專利名稱：：一種重組石斑魚生長激素基因及相應多肽的表達系統、生產方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種重組石斑魚生長激素基因及相應多肽的表達系統、生產方法與應用。
背景技術：
：生長激素(growthhormone,GH)是由腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的一種單一肽鏈的蛋白激素，它是一種具有廣泛生理功能的生長調節素。魚類生長激素(fishgrowthhormone,fGH)是魚類腦垂體合成和分泌的一種分子量在22kD左右的蛋白多肽，對魚類的生長和發育有重要作用。GH的促生長作用主要是通過其與肝臟中生長激素受體(GHR)結合后合成分泌胰島素樣生長因子I(IGF-I)而產生。因此肝臟中IGF-I及GHR的mRNA表達量一定程度上反映了魚類的生長狀況和營養狀況。石斑魚中已發現兩種形式的GHR，分別命名為GHR1和GHR2，但是在生長調節方面這兩種GHR的功能差異還有待研究。—部分魚類GH基因已經得到克隆并在原核或者真核表達系統中成功表達。這些重組的生長激素表現出了與天然生長激素相同的生物活性，通過投喂或者注射的方法對魚類進行處理后能明顯促進魚類的生長。石斑魚是海洋珊瑚礁魚類，屬鯧科(Serranidae)石斑魚屬(Epin印helus)，有30多種，具有較高的經濟價值。其生長激素基因已經得到了克隆，其氨基酸序列為重組表達該基因提供了基礎。酵母胞內表達具有表達量高安全無毒性等特點，利用它進行石斑魚生長激素的表達將有較好的應用前景。
發明內容本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種重組石斑魚生長激素基因。本發明另一目的在于提供一種由上述重組石斑魚生長激素基因編碼得到的重組石斑魚生長激素。本發明還有一個目的在于提供含有上述重組石斑魚生長激素基因的克隆載體。本發明還有一個目的在于提供含有上述重組石斑魚生長激素基因的表達載體。本發明還有一個目的在于提供上述表達載體轉化的重組工程菌株。本發明還有一個目的是提供上述重組石斑魚生長激素的生產方法。本發明還有一個目的是提供上述重組石斑魚生長激素在制備海水魚類使用的生長和繁殖調控劑中的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現本發明以已經公布的石斑魚生長激素氨基酸序列為依據，根據酵母表達的密碼子偏好性設計了編碼該氨基酸序列的基因片段，如SEQIDN0:1所示。該片段是通過設計一系列寡聚核苷酸引物以搭橋法PCR的方法合成而得，所述引物序列如SEQIDN0:2SEQIDNO:11所示。將本發明重組石斑魚生長激素基因與克隆載體連接，構建了含有該基因片段的克隆載體和相應的重組菌株。其中，克隆載體優選大腸桿菌pGEMT-gGH，相應的重組菌株即為將大腸桿菌pGEMT-gGH轉入大腸桿菌E.coli.DH5a中所形成的大腸桿菌重組株pGEMT-gGH/DH5a。本發明構建了重組石斑魚生長激素基因的酵母表達載體。該載體的構建方法為本領域的常用方法，即以克隆載體pGEMT-gGH為模板，通過PCR擴增重組石斑魚生長激素基因后，進行酶切和純化，與表達載體pPICZaA的相應酶切位點(EcoRI和Xhol)進行連接，得到酵母表達載體pPICZaA-gGH。本發明還構建了含有多拷貝酵母表達載體pPICZaA-gGH的重組工程菌株。該菌株是通過電擊轉化的方法將表達載體pPICZaA-gGH轉入大腸桿菌E.coli.DH5a中所形成的大腸桿菌重組株pPICZaA-gGH/DH5a，或者將表達載體pPICZaA-gGH轉入畢赤酵母X33中所形成的重組菌株PPICZaA-gGH/X33，通過高濃度抗生素培養基篩選得到。上述構建酵母表達載體的方法中，所述高濃度抗生素優選1000ug/mlZeocin。利用所述重組菌株pPICZaA-gGH/X33生產重組石斑魚生長激素的方法，包括如下步驟(1)菌種的培養發酵將重組菌株接種到含抗生素zeocin的YPG培養基中，于28°C、250rpm條件下培養至0D600為2.0;(2)菌種的誘導表達收集菌液，重懸于以甲醇為碳源的培養基YPM中誘導表達，每24小時補充甲醇至濃度為0.5%，連續誘導5天；(3)將表達產物分離純化，得到重組石斑魚生長激素。上述重組石斑魚生長激素可以直接用于制備適合海水魚尤其是石斑魚屬使用的生長或繁殖調控劑，也可以通過適當的賦形劑、保護劑按一定比例形成組合物來應用。優選的方法是按重組石斑魚生長激素基礎餌料的濕重比為i:ioo的比例充分混合后自然風干，-201:保存。將重組石斑魚生長激素用于生長和繁殖調控劑時，可以明顯促進石斑魚苗的生長和肝臟中IGF-I和GHR2的mRNA表達，對魚體水分、脂肪和蛋白的含量則無顯著影響。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明提供的重組石斑魚生長激素基因通過與適當的載體連接后可在相應的微生物菌株中高效表達，分離純化后可得高純度的重組石斑魚生長激素，而且具有表達水平高，容易純化的有點。通過本發明，可以大量方便地生產重組石斑魚生長激素，降低了生產成本，這種來源穩定、成本低廉的重組石斑魚生長激素可進一步促進石斑魚的生長，可廣泛應用于水產養殖業。圖1為搭橋法PCR人工合成石斑魚生長激素基因及其克隆載體和表達載體構建過程示意圖；圖2為構建酵母表達載體時以pGEMT-gGH為模板擴增gGH的電泳圖，其中M為分子量標準；1和2為PCR擴增產物；N為陰性對照；圖3為酵母表達載體pPICZaA-gGH的PCR鑒定電泳圖，其中M為分子量標準；1和2為PCR擴增產物；N為陰性對照；圖4為酵母表達載體pPICZaA-gGH的雙酶切鑒定電泳圖，其中Ml和M2為分子量標準；1禾P3為未酶切的載體pPICZaA-gGH;2和4為對應的雙酶切產物；圖5為重組酵母誘導表達5天后胞內蛋白的SDS-PAGE圖譜，其中M為蛋白分子量標準；N為轉化pPICZaA的陰性對照；1-7為不同轉化pPICZaA-gGH的單克隆。箭頭所指為目的條帶所在位置；圖6為用黑鯛GH抗體做為一抗的westernblot圖譜，其中M為蛋白分子量標準；N為轉化pPICZaA的陰性對照；1-7為不同轉化pPICZaA-gGH的單克隆。箭頭所指為目的條帶所在位置；圖7為用含重組酵母的餌料投喂石斑魚苗的生長曲線圖。其中Hgroup為投喂含1%重組gGH佴料的實驗組，Lgroup為投喂0.1%重組gGH佴料的實驗組，control為投喂1%空載體重組酵母的對照組。*表示p<0.05;**表示p<0.01;圖8為投喂含重組酵母的佴料后石斑魚肝臟IGF-I、GHR1和GHR2mRNA相對表達的定量PCR結果。其中Hgroup為投喂含1%重組gGH餌料的實驗組，Lgroup為投喂0.1%重組gGH佴料的實驗組，control為投喂1%空載體重組酵母的對照組。**表示p<0.01;具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。實施例1斜帶石斑魚生長激素成熟肽基因的人工合成根據已發表的斜帶石斑魚生長激素成熟肽的氨基酸序列和酵母表達的密碼子偏好性，設計搭橋法PCR的引物5對，每條引物的長度約為75bp，引物之間存在22bp的重疊區(見圖l)。引物的序列從左至右為IDN0:2SEQIDNO:11，依次命名為P1P10。合成過程包括3輪PCR反應。在第一輪反應將PI和P2、P3和P4、P5和P6、P7和P8、P9和P10分別兩兩混合，按照PCR反應體系配成lOOul。反應條件為(l)94t:預變性5分鐘;(2)94。C變性45秒，53。C退火45秒，72。C延伸45秒，共30循環;(3)72。C延伸5分鐘。第二輪反應以(P5+P6)產物為核心模板，(P3+P4)、(P7+P8)為兩頭引物，各取33ul，補加1U的DNA聚合酶，反應條件同上。第三輪反應以P3P8的產物為核心模板，(Pl+P2)、(P9+P10)的產物為兩側引物，各取33ul混合，補加1U的DNA聚合酶，PCR反應條件同上。得到100ulPCR反應產物。實施例2克隆載體pGEMT-gGH的構建及含有該載體的大腸桿菌轉化子pGEMT-gGH/DH5a的獲得參照試劑盒pGEMTEasyVectorSystems的操作說明，將實施例1所得的PCR產物與克隆載體按比例混合連接，轉化E.coli.DH5a。提取陽性克隆的質粒，用載體的通用引物進行DNA序列測定。由DNA序列翻譯成的氨基酸序列與已公布的斜帶石斑魚生長激素成熟肽氨基酸序列完全一致，表明克隆載體構建成功。實施例3表達載體pPICZaA-gGH的構建及含有該載體的大腸桿菌轉化子pPICZaA-gGH/DH5a的獲得根據合成的斜帶石斑魚生長激素成熟肽基因序列及表達載體pPICZaA多克隆位點的序列設計一對引物目標基因的PCR擴增引物。上游引物序列如SEQIDNO:12所示；下游引物序列如SEQIDN0:13所示，同時引入終止子(TCA)。以構建的pGEMT-gGH載體為模板，用上述引物對斜帶石斑魚生長激素成熟肽基因進行PCR擴增，擴增出來的片段約為580bp，與預期PCR產物大小一致(見圖2)。將回收純化的基因片段用EcoRI和XhoI雙酶切后與同樣雙酶切的線性載體pPICZaA連接，轉化E.coli.DH5a。提取陽性克隆的質粒，用上述引物進行PCR篩選，可擴增出一條與預期大小(約580bp)相符的特征片段(見圖4)。用EcoRI和Xhol雙酶切檢測重組質粒，酶切產物包括與PCR產物大小(約為580bp)—致的片段，以及與線性載體pPICZaA大小(3.3kb)—致的片段(見圖3)。表明gGH基因已插入表達載體pPICZaA中。對重組質粒進行雙向測序，其序列與預期完全一致，沒有出現堿基突變，且讀碼框正確。實施例4重組畢赤酵母表達菌株pPICZaA-gGH/X33的構建取20ug表達載體pPICZaA-gGH用Sacl進行酶切，酶切完全后用膠回收試劑盒進行純化，溶解于15ul雙蒸水中。取80ul畢赤酵母X33感受態細胞，與酶切好的載體在冰上混合均勻，靜置5分鐘。將混合物轉入電擊杯，2000V電壓電擊轉化。電擊結束后迅速加入lml1Msorbital，30。C靜置2小時后涂布在YPDS平板(1000ug/mlZeocin)。30。C培養3天后長出具有抗性的酵母單克隆pPICZaA-gGH/X33。實施例5重組酵母的甲醇利用型鑒定將單克隆對應點在MDH和匪H平板上，先點MDH，后點匪H。在兩種平板上生長均良好的克隆為甲醇利用快型，只在MDH平板上生長良好的克隆為甲醇利用慢速型。結果表明轉化子均為甲醇利用快速型。實施例6石斑魚生長激素在畢赤酵母中的誘導表達及高表達轉化子的篩選挑取7個生長良好的目標基因酵母轉化子和1個陰性對照轉化子(pPICZaA/X33)接種先將菌種到含抗生素Zeocin(500ug/ml)的BMGY培養基中，28°C，250轉/分鐘培養至0D600為2.0。離心收集細胞，重懸于含以甲醇為碳源的培養基B匪Y誘導表達。每24小時補充甲醇至終濃度為0.5%，連續誘導5天。離心收集細胞，用酸處理的玻璃珠在冰上破碎細胞，離心后取上清進行SDS-PAGE和westernblot分析。Westernblot所用一抗為兔抗黑鯛GH多克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標羊抗兔IgG。同時用BCA法對上清進行總蛋白的濃度測定。SDS-PAGE結果(見圖5)顯示7個目標基因轉化子均出現了一條大約22kDa的條帶，與預期相符合，而陰性對照沒有出現。Westernblot結果(見圖6)也與SDS-PAGE結果一致。通過軟件對SDS-PAGE進行掃描分析，得出6號轉化子的外源蛋白表達量最高，約占胞內可溶性總蛋白的8.4%。結合總蛋白含量的檢測結果，重組蛋白表達量約為850mg/1。實施例7餌料中含重組斜帶石斑魚生長激素的添加離心收集誘導表達5天的重組石斑魚生長激素酵母，按濕重1%和0.1%的比例分別與基礎餌料充分混合。對照餌料混合1%的空載體重組酵母。餌料自然風干，-2(TC凍存。實施例8含重組斜帶石斑魚生長激素的餌料對石斑魚苗的促生長作用促生長實驗在廣東省大亞灣水產試驗中心進行，時間為2008年七月初至九月中旬。馴養期間，實驗魚按每組35尾分組分3組分別馴養于容積為140L的桶中，自然光周6期，24h流動海水并充氣。海水溫度28-3(TC，鹽度26-30%。。每天于8:30和17:00用基礎餌料投喂兩次，喂飽為止，馴養時間為10天。馴養之后用不同的餌料分別對實驗魚進行投喂，投喂時間和方法和馴養時一致，投喂時間為期8周，每兩周測量實驗魚的體重一次。實驗結果表明(見圖7)，用含1%重組石斑魚生長激素酵母的餌料投喂魚苗(Hgroup)有明顯的促生長效果。與對照組(control)相比，6周后體重出現顯著性差異(p<0.05)，8周后差異極顯著(p〈0.01)，此時Hgroup增重率比control高36.6%。含0.1%重組石斑魚生長激素酵母的餌料(Lgroup)與control相比沒有明顯的促生長效果。實施例9含重組斜帶石斑魚生長激素的餌料對石斑魚苗水分，脂肪和蛋白的含量的影響經8周投喂后，每實驗組隨機稱取3尾魚進行化學成分分析。將魚處死后將其烘干，稱重后計算其水分含量。將魚干粉碎，稱取少量用石油醚在索式抽提器中抽提總脂肪，進行總脂肪含量的測定；另稱少量用硫酸消化后用凱氏定氮儀進行總蛋白的測定。測定結果(見表l)顯示這三種成分在實驗組和對照組之間沒有顯著性差異，表明投喂含重組斜帶石斑魚生長激素的餌料不改變石斑魚的化學成分。表2投喂含重組酵母的餌料后石斑魚苗身體水分，脂肪和蛋白的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例10含重組gGH酵母的佴料對石斑魚苗肝臟IGF-I，GHR1及GHR2mRNA表達水平的影響經8周投喂后，每實驗組取8尾魚的肝臟樣品，迅速放入液氮保存。提取肝臟總RNA，反轉錄成cDNA。以18S為內參做定量PCR檢測IGF-I，GHR1及GHR2的mRNA表達水平。18S上游引物序列如SEQIDNO:14所示，下游引物序列如SEQIDNO:15所示；IGF-I上游引物序列如SEQIDN0:16所示，下游引物序列如SEQIDNO:17所示；GHR1上游引物序列如SEQIDNO:18所示，下游引物序列如SEQIDN0:19所示；GHR2上游引物序列如SEQIDNO:20所示，下游引物序列如SEQIDNO:21所示。反應在Rochelightcycle480定量PCR檢測系統中進行，反應體系為10ul，反應條件為(l)94t:預變性3分鐘；(2)94t:變性20秒，55。C退火20秒，72。C延伸30秒，84。C收集熒光1秒，共45循環。結果表明，用含1%重組gGH酵母的餌料投喂魚苗能明顯提高其肝臟中IGF-I和GHR2的表達，而GHR1表達量無顯著性差異；用含0.1%重組gGH酵母的佴料投喂則對這三個生長相關基因的表達量均無顯著影響。定量PCR的結果與促生長的效果表現出一致性，說明IGF-I和GHR2在外源gGH對石斑魚的促生長效果中發揮重要作用(圖8)。—種重組石斑魚生長激素基因及相應多肽的表達系統、生產方法與應用序列表SEQUENCELISTING〈110〉中山大學〈120〉一種重組石斑魚生長激素基因及相應多肽的表達系統、生產方法與應用〈130〉〈160>21〈170>PatentInversionl3.2〈210>1〈211>564〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1ctgacggtcaaagattgttctccatcgctgtttctegagttcaacacttg60cacttgttggctcaaagattgttctccgacttcgagtccactttgcaaactgaggagc皿120acaagatcttcttgcaagacttctgteactctgactecatcatctcccca180atcgac^gcaagatcctccgttttgaagttgttgtccatctcctecaga240ttggttgagtcctgggagttcccatctegatccttgtccggtggttctgctcc皿ga皿c300caaatttctccaaagttgtctgagttg皿gactggtetcttgttgttcatcag3gcteac360c皿gacggtgctgagttgttcccagactcctccgctttgcaattggctccatecggteac420tecteccaatctttgggtgctgacgagtctcttecgagttgttggcttgt■ttc皿g皿ggggttg卿cttecttgactgttgcteagtgtegattgtct540ccagaggcteactgteccttgteg564〈210〉2〈211〉75〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉2ctgacggtcaaagattgttctccatcgctgtttctegagttcaacacttg60cacttgttgg75〈210〉3〈211〉74〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3gaattgtctttgctcctcagtttgcaaagtggactcg皿gtcggag^caatctttgagc60c皿c皿gtgc皿gt74〈210〉4〈211〉75〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>4ctgaggagc3朋gac朋ttg朋csiag3tcttcttgc朋gacttctgteactctgactecs60tcatctccccaatcg75〈210>5〈211>75〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5ctgteggag3tggac朋c朋cttc朋朋cggagg;atctttgagtctcgtgcttgtcgatt60gggg卿tg3tgteg75〈210>6〈211>75<212>DNA〈213〉人工序列〈400>6ttgttgtccatctcctacagattggttgagtcctgggagttcccatctagatccttgtcc60ggtggttctgctcca75〈210>7〈211>75〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7tc朋c朋c朋gatecc3gtcttc朋ctcagac朋ctttgg3ga朋tttggtttcttggag60C3g朋cc3ccggaca75〈210>8<211>75〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>8gactggtetcttgttgttcatcagagcteaccaagacggtgctgagttgttcccagactc60ctccgctttgcaatt75〈210>9〈211>75〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>9tcttctca朋gactcgtcagcacccaaagattggtagtegtteccatetggagcc朋ttg60caaagcggaggagtc75〈210>10〈211〉75〈212>DNA<213>人工序列〈400>10ctgacgagtctttgagaagaacttacgagttgttggcttgtttcaagaaggac3tgc3ca60灘gttg3gacttact75〈210>11<211>70〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉11ctac朋ggtecagttagcctctgg3gac朋tctecacttegcaacagtca3gteagtctc60aaccttgtgc70〈210>12〈211〉37〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>12cggcg朋ttc朋t朋tgtctC朋CC朋tC3ctgacgg37〈210〉13〈211〉28〈212>DNA<213>人工序列〈400>13gcggctcgagtcacaaggtacagttagc28〈210〉14〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉14cctgagaaacggctaccacatcc23〈210>15<211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉15agc朋ctttegtatacgctettggag26<210>16〈211>20〈213〉人工序列〈400>16gacattgcccgcatctcatc<210>17〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>17aaaagcctctctctccacacac〈210〉18〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>18gcgactccatcttcattca〈210>19〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列<400>19gcatcctcagcatccacc〈210>20〈211>17〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>20gacgctgctgaatgtga〈210>21〈211>18〈212>DNA<213>人工序列〈400〉21acccgaacctcgtgaatg1權利要求一種重組石斑魚生長激素基因，其特征在于該基因的序列如SEQIDNO1所示。2.—種重組石斑魚生長激素，其特征在于該激素是由權利要求1所述的重組石斑魚生長激素基因編碼得到的。3.—種克隆載體，其特征在于該克隆載體含有權利要求1所述的重組石斑魚生長激素基因。4.根據權利要求3所述的克隆載體，其特征在于所述克隆載體為大腸桿菌克隆載體pGEMT-gGH。5.—種重組工程菌株，其特征在于該菌株是將權利要求3或4所述的克隆載體轉入大腸桿菌E.coli.DH5a中所形成的大腸桿菌重組株。6.根據權利要求5所述的重組工程菌株，其特征在于該菌株是將權利要求3所述的克隆載體pGEMT-gGH轉入大腸桿菌E.coli.DH5a中所形成的大腸桿菌重組株pGEMT-gGH/DH5a。7.—種酵母胞內表達載體pPICZaA-gGH，其特征在于所述表達載體含有權利要求1所述的重組石斑魚生長激素基因。8.—種重組大腸桿菌菌株，其特征在于該菌株是將權利要求7所述的酵母胞內表達載體pPICZaA-gGH轉入大腸桿菌E.coli.DH5a中所形成的大腸桿菌重組株pPICZaA_gGH/DH5a。9.一種重組畢赤酵母菌株，其特征在于該菌株是將權利要求7所述的酵母胞內表達載體pPICZaA-gGH轉入畢赤酵母X33中所形成的重組菌株pPICZaA_gGH/X33。10.權利要求2所述的重組石斑魚生長激素在制備石斑魚類使用的生長或繁殖調控制劑中的應用。全文摘要本發明公開了一種重組石斑魚生長激素基因，該基因序列如SEQIDNO1所示。本發明基因是以石斑魚生長激素基因序列為基礎設計引物，通過引物SEQIDNO2~SEQIDNO11經PCR擴增得到的。本發明還構建了含有該重組石斑魚生長激素基因的表達載體和重組基因工程菌株。本發明還公開了利用重組基因工程菌株生產重組石斑魚生長激素基因的方法及其應用。利用本發明可以批量擴增重組石斑魚生長激素基因，降低了成本且基因來源穩定；本發明重組石斑魚生長激素基因用作生長或繁殖調控劑，可明顯促進石斑魚的生長，避免對魚體本身造成不良影響。文檔編號C12N15/81GK101748131SQ200910193720公開日2010年6月23日申請日期2009年11月6日優先權日2009年11月6日發明者李文笙,李陽源,林浩然,龍少軍申請人:中山大學