一種登革病毒通用型ctl表位dna疫苗制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫藥生物技術領域；更具體地，本發明涉及登革病毒通用型CTL表位 DNA疫苗的構建和應用。
【背景技術】
[0002] 登革病毒（DENV)是一種引起登革熱（DF)以及致死性登革出血熱（DHF)和登革休 克綜合征（DSS)的黃病毒屬蚊媒病毒。DENV的四種不同的血清型（DENV-1，2,3,4)均可通 過埃及伊蚊和白紋伊蚊的叮咬傳播給人類。DENV已流行于熱帶和亞熱帶的100多個國家和 地區，每年約有5000萬-1億的DF病例和25萬-50萬的DHF / DSS病例。目前，登革病毒 1型（DENV-I)是世界上流行的主要的血清型。自1978年中國廣東重現DENV以來，廣東、海 南、臺灣、云南、廣西等地區每隔幾年就會出現DENV的流行和爆發，而且福建、浙江、上海、 貴州等地區也時有輸入性登革病例報道。近年來，由于全球氣候變暖、人口快速增長及頻繁 流動、病毒株變異等因素的影響，DENV流行的國家和地區不斷增加，其不但對全球人類健康 構成了極大的威脅，而且給公共衛生事業造成了極大的經濟負擔。雖然多年來的研究已經 廣泛地了解了 DENV感染的特征，但在研制特異性的有效抗DENV的藥物方面并沒有取得突 破性的進展，因此研制具有較好免疫保護作用的預防性和治療性疫苗具有重要的現實意義 和社會效應。
[0003] DENV感染或接種登革傳統疫苗（滅活疫苗或減毒活疫苗）誘導機體產生的非中和 抗體具有介導抗體依賴性增強效應的作用（ADE作用，在機體二次感染不同DENV血清型時 可加重病情），而DENV感染機體誘導的細胞毒性T細胞（CTL，活化的CD8+T細胞）可以殺 傷DENV感染的細胞，對機體具有保護效應。由于，CTL表位是抗原中誘導特異性CTL反應 的最基本的結構和功能單位，不含有可誘導副作用（如ADE作用）的成分。因此，基于CTL 表位的CTL表位DNA疫苗（采用基因工程的方法將編碼多個CTL表位的基因連接并插入表 達質粒）是一種很有希望的兼具免疫預防和免疫治療作用的新型疫苗。此種DNA疫苗接種 后，蛋白質抗原在宿主細胞內表達并被加工釋放出單個CTL表位，后者即可誘導CTL表位特 異性CTL反應。與傳統疫苗相比，CTL表位DNA疫苗具有成本低、便于貯藏和運輸、安全性 高、在體內維持時間長、制備簡單、無潛在副作用（如ADE作用）等優點。
[0004] HLA-A的三個等位基因HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402在不同種族人群中 總的覆蓋率均超過80%。因而選擇多個受HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402限制的 CTL表位，將其基因片段串聯起來插入真核表達載體，構建成CTL表位DNA疫苗，這樣既增 加了 CTL表位的密度，又增加了重組抗原的人群覆蓋范圍（具有通用型）。HLA-A*0201轉 基因小鼠、HLA-A*1101轉基因小鼠和HLA-A*2402轉基因小鼠分別表達人的HLA-A*0201、 HLA-A*1101、HLA-A*2402 分子，是研究 HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402 限制性 CTL 反 應及評價多表位DNA疫苗免疫原性的重要動物模型。
[0005] 由于目前尚缺乏防治DENV感染的特效方法，因此迫切需要研發出可用于防治 DENV感染的新型疫苗，尤其是基于CTL表位的CTL表位DNA疫苗。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種利用DENV-I的CTL表位構建登革病毒通用型CTL表 位DNA疫苗的方法，及其在機體免疫以及疫苗制備中的應用。
[0007]本發明將編碼 15 個 DENV-I 的 HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402 限制性 CTL 表位的核苷酸以串聯方式構建成一種具有簡易制備，穩定表達、高特異性和覆蓋人群范圍 廣的多表位DNA疫苗，以達到預防和治療DENV感染的目的。
[0008] 本發明涉及一種通用型CTL表位DNA疫苗，其由一個真核表達質粒PCDNA3. 1(_) 載體中和一段如SEQ ID NO :1和圖1所示的外源基因片段組成。考慮到宿主細胞表達外源 蛋白時對密碼子的偏愛性，還對密碼子進行了優化，以期獲得最佳免疫效果。
[0009] 本發明的第一個方面提供了登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗的制備方法。（1) 該CTL表位DNA疫苗是由真核表達質粒pcDNA3. 1 (-)和一段如SEQ ID NO :1所示的外源 基因序列構成，該基因片段起始密碼子ATG的前面為Kozak序列，外源基因所編碼的氨基酸 序列包括IgK鏈信號序列（SEQ ID NO :2)、15條DENV-I特異性CTL表位、小分子連接橋 (Linker)和通用型輔助性T細胞表位（PADRE)，表位序列如下表或SEQ ID NO :3~18所 示。該DNA疫苗具有廣泛人群覆蓋率，克服了不同人群的HLA分子識別不同抗原表位的不 足；（2)登革病毒多表位基因的設計：合成編碼串聯表位的核苷酸序列（編碼單個CTL表位 的核苷酸之間以編碼Linker的核苷酸連接），兩端含限制性核酸內切酶Xba I和Hind III 的酶切位點；（3)重組質粒pcDNA3. 1 (-)的構建：上述核苷酸序列用Xba I和Hind III雙 酶切，然后與用Xba I和Hind III雙酶切的pcDNA3. 1 (-)質粒通過連接反應相連而成登革 病毒通用型CTL表位DNA疫苗；Ig K鏈信號序列可以引導串聯表位進入內質網被蛋白酶體 加工（在Linker的位置切割）釋放出單個CTL表位，后者即可誘導CTL反應。PADRE是一 個通用型輔助性T細胞表位（其可被絕大部分人群及小鼠的CD4+T細胞識別），其可輔助上 述釋放出的CTL表位誘導CTL反應。
[0010] 本發明的第二個方面公布了登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗的用途。登革 病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫HLA-A*0201轉基因小鼠、HLA-A* 1101轉基因小鼠和 HLA-A*2402轉基因小鼠后，可誘導產生CTL表位特異性分泌IFN- Y的T細胞，后者可以殺 傷負載CTL表位的小鼠脾細胞和DENV-I感染的小鼠脾單核細胞。
【附圖說明】
[0011]圖1、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗的核苷酸與氨基酸序列及注釋。其中，上 面為合成的編碼串聯CTL表位的核苷酸序列（兩端為限制性核酸內切酶位點），經Xba I和 HindIII雙酶切后連接入下面的pcDNA3. 1 (-)質粒中形成重組pcDNA3. 1 (-)質粒。
[0012] 圖2、重組pcDNA3. 1 (_)質粒中插入的核苷酸序列測序圖。
[0013] 圖3、重組pcDNA3. 1(_)質粒雙酶切電泳圖。其中，"1"為Xba I和HindIII雙酶 切的重組 pcDNA3. 1 (-)質粒；"2" 為重組 pcDNA3. 1 (-)質粒；"M-1" 和 "M-2" 為 Marker。
[0014] 圖4、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫轉基因小鼠誘導表位特異性 CTL(ELISP0T檢測分泌IFN- Y的細胞）。其中，表示與無表位刺激組比較有顯著性差 異。
[0015] 圖5、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫轉基因小鼠所誘導的表位特異性CTL 殺傷負載CTL表位的脾細胞。其中，"E :T"表示效應細胞與靶細胞的比率；表示與未負 載CTL表位脾細胞組比較有顯著性差異。
[0016] 圖6、登革病毒通用型CTL表位DNA疫苗免疫轉基因小鼠所誘導的表位特異性CTL 殺傷DENV-I感染的脾單核細胞。其中，"E :T"表示效應細胞與靶細胞的比率；表示二 者比較有顯著性差異。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合附圖和實施例對本發明的實施方式作詳細描述，但本發明的實施例僅用 于說明本發明而不是限制本發明的保護范圍。
[0018] 本發明綜合利用分子生物學、病毒學、免疫學、生物信息學等學科知識并結合基因 重組技術，針對DENV研究領域的經驗和教訓，并考慮到DENV特異性CTL的保護效應，構建 了一種針對DENV-I的不同流行株以及絕大部分人群均有治療和預防作用的新型登革病毒 通用型CTL表位DNA疫苗。該疫苗通過接種機體，能夠誘導特異性CTL反應，達到預防DENV 感染或特異性殺傷DENV感染細胞進而清除體內病毒的目的，既可以作為預防性疫苗用于 免疫接種，又可以作為治療性疫苗用于DENV感染者的免疫治療。
[0019] 實施例中采用的試劑、動物等如下：質粒pcDNA3. 1(_)、細菌DH5a菌株由本實驗 室保存。HLA-A*