態細胞置于冰上，加入5yL步驟3中消化的PCR產物混勻， 冰浴30min。
[0036] b、42°C水浴45s后冰浴2min，加入500 μ L S0C培養基混勻后置于37°C搖床震蕩 培養lh，轉速：200rpm。
[0037] c、利用氨芐青霉素進行平板篩選，挑取單菌落至S0C培養基振蕩培養12_16h 后測序鑒定，獲得的陽性慢病毒重組表達質粒命名為：pLEX-dnActRIIB-IgG FC-L79P、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E，測序結果見序列表中序列表3與序列表4。
[0038] 實施例3穩定表達ActRIIB基因及突變體蛋白細胞系的篩選 請參閱圖4,將上述構建的ActRIIB及突變體的慢病毒重組表達質粒轉染293T細胞，進 行慢病毒的包裝，并感染原代分離培養的綿羊成肌細胞，獲得穩定表達綿羊ActRIIB和三 種ActRIIB突變體的成肌細胞系 ： 在293T細胞中包裝重組慢病毒步驟： (1) 第1日：293T細胞培養條件： 37°C，5%的C02，培養基采用DMEM+10%的胎牛血清，六孔板每孔鋪6-7 X 105個293Τ細 胞，保證第2天細胞在完全培養液中匯合度達到80-90% ; (2) 第 2 日：Lipofectamine 2000 脂質體轉染： 首先，在24孔板里準備脂質體和DNA復合物。
[0039] 加入25〇μ?預熱的Opti-MEM培養基后，按下列比例分別加入目的載 體 pLEX-ActRIIB、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、 pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E 及病毒包裝載體。
[0040] 轉染載體 2 ug 包裝質粒PSPAX2 1. 5ug 包膜質粒PMD2G 0. 5ug 在使用Lipofectamine 2000之前先輕輕混勻脂質體，然后在24孔板中加入25〇μ?預 熱的Opti-MEM培養基，再加入8ul Lipofectamine 2000,輕輕混勻后室溫放置5min后，將 上述稀釋好的DNA與脂質體混合，混合物置于室溫孵育20min ;在此期間，用Opti-MEM培 養基清洗六孔板中待轉染細胞一次，將脂質體和DNA復合物加入細胞，將細胞培養板放回 37°C培養箱中孵育，2-4小時后，移去脂質體和DNA復合物，在六孔板每孔中加入2ml新鮮的 培養液，重新將細胞培養板放回37°C培養箱中培養。
[0041] (3)第4日：收集病毒 培養48h后收集含慢病毒的細胞培養上清液。將細胞上清用0. 45Mm過濾器過濾，收 集濾過液，此時病毒能夠直接用來感染或_70°C凍存。收集細胞，提取蛋白進行Western blotting檢測ActRIIB基因全長和ActRIIB各突變體的表達，分別檢測到53KDa、38KDa、 38KDa、38KDa的蛋白條帶，與預期大小一致。
[0042] (4)病毒感染：在6孔板中鋪4. 5-5X 105個綿羊原代成肌細胞；次日待匯合度 達到70%左右時，棄去培養液，加入500ul收集病毒、500ul完全培養基，同時加入lul polybrene，終濃度達到10ug/ml，將細胞置于5% C02、37°C培養箱培養。
[0043] (5)穩定細胞系篩選：病毒感染24h后棄去，0. 05%胰酶消化轉入10cm培養皿中， 待細胞完全貼壁后，加入〇.25yg/mL Puromycin進行篩選。為了獲得穩定整合外源基因的 表達細胞系，每隔2-3天更換含Puromycin的選擇性培養基，同時設置正常細胞對照組，正 常細胞對照組全部死亡，實驗組存活下來的細胞即是感染外源基因的細胞，通常7-10天即 可獲得穩定轉染的細胞。
[0044] 實施例4穩定表達ActRIIB基因及突變體的細胞系在綿羊原代成肌細胞生長中 的作用 請參閱圖5,為了比較ActRIIB基因及突變體細胞系的生長狀況、ActRIIB基因及突變 體在綿羊原代成肌細胞生長中的作用，將獲得的穩定感染目的基因的細胞系進行生長曲線 的繪制，實驗共分4組，測7天。使用CCK-8法測定細胞增殖，具體步驟如下： (1)將獲得的穩定感染目的基因的細胞系在匯合度達到90%左右進行消化并計數，分 別以每孔2000個細胞接種于96孔培養板中，每組設置4個重復，置于5% C02、37°C培養箱 中培養。同時，設置只含培養基不含細胞的對照孔，得到背景發光值，測定7次，即第0天至 第6天，需鋪7個相同的96孔板。
[0045] (2)當細胞完全貼壁后，向每孔細胞加入10 μ 1 CCK-8試劑，置于培養箱孵育 3. 5-4h后，使用酶標儀測定450nm波長處的吸光。
[0046] (3)每隔24h測定一次，每隔2天更換一次培養液，連續測定7天，最后把7天 的數值繪制成圖，制作出一條以細胞培養天數為橫坐標，〇D 45(l值為縱坐標的細胞生長曲 線。結果表明，穩定表達三種突變體的成肌細胞均比穩定表達ActRIIB全長的細胞生長 速度快。用SPSS13. 0軟件進行差異顯著性分析，表明鋪板第0天四種細胞生長差異均不 顯著；穩定表達 pLEX-dnActRIIB-Fc-L79Pl 的細胞與穩定表達 pLEX-dnActRIIB-Fc-L79E3 細胞相比，第1-6天差異均不顯著，P > 0. 05 ;穩定表達pLEX-dnActRIIB-Fc-L79Pl、 pLEX-dnActRIIB-Fc-L79E3 細胞比穩定表達 pLEX-dnActRIIB-Fc、pLEX-ActRIIB 細胞生長 速度均顯著加快，第1天差異均顯著，P < 〇. 05,第2-6天均差異極顯著，P < 0. 01。
[0047] 對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在 不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論 從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有 變化囊括在本發明內。
[〇〇48] 此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包 含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當 將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員 可以理解的其他實施方式。 序列表1 : PMD 18T-ActRIIB基因的測序結果 ATGACGGCGCCCTGGGCGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGCGCCGGTTCCGGGCGCGGGGAGGCCG AGACGCGG 81 1 MTAPWAALALLWGSLCAGSGRGE A E T R GAGTGCATCTACTACAACGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGACCTGGAGCGCTGTGAGGGCG AGCGGGAC 162 28 ECIYYNANWELERTNQSDLERCE G E R D AAGCGGCTGCACTGCTACGCCTCCTGGCGCAACAGCTCGGGCACCATCGAGCTCGTCAAGAAGGGCTGCTGGC TGGACGAC 243 55 KRLHCYASWRNSSGTIELVKKGC ff L D D TTCAACTGCTACGACAGGCAGGAGTGCGTGGCCACCGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTTCTGCTGCTGCGAAG GCAACTTC 324 82 FNCYDRQECVATEENPQVYFCCC E G N F TGCAACGAGCGCTTCACCCACCTTCCCGAGGCGGGCGGCCCAGAAGTCACGTACGAGCCACCCCCGACAGCCC CCACCCTG 405 109CNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTA P T L CTCACTGTGCTGGCCTACTCGCTGCTGCCCGTCGGGGGCCTCTCCCTCATTGCCCTGCTGGCCTTCTGGA TGTACCGACAT 486 136LTVLAYSLLPVGGLSLIALLAFWM Y R H CGCAAGCCCCCCTACGGCCACGTGGACATCCACGAGGACCCTGGACCTCCACCCCCGTCCCCTCTGGTGGGCC TGAAGCCT 567 163RKPPYGHVDIHEDPGPPPPSPLVG L K P CTGCAGCTGCTGGAGATCAAGGCTCGGGGGCGCTTCGGTTGTGTCTGGAAGGCGCAGCTCATGAACGACTTCG TGGCTGTC 648 190LQLLEIKARGRFGCVWKAQLMNDF V A V AAGATCTTCCCACTCCAGGACAAGCAGTCGTGGCAGAGTGAGCGGGAGATCTTCAGCACGCCTGGCATGAAGC ACGAGAAC 729 217KIFPLQDKQSWQSEREIFSTPGMK HEN CTGCTGCAGTTCATTGCCGCTGAGAAGCGAGGCTCCAGCCTGGAGGCGGAGCTGTGGCTCATCACAGCCTTCC ACGACAAG 810 244 LLQFIAAEKRGSSLEAELWLITAF H D K GGCTCCCTCACGGATTACCTCAAGGGGAACATCATCACATGGAACGAGCTGTGTCACGTGGCGGAGACCATGT CTAGAGGC 891 271GSLTDYLKGNI ITWNELCHVAETM S R G CTCTCATACCTACACGAGGATGTGCCCTGGTGCCGGGGCGAGGGCCACAAGCCGTCTATTGCCCACAGGGACT TCAAGAGC 972 298 LSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRD F K S AAGAATGTATTGCTGAAGAGTGACCTCACTGCTGTGCTGGCTGACTTTGGCCTGGCTGTTCGGTTTGAGCCAG GGAAACCT 1053 325 KNVLLKSDLTAVLADFGLAVRFEP G K P CCGGGGGACACTCACGGGCAGGTGGGCACGCGGCGGTACATGGCCCCCGAGGTGCTCGAGGGAGCCATCAACT TCCAGAGA 1134 352 PGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAIN F Q R GACGCCTTTCTGCGCATCGACATGTACGCCATGGGGCTGGTGCTCTGGGAGCTCGTGTCCCGCTGCAAAGCTG CCGACGGA 1215 379 DAFLRIDMYAMGLVLWELVSRCKA A D G CCTGTGGATGAGTACATGCTGCCTTTTGAGGAGGAGATCGGCCAGCACCCGTCACTGGAGGAGCTGCAGGAGG TTGTGGTG 1296 406 PVDEYMLPFEEEIGQHPSLEELQE V V V CATAAGAAGATGCGGCCGGCCATCAAGGATCACTGGCTGAAACACCCGGGCCTGGCCCAGCTCTGCGTGACAA TCGAGGAG 1377 433 HKKMRPAIKDHWLKHPGLAQLCVT I E E TGCTGGGACCACGACGCGGAGGCTCGCCTGTCCGCGGGCTGCGTGGAGGAGCGAGTGTCCCTGATTCGGAGGT CGGTCAAC 1458 460 CWDHDAEARLSAGCVEERVSLIRR S V N GGCACTACCTCGGACTGTCTCGTCTCCCTGGTGACCTCCGTCACCAACGTGGACCTGCCCCCGAAGGAGTCGA GCATCTAA 1539 487 GTTSDCLVSLVTSVTNVDLPPKES S I - 序列表2 :pLEX-dnActRIIB_IgG Fc基因的測序結果 ATGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGCGCCGGTTCCGGGCGCGGGGAGGCCGAGACGCGGGAGTGCA TCTACTAC 81 1 MALALLWGSLCAGSGRGEAETRE C I Y Y AACGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGACCTGGAGCGCTGTGAGGGCGAGCGGGACAAGCGGC TGCACTGC 162 28 NANWELERTNQSDLERCEGERDK R L H C TACGCCTCCTGGCGCAACAGCTCGGGCACCATCGAGCTCGTCAAGAAGGGCTGCTGGCTGGACGACTTCAACT GCTACGAC 243 55 YASWRNSSGTIELVKKGCWLDDF N C Y D AGGCAGGAGTGCGTGGCCACCGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTCTCG AGCCCAGA 324 82 RQECVATEENPQVYYPYDVPDYA L E P R GGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTT CATCTTCCCT 405 109GPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVF I F P CCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGG ATGACCCA 486 136PKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSE D D P GATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATT ACAACAGT 567 163DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHRED V N S ACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGG TCAACAAC 648 190TLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCK V N N AAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATG TCTTGCCT 729 217KDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVY V L P CCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACA TTTACGTG 810 244 PPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPED I Y V GAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTT ACTTCATG 891 271EWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGS Y F M TACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGG GTCTGCAC 972 298 YSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHE G L H AATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATAA 1017 325 NHHTTKSFSRTPGK- 序列表3 :PLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P基因的測序結果 ATGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGCGCCGGTTCCGGGCGCGGGGAGGCCGAGACGCGGGAGTGCA TCTACTAC 81 1 MALALLWGSLCAGSGRGEAETRE C I Y Y AACGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGACCTGGAGCGCTGTGAGGGCGAGCGGGACAAGCGGC TGCACTGC 162 28 NANWELERTNQSDLERCEGERDK R L H C TACGCCTCCTGGCGCAACAGCTCGGGCACCATCGAGCTCGTCAAGAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT GCTACGAC 243 55 YASWRNSSGTIELVKKGCWPDDF N C Y D AGGCAGGAGTGCGTGGCCACCGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTCTCG AGCCCAGA 324 82 RQECVATEENPQVYYPYDVPDYA L E P R GGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTT CATCTTCCCT 405 109GPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVF I F P CCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGG ATGACCCA 486 136PKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSE D D P GATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATT ACAACAGT 567 163DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHRED Y N S ACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGG TCAACAAC 648 190TLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCK V N N AAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATG TCTTGCCT 729 217KDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVY V L P CCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACA TTTACGTG 810 244 PPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPED I Y V GAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTT ACTTCATG 891 271EWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGS Y F M TACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGG GTCTGCAC 972 298 YSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHE G L H AATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATAA 1017 325 NHHTTKSFSRTPGK- 序列表4 :PLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E基因的測序結果 ATGGCCCTCGCCCTCCTCTGGGGATCGCTGTGCGCCGGTTCCGGGCGCGGGGAGGCCGAGACGCGGGAGTGCA TCTACTAC 81 1 MALALLWGSLCAGSGRGEAETRE C I Y Y AACGCCAACTGGGAGCTGGAGCGCACCAACCAGAGCGACCTGGAGCGCTGTGAGGGCGAGCGGGACAAGCGGC TGCACTGC 162 28 NANWELERTNQSDLERCEGERDK R L H C TACGCCTCCTGGCGCAACAGCTCGGGCACCATCGAGCTCGTCAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACGACTTCAACT GCTACGAC 243 55 YASWRNSSGTIELVKKGCWEDDF N C Y D AGGCAGGAGTGCGTGGCCACCGAGGAGAACCCCCAGGTGTACTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTCTCG AGCCCAGA 324 82 RQECVATEENPQVYYPYDVPDYA L E P R GGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTT CATCTTCCCT 405 109GPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVF I F P CCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGG ATGACCCA 486 136PKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSE D D P GATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATT ACAACAGT 567 163DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHRED Y N S ACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGG TCAACAAC 648 190TLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCK V N N AAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATG TCTTGCCT 729 217KDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVY V L P CCACCAGAAGAAGAGATGACTAATAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACA TTTACGTG 810 244 PPEEEMTNKQVTLTCMVTDFMPED I Y V GAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTT ACTTCATG 891 271EWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGS Y F M TACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGG GTCTGCAC 972 298 YSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHE G L Η AATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATAA 1017 325 NHHTTKSFSRTPGK- 序列表 5:參考牛的 ActRIIB 序列（GenBank Accession No. U57707)利用 01igo6.0 軟件設計綿羊Ovine ActRIIB克隆引物 克隆引物 PI :5' -GGCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTGGGCGGCCC-3' 克隆引物 P2 :5' -GTGTCCTGGGCTTAGATGCTCGACTC-3' 序列表6:克隆ActRIIB、截短的ActRIIB至慢病毒表達載體的引物 P3 :5'-ATAGGATCCGCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTG-3' （BamH I) P4 :5'-GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGATGCTCGACTC-3'（Not I ) P5:5'-GCCGGATCCATGGCCCTCGCCCTCCTCTG (BamH 1)-3' P6 :5'-CCCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTACACCTGGGGGTTCTCCTCG-3' (Xhol) 序列表7: ActRIIB基因序列的第79位氨基酸賴氨酸（L)分別定點突變為脯氨酸（P) 和谷氨酸（E)的引物設計 L79P 定點突變的正向引物 P7 :5' -GAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT-3' L79P 定點突變的下游引物 P8 :5' -AGTTGAAGTCGTCCGGCCAGCAGCCCTTC-3' L79E 定點突變的正向引物 P9 :5' -CAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACGACTTCAACTGC-3' L79E 定點突變的下游引物 P10 :5' -GCAGTTGAAGTCGTCCTCCCAGCAGCCCTTCTTG-3'
【權利要求】
1. 一種獲取綿羊激活素 II型受體(ActRIIB)基因及其突變體的方法，其特征在于， 包括克隆ActRIIB基因編碼區全長cDNA序列；ActRIIB基因的定點突變及慢病毒載體的 構建；穩定表達ActRIIB基因及突變體細胞系的篩選；所述克隆ActRIIB基因編碼區全長 cDNA序列，采集綿羊肝臟組織，用Trizol試劑提取肝臟組織總RNA并反轉錄，設計克隆引 物，P1 :5, -GGCACCGCGGAACATGACGGCGCCCTGGGCGGCCC-3，，P2 :5, -GTGTCCTGGGCTTAGATGCTC GACTC-3'，通過RT-PCR方法擴增綿羊ActRIIB全長編碼區序列，將符合預期大小片段克隆 至pMD 18T載體，測序，陽性質粒命名為pMD 18T-ActRIIB ;所述的ActRIIB及其定點突變 型慢病毒載體的構建，以pMD 18T-ActRIIB質粒為模板，以引物P3 :5' -ATAGGATCCGCACCGC GGAACATGACGGCGCCCTG-3' （BamH I)， P4 :5' -GGCGCGGCCGCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGG GTAGATGCTCGACTC-3'（Notl)，將ActRIIB亞克隆至慢病毒表達載體pLEX-MCS中，獲得慢病 毒表達載體pLEX-ActRIIB，可表達全長形式的綿羊ActRIIB ;以引物P5 :5' -GCCGGATCCATG GCCCTCGCCCTCCTCTG-3'（BamHI)，P6 :5' -CCCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTA CACCTGGGGGTT CTCCTCG-3'（Xhol)，亞克隆入慢病毒載體pLEX-MCS，獲得慢病毒表達載體 pLEX-dnActRIIB，可表達截短的ActRIIB，即第7-100位氨基酸序列；將上下游分別是Agel 和Xhol酶切位點的IgG-Fc基因片段，與經Agel和Xhol雙酶切的pLEX-dnActRIIB大片段 進行連接，獲得重組質粒pLEX-dnActRIIB-IgG Fc，可表達帶IgG-Fc標簽的截短型7-100aa ActRIIB 序列 dnActRIIB-IgG Fc ;利用 Stratagene 定點突變試劑盒將 dnActRIIB-IgG Fc 序列的第79位氨基酸賴氨酸（L)分別定點突變為脯氨酸（P)和谷氨酸（E)，L79P定點突變 正向引物是 P7 :5 ' -GAAGGGCTGCTGGCCGGACGACTTCAACT-3 '，反向引物是 P8 : 5 ' -AGTTGAAGT CGTCCGGCCAGCAGCCCTTC-3 '，L79E 定點突變正向引物是 P9 : 5 ' -CAAGAAGGGCTGCTGGGAGGACG ACTTCAACTGC-3 '，反向引物是 P10: 5' -GCAGTTGAAGTCGTCCTCCCAGCAGCCCTTCTTG-3 ' ；分別 構建獲得PLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E慢病毒重組表達質 粒；所述穩定表達ActRIIB及突變體細胞系的篩選，是將構建的重組表達ActRIIB及突變體 的慢病毒質粒轉染293T細胞，進行慢病毒的包裝，并感染分離培養的綿羊原代成肌細胞， 獲得穩定表達綿羊ActRIIB全長及突變體的成肌細胞系。
2. 根據權利要求1所述的獲取克隆綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的方法，其特 征在于，所述的綿羊ActRIIB基因的三種突變體，突變形式為氨基端截短和單堿基突變。
3. 根據權利要求1所述的獲取克隆綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的方法，其特 征在于，所述穩定表達ActRIIB基因及突變體細胞系的篩選，具體步驟是： a、 293T細胞培養：條件37°C，5%的C02，完全培養液（DMEM+10%的胎牛血清)，六孔板每 孔鋪6-7 X 105個細胞，20小時后細胞匯合度達到80-90% ; b、 Lipofectamine 2000脂質體轉染：加入25〇μ?預熱的Opti-MEM培養基后，按下 列比例分別加入轉染質粒 pLEX-ActRIIB、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79P、pLEX-dnActRIIB-IgG Fc-L79E 2ug、包膜質粒pMD2G 0.5ug、輕輕混勻，另取25〇μ? Opti-MEM培養基，向其中加入8μ?脂質體，室溫放置5min后，將上述稀釋好的DNA與脂質 體混合，置于室溫孵育20分鐘；在此期間，用Opti-MEM培養基清洗待轉染細胞一次，將脂質 體和DNA復合物加入細胞；將細胞培養板放回37°C培養箱中孵育；2-4小時后，移去脂質體 和DNA復合物，在每孔加入2ml新鮮的完全培養液，重新將細胞培養板放回37°C培養箱中培 養； C、病毒包裝：包裝48h后收集含慢病毒的上清液，用0. 45Mm過濾器過濾，收集濾過液， 此時病毒能夠直接用來感染或_70°C凍存；收集細胞，提取蛋白進行Western blotting檢 測ActRIIB全長和ActRIIB突變體的表達； d、 病毒感染：6孔板中每孔鋪4. 5-5 X 105個綿羊原代成肌細胞；次日待匯合度達到70% 左右時，棄去培養液，加入500ul收集病毒、500ul完全培養基（c步驟濾過液)、同時加入lul polybrene，將細胞置于5% C02、37°C培養箱中培養； e、 穩定細胞系篩選：病毒感染24h后棄去病毒液，0. 05%胰酶消化6孔板中的細胞轉入 10cm培養皿中，待細胞完全貼壁后，加入0. 25 μ g/mL Puromycin進行篩選；每隔2-3天更 換含Puromycin的選擇性培養基，同時設置正常細胞對照組，對照組細胞全部死亡，實驗組 存活下來的細胞即是感染外源基因的細胞；7-10天即可獲得穩定轉染的細胞，將其繼續擴 大培養，取部分細胞進行Western blotting檢測。
4. 一種根據權利要求1-3所述綿羊激活素 II型受體基因及其突變體的應用，即 ActRIIB及突變體對綿羊原代成肌細胞生長的作用，其特征在于，將上述篩選的穩定表達 ActRIIB全長及突變體的細胞系，分別以2 X 103個細胞/每孔接種至96孔板中，每種細胞 設4個重復，同時設置空白對照組，利用Cell Counting Kit-8法測定細胞生長曲線；每隔 24h向實驗組及對照組孔各加入1〇μ1的CCK- 8試劑，37°C培養箱內孵育4h，酶標儀測定 450 nm波長處的吸光度，連續測定7天，計各細胞系4孔重復的平均值，以細胞培養天數為 橫坐標、0D45(I值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
【文檔編號】C12N15/867GK104087594SQ201410338143
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月16日 優先權日:2014年7月16日
【發明者】劉明軍, 張雪梅, 李文蓉, 張寧, 賀三剛, 吳陽升, 安靜 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心