專利名稱：鴨促性腺激素釋放激素受體基因(gnrhr)的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)核苷酸序列及基因編碼的氨基酸序列，屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
我國是世界上養鴨數量、產品消費和出口貿易的第一大國。根據FAO的數據統計2006年，我國鴨存欄量超過7. 25億只，占世界總存欄量的69. 28%左右，養鴨業逐步成為我國經濟結構中的特色產業和農村經濟發展的支柱產業之一。但是，關于鴨分子生物學研究大大落后于鴨育種和生產的發展，這些成果取得仍然依靠傳統的育種和生產技木。促性腺激素釋放激素受體在動物生殖發育調控過程中起著關鍵作用。促性腺激素釋放激素與垂體中的促性腺激素釋放激素受體結合，能促進促黃體素(LH)和促卵泡素(FSH)的合成與釋放，促進性腺的生長、成熟和調節動物的繁殖功能及行為。Ikemoto. T等(2004)報道，GNRH經過和它的特定受體(GNRHR)的交互作用在動物生殖功能活動中扮演ー個關鍵性的角色。Kim等(2003)研究表明，抑制動物GNRH及其受體基因的表達將極大抑制其生殖活動。目前，豬、山羊、雞等動物的促性腺激素釋放激素受體基因序列已陸續被報道，它與初產母豬黃體生成數(Jiang等，2001)、山羊產羔數(儲明星等，2009)和母雞產雙黃蛋數(Dunn等，2004)相關顯著，該基因是提高動物繁殖性能的重要侯選基因。但是鴨促性腺激素釋放激素受體基因還未曾有報道，極大地制約了鴨分子遺傳育種的研究和生物技術在鴨生產中的應用，影響了養鴨業地快速發展。

發明內容
本發明的目的是為了利用基因工程技術加快對鴨繁殖性能的改良，提供鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)核苷酸序列、編碼的氨基酸序列以及獲得該基因序列的引物序列。本發明的目的是通過以下技術方案實現的。鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)，它經由以下兩對弓I物GF4 (SEQID No 14)與 GR4(SEQ ID No :15) ；GF5 (SEQID No :16)與 GR5 (SEQID No :17)克隆測序獲得。鴨促性腺激素釋放激素受體基因，在于核苷酸序列SEQ IDNo :1所示。所述的鴨促性腺激素釋放激素受體基因及基因編碼的氨基酸序列SEQ ID No:2所示。所述方法包括下列步驟(1)根據已知動物GNRHR基因的序列分析該基因結構和保守區域；(2)根據Genebank中雞GNRHR基因的序列(nc_006096. 2)和雞chromosome10(NW_001471429. I)的信息，設計ー對位于GNRHR基因第2外顯子上的引物GFl和GR1，GFl的序列如SEQ ID No :3，GRl的序列如SEQ ID No 4 ； (3)以鴨基因組DNA為模板，利用引物GFl和GRl擴增并克隆測序得到DGl序列121bp，DGl的序列如SEQ ID No 5 ； (4)序列DGl與雞G HR基因進行比對，發現同源性達92%，判定該段序列為GNRHR基因上的序列；(5)根據DGl與雞GNRHR基因序列設計兩對引物GF2、GR2和GF3、GR3，GF2位于GRHR基因的第一外顯子位置，其序列如SEQ ID No :6，GR3位于GNRHR基因的第三外顯子位置，其序列如SEQID No :7，GR2和GF3均位于GNRHR基因的第二外顯子位置，序列分別如SEQ ID No :8和SEQID No 9 ； (6)以GF2、GR2和GF3、GR3兩對引物擴增鴨基因組DNA，分別克隆測序得到DG2和DG3序列，DG2和DG3序列分別如SEQ ID No 10,SEQ ID No 11 ； (7)DG2和DG3序列分別與雞GNRHR基因比對，同源性分別達到89%、88% ; (8)根據DG2序列設計上游引物GF4，其序列如SEQ ID No : 12，根據DG3序列設計一條下游引物GR4，其序列如SEQ ID No:13，用于擴增鴨GNRHR基因大部分全長序列；(9)利用引物GF4和GR4擴增鴨基因組DNA，克隆測序獲得鴨GNRHR基因大部分全長序列DG4，其序列如SEQ ID No 14 ； (10)根據DG3序列設計ー條上游引物GF5，其序列如SEQ ID No :15，根據雞GNRHR基因3’ UTR區設計一條下游引物GR5，其序列如SEQ ID No 16 ；(11)利用引物GF5和GR5擴增鴨基因組DNA，克隆測序獲得ー條鴨 GNRHR 基因 3，UTR 區序列 DG5，其序列如 SEQ ID No 17 ； (12)通過 DNAstar、Bioedit等軟件編輯和拼接，最終獲得GNRHR全長序列。與以往相關技術比較，本發明的完成為進一歩深入分析GNRHR基因的功能和其對鴨繁殖性能的重要調節機制的掲示，為GNRHR基因的應用打下基礎，為篩選和培育高產蛋 鴨品種提供分子技術支持。
具體實施例方式實施例I高郵鴨GNRHR基因的克隆和測序I.基因組DNA的提取本發明中所用的血樣采集自高郵鴨國家資源保種場，利用DNA微量提取試劑盒提取血液中全基因組DNA,具體操作步驟如下I. I將血樣搖勻，取約500至550L血樣到5mL離心管中(折算為5mL離心管中含新鮮禽血約110 μ L，若為2mL離心管則折算后的禽血以40至50 μ L為宜)，6000r/min，離心4min,倒掉上清。I. 2加入約I. 8mL生理鹽水(O. 9% Nacl)輕緩地上下顛倒搖勻，倘若急用，輕柔地搖10 15min ;若不急用，可室溫下放置O. 5h Id,隨后以6000r/min離心3 4min,倒
掉上清。I. 3將260 μ L生理鹽水加入離心管中，搖ー搖，將血細胞充分懸浮起來，然后加入裂解液[IOOmmoI/L Tris · Cl (ρΗ8. O). 200mmol/L EDTA(pH8. O) ,2% SDS] 1800L，接著加入蛋白酶K至終濃度100ng/mL，蓋緊管子后顛倒搖勻，最后于水浴鍋中55°C消化過夜。I. 4加酚氯仿異戊醇(25 24 l)2mL于試管中，搖勻20min，然后12000r/min離心IOmin,取上清,如此抽提兩遍,然后再用與上清等體積的氯仿異戍醇(24 I)抽提一遍，離心后取上清。I. 5用兩倍體積的無水こ醇沉淀DNA，再用70 %こ醇洗兩遍，晾干，加入適量超純水溶解DNA。2.高郵鴨GNRHR基因的擴增和克隆測序2. I高郵鴨GNRHR基因第2外顯子部分序列的的獲得2. I. I引物設計根據Genebank 中雞 GNRHR 基因的序列(NC_006096. 2)和雞 chromosome10 (NW_001471429. I)的信息，設計ー對位于GNRHR基因第2外顯子上的引物GFl和GRl，GFl的序列如SEQ ID No :3，GRl的序列如SEQ ID No :4。2. I. 2序列測定PCR反應體系鴨基因組DNA模板2 μ 1，引物GFl :1μ 1，引物GRl 1μ l,2mM dNTP 2 μ l,25mM MgS04 :0. 8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2 μ 1，共計20ul ;反應程序94°C預變性2. 5min ;94°C變性，56°C退火30s ;68°C延伸30S ;25個循環，68°C延伸5min。擴增PCR產物克隆測序得到DGl序列121bp，DGl的序列如SEQ ID No 52. I. 3序列同源性比對 DGl序列與雞GNRHR基因(GENE ID :427517)比對，同源性達到92%，確認該部分序列為GNRHR基因序列。2. 2鴨GNRHR基因第1、2、3外顯子序列的獲得2. 2. I引物設計根據DGl與雞GNRHR基因序列設計兩對引物GF2、GR2和GF3、GR3，GF2位于GNRHR基因的第一外顯子位置，其序列如SEQ ID No :6，GR3位于GNRHR基因的第三外顯子位置，其序列如SEQ ID No :7，GR2和GF3均位于GNRHR基因的第二外顯子位置，序列分別如SEQ IDNo 8 和 SEQ ID No :9。2. 2. 2序列測定PCR反應體系鴨基因組DNA模板2 μ I ;上游引物GF2/GF3 :1 μ I，下游引物GR2/GR3 1μ I ；2mM dNTP :2μ 1，25mM MgS04 :0.8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2μ 1，共計 20 μ I ;反應程序94°C 預變性 2. 5min ;94°C 變性，56°C 退火 30s ；68°C延伸Imin ；25個循環，68°C延伸5min。GF2、GR2和GF3、GR3兩對引物擴增鴨基因組DNA，分別克隆測序得到DG2和DG3序列，DG2和DG3序列分別如SEQ ID No :10，SEQ ID No :11。2. 2. 3序列同源性比對 DG2和DG3序列分別與雞GNRHR基因(GENE ID :427517)比對，同源性分別達到89*%、88*%，確認這兩條序列為GNRHR基因序列。2. 3高郵鴨GNRHR基因大部分全長序列的獲得2. 3. I引物設計根據DG2序列設計上游引物GF4，其序列如SEQ ID No : 12，根據DG3序列設計一條下游引物GR4，其序列如SEQ ID No : 13，用于擴增鴨GNRHR基因大部分全長序列。2. 3. 2序列測定鴨基因組DNA模板2 μ I ;上游引物GF4 :1 μ 1，下游引物GR4 :1 μ I ；2mMdNTP
2μ l,25mM MgS04 :0. 8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2 μ 1，共計20 μ I ;反應程序:94°C預變性2. 5min ;94°C變性，56°C退火30s ;68°C延伸Imin ;25個循環，68°C延伸5min。利用引物GF4和GR4擴增鴨基因組DNA，克隆測序獲得鴨GNRHR基因I大部分全長序列DG4，其序列如SEQ ID No :14。2. 3. 3序列同源性比對DG4序列與雞GNRHR基因(GENEID :427517)比對，同源性達到90%，確認該部分序列為GNRHR基因序列。2. 4高郵鴨GNRHR基因3’端序列的獲得
2.4.1引物設計根據DG3-1序列設計一條上游引物GF5，其序列如SEQ ID No : 15，根據雞GNRHR基因3，UTR區設計一條下游引物GR5，其序列如SEQ ID No :16。2. 4. 2序列測定鴨基因組DNA模板2 μ I ;上游引物GF5 :1 μ 1，下游引物GR5 :1 μ I ；2mMdNTP 2 μ l,25mM MgS04 :0. 8 μ 1，10*K0D buffer :2 μ 1，KOD plus :1 μ 1，ddH20 :10. 2 μ 1，共計20 μ I ;反應程序:94°C預變性2. 5min ;94°C變性，56°C退火30s ;68°C延伸Imin ;25個循環，68°C延伸5min。利用引物GF5和GR5擴增鴨基因組DNA，克隆測序獲得一條鴨GNRHR基因3，UTR區序列DG5，其序列如SEQ ID No :17。2. 4. 3序列同源性比對DG5序列前161bp序列與DG4序列1654bp 1814bp序列一致,通過NCBI在線Blast以及DNAstar、Bioedit等軟件編輯和拼接，最終獲得GNRHR全長序列SEQ ID No :1。實施例2(I)組織采集采集250日齡及330日齡高產雙黃蛋的高郵鴨(雙黃率3%以上)卵巢組織和單黃蛋高郵鴨卵巢組織各6個，剪取相同部位的卵巢組織置于凍存管中，-80超低溫冰箱保存。(2)主要儀器和試劑熒光定量PCR儀器為Mx3000P (Stratagene公司)，RNA提取用Trizol試劑購自Invitrogen 公司，Sample Protector、AMV 反轉錄酶、DNase I (RNase free)、AMV 逆轉錄酶、SYBR Premix Ex Taq熒光定量試劑盒等購自寶生物工程大連有限公司。⑶引物的設計根據實施例I 中的 SEQ ID No : 10、SEQ ID No :11 和 SEQ ID No :1 序列，應用Primer Premier 5· O軟件包設計GNRHR基因熒光定量引物，上游引物序列Fl (SEQ ID No:18)，下游引物序列Rl (SEQ ID No :19)，目標序列長度108bp，以鴨β-actin基因(登錄號EF667345. I)作為內參基因并設計其上游引物和下游引物，引物序列為上游引物F2 (SEQ IDNo :20)，下游引物R2(SEQ ID No :21)，目標序列長度132bp。引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。(4) RNA的提取和cDNA合成將各組織樣品按姆IOOmg組織加入ImL Trizol勻衆,采用trizol法提取RNA。為克服RNA溶液中痕量基因組DNA對RT-PCR的干擾，采用DNaseI (RNase free, 5U/ μ L)，按照使用說明處理后，采用酚-氯仿-異戊醇法抽提后，溶于DEPC水中。cDNA第一鏈的合成PCR 反應總體積為 20U/ μ L，包括總 RNA5 μ g, oligo (dT) 18 (O. 5ug/ μ I) I μ L，Random 6primer (0. 2ug/μ I) I μ L, buffer 4 μ L, dNTP(IOmM each)2 μ L, RNaseInhibitor(20U/yL)lyL，AMV(10U/yL)，加 DEPC H20 至 20U/yL。反轉錄反應條件為37°C 15min ;然后85°C 30s。得到第一鏈cDNA用于下步PCR反應。(5) GNRHR基因實時熒光定量
采用熒光定量PCR引物，以β-actin基因為管家基因，反應體系為模板2μ 1，SYBR Premix Ex taq(2X) 12. 5μ 1，ROX Dye ΙΙ(50Χ)0· 5μ 1，d ddH20 9. 5 μ 1，上下游引物(20pmol/ul)各O. 25 μ I,總體系為25ul。每個樣品做3個重復。實時熒光定量95°C 30s變性，共進行40個循環擴增，每ー循環包括95°C 5s、60°C 20min,并在每次循環結束后檢測熒光；以每ー個循環上升I°C，從60°C到95°C，全程采集熒光信號，獲得熔解曲線。(6)統計處理相對定量分析以鴨β -actin基因為參照基因，利用Ct值計算各組織部位中mRNA 相對表達量，詳見參考文獻(Wong and Medrano，2005)，標準其計算公式為mRNA相對表達
且—0-Δ ACt
里一」，Δ Δ Ct = Δ Ct目的組織_ Δ Ct標職織
Δ Ct目眺織=Ct @腿H 參照編
Δ Ct麵組織=Ct @腿H 參照翻參照組織樣品為每只鴨卵巢部組織混合后RNA池。利用EXCEL12. O軟件進行統計分析。(7)結果與分析統計結果分析顯示，250日齡高產雙黃蛋高郵鴨的GNRHR基因mRNA表達量為
3.523，顯著高于單黃蛋高郵鴨卵巢組織GNRHR基因mRNA表達量O. 788 (P < O. 05) ；330日齡高產雙黃蛋高郵鴨的GNRHR基因mRNA表達量為5. 332，顯著高于單黃蛋高郵鴨卵巢組織GNRHR基因mRNA表達量I. 829 (P < O. 05)，這ー結果提示，GNRHR基因mRNA表達量的增加能夠有效促進高郵鴨卵子的排放，使其超排，產生雙黃鴨蛋，因此根據我們克隆獲得的GNRHR基因序列，能夠人工合成GNRHR激素。
權利要求
1.一種鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)，其特征在于它經由以下兩對引物GF4 (SEQ ID No: 14)與 GR4(SEQID No :15) ；GF5 (SEQID No :16)與 GR5 (SEQ ID No :17)克隆測序獲得。
2.根據權利要求I所述的鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)，其特征在于其核苷酸序列SEQID No 1所示。
3.根據權利要求2所述的鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)，其特征在于其氨基酸序列SEQID No 2所示。
全文摘要
本發明公布了鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)核苷酸序列SEQ ID No1和該基因編碼的氨基酸序列SEQ ID No2。以及提供了可用于克隆測序獲得鴨促性腺激素釋放激素受體基因(GNRHR)序列的兩對引物GF4(SEQ ID No14)與GR4(SEQ ID No15)；GF5(SEQ ID No16)與GR5(SEQ ID No17)。本發明通過同源克隆測序的方法獲得了鴨GNRHR基因，并成功應用于鴨多產雙黃蛋技術的開發，該基因適用于鴨繁殖性能的分子生物技術的開發和遺傳育種。
文檔編號C12N15/11GK102660549SQ20121012318
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月25日 優先權日2012年4月25日
發明者朱文奇, 李慧芳, 束婧婷, 陳寬維, 陳文峰 申請人:江蘇騰達源農牧有限公司