專利名稱：嵌合外源無關序列的核酸質控的制備方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學方法進行微生物(病毒、細菌、支原體和真菌等)的檢測領域，具體是一整套制備和合成嵌合外源無關序列DNA或RNA質控的技術方法。
背景技術：
基于基于核酸的分子生物學檢測方法或檢測試劑盒都需要通過添加標準陽性質控樣品，用以檢驗檢測過程的有效性，但是，全部來源于檢測對象的標準陽性樣品的添加往往會對檢測反應帶來潛在的污染和判讀的干擾。目前用于分子診斷試劑盒中的主要質控樣品主要是具有感染活性的病毒血清，如王露楠等制備的丙型肝炎病毒標準質控用HCV RNA陰性血漿將陽性血漿稀釋至含量約300 000拷貝數/mL，然后進行真空冷凍干燥.檢測方法采用實時熒光定量聚合酶鏈反應方法和羅氏公司的PCR內標定量方法。該法制備的標準質控樣品具有感染活性，容易導致病毒的擴散和傳播。Satoshi Inoue等制備的用于炭疽桿菌分子診斷中的質控樣品，在質控DNA中引入EcoRV和BamH I兩個酶切位點用于鑒別是否由于質控的污染而導致的假陽性擴增(Satoshi Inoue, 2004)。更為精湛的質控核酸的制備方法來自Laetitia Ninove在2011年發表的論文使用人工合成的含有T7啟動子引物、NotI酶切位點、檢測引物(探針)序列和病毒基因序列的質控DNA (RNA)序列用于各類分子檢測方法的外源性質控(Laetitia Ninove, 2011)。后兩者的共同之處是，制備的質控樣品均無感染性，但是均主要嵌合的是檢測對象本身(或類似)的核酸序列和廣2個常見的酶切位點來鑒別檢測結果中的假陽性和真陽性，鑒別精度低、鑒別反應復雜。本發明通過在無關序列(質粒載體序列或人工隨機序列)的兩側，通過基因克隆法或化學合成法添加待測微生物特異性引物序列，然后利用PCR克隆的辦法獲得嵌合無關序列的DNA質控，進一步利用體外轉錄技術即可獲得可以作為檢測試劑盒的RNA質控。本發明制備的核酸質控均含有一段和檢測對象完全無關的基因序列，在后續的陽性排查中，使用一個針對無關序列的PCR反應即可鑒別檢測結果中的假陽性和真陽性。在陰性對照正常的條件下，核酸質控樣品的陽性擴增，指征檢測反應的有效和正確。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于PCR檢測的DNA質控和一種用于RT-PCR檢測的RNA 質控。為了實現上述目的本發明采用如下技術方案(1)無關序列來源及選擇包括方法I或方法II，當檢測反應為基于產物長度時選用方法I，當方法I不能滿足實際需要，特別是檢測反應為taqman實時定量PCR或類似中間含探針的檢測反應時選用方法II。所述方法I 從現有的質粒載體上選取一段DNA序列，用生物學軟件分析該DNA序列的GC含量和二級構象，滿足如下條件的DNA序列選用為無關序列I :a)無關序列I與待檢測微生物的同源性低于5%，b) GC含量在45% 55%之間，c) 二級結構較為簡單，d)平均 TM值在60°C 85°C之間。
所述方法II 采用化學法合成一段無關序列II，滿足無關序列II和待檢測微生物無同源性。(2)引物的設計
利用引物設計的一般原理針對步驟(1)方法I中所述無關序列I和待檢測微生物分別設計一對無關序列I引物和一對待檢測微生物特異性引物I，在無關序列I引物的上游和無關序列I引物的下游的5'端分別加入待檢測微生物特異性引物I上游和待檢測微生物特異性引物I下游，得到一對嵌合引物。用引物設計的一般原則針對待檢測微生物設計一對待檢測微生物特異性引物II 和待檢測微生物探針，還需要針對無關序列II設計一對無關序列II引物；合成一段從5' 端到3'端依次是待檢測微生物上游引物II、無關序列II、待檢測微生物探針、無關序列II、 待檢測微生物下游引物II的DNA片段。(3) PCR 擴增
用步驟(2 )中所述嵌合引物，PCR擴增步驟(1)方法I所述現有的質粒載體，獲得雙鏈 DNA序列產物I 產物I從5'端到3'端依次是待檢測微生物上游引物I、無關序列I上游引物、無關序列I、無關序列I下游引物和待檢測微生物下游引物I。用步驟(2)中所述待檢測微生物特異性引物II PCR擴增步驟(2)所述DNA片段，獲得雙鏈DNA序列產物II 從5'端到3'端依次是待檢測微生物上游引物序列II、無關序列 II上游引物、無關序列II、待檢測微生物探針、無關序列II、無關序列II下游引物、待檢測微生物下游引物II。(4)克隆
瓊脂糖電泳PCR產物，使用膠回收試劑盒回收產物I或產物II，在分光光度計法定量后，TA連接產物I或產物II到pGEM-T載體上，通過抗性篩選，PCR鑒定轉化子，獲得陽性轉化子pGEM-T-產物I或pGEM-T-產物II，即所需的DNA質控I或DNA質控II ；將DNA質控I 或DNA質控II轉化并保存于大腸桿菌工程菌中。(5)體外轉錄和純化
將pGEM-T-產物I或pGEM-T-產物II經過單酶切進行線性化，酶切位點位于插入基因外，利用體外轉錄試劑盒進行體外RNA的合成，獲得RNA質控I或RNA質控II。純化步驟為a)補充無RNAse酶滅菌水至100 μ L，然后加入900 μ L TriPure Isolation Reagent，振蕩混勻，室溫靜置5 min，加入200 μ L氯仿，震蕩60 s，然后于4°C， 12000 r/min高速離心15 min ;2)取500 μ L上清液，并加入等體積異丙醇室溫靜置30 min, 12000 r/min高速離心15 min，棄去上清，用75%乙醇洗滌1次；3)然后加入1 mL 75%乙醇，保存于-80°C冰箱或液氮。上述方法適用于分子診斷或檢測試劑盒核酸質控品的生產。本發明的優點是本發明所制備的DNA質控和RNA質控和常規技術制備的質控相比，具有反應活性良好、并能和實驗室污染進行鑒別的能力，可以應用于分子生物學檢測 (診斷)試劑盒質控(對照)品的制備。


圖1核酸質控的合成方法示意圖；圖中1-待檢測微生物上游引物序列；2-待檢測微生物下游引物序列；3-待檢測微生物探針序列；4-無關DNA序列上游引物；5-無關DNA序列下游引物；6-來源于pUC18載體的無關DNA序列；7-人工合成的無關隨機DNA序列；8-來源于pGEM_T載體的無關DNA序列。
具體實施例方式實施例1，參見圖1嵌合外源無關序列的核酸質控的制備示意圖，當檢測反應為基于產物長度的采用方法I ；當方法I不能滿足實際需要，特別是檢測反應為taqman實時定量PCR或類似中間含探針的檢測反應時，采用方法II。( 1)無關序列來源的選擇
所述方法I 無關序列來自于現有的質粒載體，如pUC18、pET30等。從現有的質粒載體上選取一段DNA序列，用生物學軟件分析該DNA序列的GC含量和二級構象，滿足如下條件的DNA序列選用為無關序列I :a)無關序列I與待檢測微生物的同源性低于5%，b)GC 含量在45% 55%之間，c) 二級結構較為簡單(70%區域不存在二級結構)，d)平均TM值在 60V 85°C之間；
所述方法II 采用化學法合成一段無關序列II，滿足無關序列II和待檢測微生物無同源性；
(2)引物的設計
利用引物設計的一般原理針對步驟(1)方法I中所述無關序列I和待檢測微生物分別設計一對無關序列I引物和一對待檢測微生物特異性引物I，在無關序列I引物的上游和無關序列I引物的下游的5'端分別加入待檢測微生物特異性引物I上游和待檢測微生物特異性引物I下游，得到一對嵌合引物。擴增產物長度在80bp 1000bp，具體長度根據不同的檢測需要而設定。若使用相同的待檢測微生物特異性引物分別對核酸質控和病原微生物進行檢測，若兩者的產物在長度上有一定的差異(3(Tl00bp均可)，可以直接分辨是否是假陽性；若兩者的產物長度完全一致，則需要使用針對無關基因設計的上下游引物對擴增產物進行一個檢測，以鑒別是否為假陽性擴增。用引物設計的一般原則針對待檢測微生物設計一對待檢測微生物特異性引物II 和待檢測微生物探針，還需要針對無關序列II設計一對無關序列II引物，產物長度在80 bp 以上(可以在合適的電泳系統中分辨即可)。采用化學法合成一段從5'端到3'端依次是待檢測微生物上游引物II、無關序列II、待檢測微生物探針、無關序列II、待檢測微生物下游引物II的DNA片段。待檢測微生物探針5’端到待檢測微生物上游引物II 3’端的距離在 5^50bp之間。無關序列II的上游引物5’端可以和待檢測微生物上游引物II的3’端可以有 5、個堿基的重合。無關隨機序列和待檢測微生物基因序列無明顯相似性。(3) PCR 擴增
用步驟(2 )中所述嵌合引物，PCR擴增步驟(1)方法I所述現有的質粒載體，獲得雙鏈 DNA序列產物I 產物I從5'端到3'端依次是待檢測微生物上游引物I、無關序列I上游引物、無關序列I、無關序列I下游引物和待檢測微生物下游引物I ；
用步驟(2)中所述待檢測微生物特異性引物II PCR擴增步驟(2)所述DNA片段，獲得雙鏈DNA序列產物II -JA 5'端到3'端依次是待檢測微生物上游引物序列II、無關序列II上游引物、無關序列II、待檢測微生物探針、無關序列II、無關序列II下游引物、待檢測微生物下游引物II ；
(4)克隆
瓊脂糖電泳PCR產物，使用膠回收試劑盒回收產物I或產物II，在分光光度計法定量后，TA連接產物I或產物II到pGEM-T載體上，通過抗性篩選，PCR鑒定轉化子，獲得陽性轉化子pGEM-T-產物I或pGEM-T-產物II，即所需的DNA質控I或DNA質控II ；將DNA質控I 或DNA質控II轉化并保存于大腸桿菌工程菌中；
(5)體外轉錄和純化
為適用于RT-PCR檢測反應，(4)所述DNA質控需要進行體外轉錄合成相應的RNA 將 PGEM-T-產物I或pGEM-T-產物II經過單酶切進行線性化，酶切位點位于插入基因外，利用體外轉錄試劑盒進行體外RNA的合成，獲得RNA質控I或RNA質控II ；
純化步驟為a)補充無RNAse酶滅菌水至100 yL，然后加入900 μ L TriPure Isolation Reagent，振蕩混勻，室溫靜置5 min，加入200 μ L氯仿，震蕩60 s，然后于 4°C, 12000 r/min高速離心15 min ；2)取500 μ L上清液，并加入等體積異丙醇室溫靜置 30 min, 12000 r/min高速離心15 min，棄去上清，用75%乙醇洗滌1次；3)然后加入1 mL 75%乙醇，保存于-80°C冰箱或液氮。上述的嵌合外源無關序列的核酸質控在制備適用于分子診斷或檢測試劑盒核酸質控品的用途。實施例2，質量的鑒定DNA質控和RNA質控均可以分別通過分光光度計測定 0D260, 0D260/0D280比值以及瓊脂糖電泳測定其濃度的大小。也需要分別使用PCR和 RT-PCR鑒定質控核酸的有效性。質量良好的質控DNA和RNA應電泳條帶清晰、0擬60/0擬80 在1. 8 2. 0之間，檢測反應的擴增曲線正常。實施例3，質控的應用
(1)質控PCR/逆轉錄PCR檢測反應
DNA質控和RNA質控分別質控PCR/逆轉錄PCR (RT-PCR)檢測反應。具體為，對于任何一種分子診斷試劑盒，均可以用DNA質控和RNA質控分別當作試劑盒檢測反應的待測樣品， 按照該試劑盒的說明書進行檢測反應。質控樣品出現陽性檢測結果，則表明試劑盒保存良好，檢測反應成立；若質控樣品出現陰性檢測結果，則表明試劑盒試劑失效或檢測人員操作不良，檢測反應失敗。(2)鑒別真陽性擴增和假陽性擴增
若檢測人員對于陽性的檢測結果持有懷疑態度的時候，則需要對陽性的檢測產物進行進一步的鑒別。對于按照方法I制備的核酸質控，可以使用針對無關基因設計的上下游引物對擴增產物(用無菌水稀釋10(Γ1000倍)進行PCR檢測，以鑒別是否為假陽性擴增，25yL擴增體系包括IXPCR 反應緩沖液，1.5 2.0 mol/L MgCl2, 200 ymol/L dNTP (含 A、G、C、 Τ), IU耐熱DNA聚合酶，無關序列上游/下游引物終濃度各0.2 0.4 μ mol/L, Γ5 yL 模板DNA (稀釋的擴增產物)；反應條件為預變性95°C 5 min;35個循環94°C，30 s, 55 60°C，30 s，72°C，l min ；補充延伸72°C，10 min。若PCR檢測為陽性，則表明先前的檢測反應為假陽性；若PCR檢測為陰性，則表明先前的檢測反應為真陽性。
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對于按照方法II制備的核酸質控，可以使用針對無關隨機序列設計的上下游引物對擴增產物(用無菌水稀釋10(Γ1000倍)進行PCR檢測，以鑒別是否為假陽性擴增，25 μ L 擴增體系包括IXPCR 反應緩沖液，1.5 2.0 mol/1 MgCl2, 200 ymol/l dNTP(含 A、G、 C、T)，IU耐熱DNA聚合酶，無關序列上游/下游引物終濃度各0.2 0.4 μ mol/1, Γδ μ L模板DNA(稀釋的擴增產物)；反應條件為預變性95°C 5 min ;35個循環94°C，30 s, 55 60°C，30 s，72°C，l min ；補充延伸72°C，10 min。若PCR檢測為陽性，則表明先前的檢測反應為假陽性；若PCR檢測為陰性，則表明先前的檢測反應為真陽性。若使用相同的待檢測微生物特異性引物分別對核酸質控和病原微生物進行檢測， 若兩者的產物在長度上有一定的差異(3(Tl00bp均可)。則將檢測反應的產物進行電泳，若二者產物長度不一，且都為陽性，則表明檢測反應為真陽性；若二者產物長度一致，且都為陽性，則表明檢測反應為假陽性，需要進行序列測定進行鑒別。實施例4，組裝分子診斷/檢測試劑盒
使用按照本轉錄制備的核酸質控，添加合適的核酸保護劑，乃至添加一些陰性血清，可以制備試劑盒專用的質控(對照)品。a)定性的分子診斷試劑盒
用適宜的陰性血清和保護劑將核酸質控稀釋到不同的稀釋度，取每個稀釋度進行檢測。根據檢測情況，取強陽性、弱陽性以及陰性的稀釋度分別作為試劑盒的強陽性對照、弱陽性對照和陰性對照。在不同的存儲條件下，驗證質控品的穩定性和有效期。取長期穩定有效的質控品作為試劑盒的質控。b)定量的分子診斷試劑盒
用適宜的陰性血清和保護劑將核酸質控稀釋到不同的稀釋度，使其拷貝數呈梯度的變化，取每個稀釋度進行檢測。根據檢測情況，取;Γ6個擴增循環數Ct值呈連續的稀釋度作為試劑盒的拷貝數定量質控。在不同的存儲條件下，驗證質控品的穩定性和有效期。取長期穩定有效的質控品作為試劑盒的質控。實施例5，下面以Hmi流感病毒熒光定量PCR檢測試劑盒的RNA質控的制備為例做進一步說明
1、無關序列的選擇
利用FastPCR生產一段隨機DNA序列 Seq 1
GCTGGATCTGGTATTATCCTGTGCATTGTATTTAACCAAGATACACCAGTCCACGATTGCGATAAGTCTACA GGGTACGGATAGCAGCACTGATCACAACTGTCAGGGACGAACACTTAGAACGCAGGTAGTTCAGAATATACATCCGA TC
2、引物的設計
根據無關序列和待檢測微生物利用引物設計的一般原理設計無關DNA序列引物和待檢測微生物特異性引物，在無關序列引物的上游和無關序列引物的下游的5'端分別加入待檢測微生物特異性引物上游和待檢測微生物特異性引物下游，得到一對嵌合引物。根據Hmi 流感序列(CY039527) Seq 2
GGGAAAACAAAAGCAACAAAAATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATACATTTGCAACCGCAAATGCAGACACATTATGTATAGGTTATCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGT AACACACTCTGTTAACCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATT TGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCC TACATTGTGGAAACATCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTCATCGATTATGAGGAGCTAAGAGA GCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGA ACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAAGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAA GGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCA CCATCCATCTACTAGTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATGCATATGTTTTTGTGGGGTCATCAAGAT ACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGG ACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAAT GGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCA AGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAA AGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTTGGGGCCATTGC CGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAG GATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACGAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAG ATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGT TGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAACTTTGGACT ACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAGCCAGCTAAAAAACAATGCCAAGGAAATTGGAAAC GGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAA ATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAACAAGGATTTACCAGATTT TGGCGATCTATTCAACTGTCGCCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTCCCTGGGGGCAATCAGTTTCTGGATGTGCTCT AATGGGTCTCTACAGTGTAGAATATGTATTAA.
按照引物探針設計的一般原理獲得針對Hmi流感病毒的引物和探針
HlNl 流感病毒上游引物5’ -GCTGGATCTGGTATTATC-3，
HlNl 流感病毒下游引物5，-GATCGGATGTATATTCTGAA-3，
HlNl流感病毒taqman探針
FAM-5’ -AGATACACCAGTCCACGATTGC-3 ‘ -TAMARA。按照引物探針設計的一般原理獲得無關隨機DNA序列的引物 無關隨機DNA序列上游引物5，-CTGTGCATTGTATTTAACCA-3，
無關隨機DNA序列下游引物5，-CACTTAGAACGCAGGTAG-3，。人工合成一段序列 GCTGGATCTGGTATTATCCTGTGCATTGTATTTAACCAAGATACACCAGTCCACGATTGCGATAAGTCTACA
GGGTACGGATAGCAGCACTGATCACAACTGTCAGGGACGAACACTTAGAACGCAGGTAGTTCAGAATATACATCCGA TC。按照質譜級合成上述DNA片段。3、PCR 擴增
以Hmi病毒特異性上下游引物對合成的上述DNA片段進行擴增。PCR體系的配制和參
數遵循一般的原理。50 μ L PCR擴增體系包含IXPCR反應緩沖液，1. 5 mmol/1 MgCl2, 200 ymol/ldNTP(含A、G、C、T)，IU耐熱DNA聚合酶，上游引物/下游濃度各0. 2 μ mol/1, 3 yL模板DNA (人工合成DNA);反應條件為預變性95°C 5 min ;；35個循環94°C，30 s，55°C，30 s，72°C，l min;補充延伸72°C，10 min。將產物電泳回收并用商品化膠回收試劑盒進行純化。4、克隆
分光光度計法定量后，參考PGEM-T載體說明書要求，TA連接純化的PCR產物到pGEM_T 載體上，通過抗性篩選(連接轉化后，在培養中添加50μ g/ml的氨芐青霉素抑制陰性轉化子)、PCR鑒定轉化子(方法同上)，獲得陽性轉化子pGEM-T-產物，即DNA質控。5、體外轉錄和純化
由于流感病毒為RNA病毒，需將所述DNA質控進行體外轉錄合成RNA，步驟是將DNA質控經過Kpn I進行線性化，按照體外轉錄試劑盒說明書的要求進行體外RNA的合成，獲得 RNA 質控。體外轉錄反應液含有:lx Transcription Optimized Buffer, 10 mmol/L DTT, 25U Rnasin Ribonuclease Inhibitor, 0. 5 mmol/L rNTP (含rATP, rGTP, rCTP, rUTP)， 1 ug線性化DNA ；于38°C水浴反應2 h ；
按照上述步驟合成的RNA還含有大量的DNA，需要使用DNA酶進行體外的消化，將所有產物加入IU DNA酶，37°C反應15 min。然后，使用TriPure RNA抽提試劑盒進行抽提和純化。純化步驟為a)補充無RNAse酶滅菌水至100 μ L，然后加入900 μ 1 TriPure Isolation Reagent，振蕩混勻，室溫靜置5 min，加入200 μ L氯仿，震蕩60 s，然后于 4°C, 12000 r/min高速離心15 min ；2)取500 μ L上清液，并加入等體積異丙醇室溫靜置 30 min, 12000 r/min高速離心15 min，棄去上清，用75%乙醇洗滌1次；3)然后加入1 mL 75%乙醇，保存于-80°C冰箱或液氮。使用時取出，恒溫至室溫后12000 r/min高速離心5 min，去除乙醇，RNA沉淀溶解于20 μ L無RNAse水，即可作為質控使用。6、質量的鑒定
通過分光光度計測定RNA質控的0擬60、0D260/0D280比值。也需要分別使用PCR和 RT-PCR鑒定質控核酸的有效性。質控RNA電泳條帶清晰、0擬60/0D280在1. 8 2. 0之間。7、質控的應用
(1)質控逆轉錄PCR檢測反應
以RNA質控為檢測反應的模板，進行檢測反應。檢測條件參照試劑盒說明書。RNA質控樣品具有良好的擴增曲線，Ct值在預定的范圍內，示試劑盒狀態良好。(2)鑒別真陽性擴增和假陽性擴增
若對于陽性的檢測結果持有懷疑態度的時候，則需要對陽性的檢測產物進行進一步的鑒別。用針對無關隨機序列設計的上下游引物對擴增產物(用無菌水稀釋10(Γ1000倍) 進行PCR檢測，以鑒別是否為假陽性擴增，25 μ L擴增體系包括IXPCR反應緩沖液，1.5 mol/L MgC12, 200 μ mol/L dNTP (含 A、G、C、Τ)，IU 耐熱 DNA 聚合酶，無關序列上游 / 下游引物終濃度各0.2 μ mol/L, 1 μ L模板DNA (稀釋的擴增產物)；反應條件為預變性 95°C 5 min ； 35 個循環94°C，30 s，55°C，30 s，72°C，l min ；補充延伸72°C，10 min。 若PCR檢測為陽性，則表明先前的檢測反應為假陽性；若PCR檢測為陰性，則表明先前的檢
10測反應為真陽性。
( 3 )組裝分子診斷/檢測試劑盒
用適宜的陰性血清和保護劑將核酸質控稀釋到不同的稀釋度，使其拷貝數呈梯度的變
化，取每個稀釋度進行檢測。根據檢測情況，取3個擴增循環數Ct值呈連續的稀釋度作為
試劑盒的拷貝數定量質控。在不同的存儲條件下，驗證質控品的穩定性和有效期。取長期穩定有效的質控品作為試劑盒的質控。
權利要求
1.嵌合外源無關序列的核酸質控的制備方法，包括如下步驟(1)無關序列來源及選擇包括方法I或方法II，當檢測反應為基于產物長度時選用方法I，當檢測反應為taqman實時定量PCR或類似中間含探針的檢測反應時選用方法II ；所述方法I 從現有的質粒載體上選取一段DNA序列，用生物學軟件分析該DNA序列的 GC含量和二級構象，滿足如下條件的DNA序列選用為無關序列I :a)無關序列I與待檢測微生物的同源性低于5%，b) GC含量在45% 55%之間，c) 二級結構較為簡單，d)平均TM 值在60°C 85°C之間；所述方法II 采用化學法合成一段無關序列II，滿足無關序列II和待檢測微生物無同源性；(2)引物的設計利用引物設計的一般原理針對步驟(1)方法I中所述無關序列I和待檢測微生物分別設計一對無關序列I引物和一對待檢測微生物特異性引物I，在無關序列I引物的上游和無關序列I引物的下游的5'端分別加入待檢測微生物特異性引物I上游和待檢測微生物特異性引物I下游，得到一對嵌合引物；用引物設計的一般原則針對待檢測微生物設計一對待檢測微生物特異性引物II和待檢測微生物探針，還需要針對無關序列II設計一對無關序列II引物；化學合成一段從5' 端到3'端依次是待檢測微生物上游引物II、無關序列II、待檢測微生物探針、無關序列II、 待檢測微生物下游引物II的DNA片段；(3)PCR擴增用步驟(2)中所述嵌合引物，PCR擴增步驟(1)方法I所述現有的質粒載體，獲得雙鏈 DNA序列產物I 產物I從5'端到3'端依次是待檢測微生物上游引物I、無關序列I上游引物、無關序列I、無關序列I下游引物和待檢測微生物下游引物I ；用步驟(2)中所述待檢測微生物特異性引物II PCR擴增步驟(2)所述DNA片段，獲得雙鏈DNA序列產物II 從5'端到3'端依次是待檢測微生物上游引物序列II、無關序列II上游引物、無關序列II、待檢測微生物探針、無關序列II、無關序列II下游引物、待檢測微生物下游引物II ；(4)克隆瓊脂糖電泳PCR產物，使用膠回收試劑盒回收產物I或產物II，在分光光度計法定量后，TA連接產物I或產物II到pGEM-T載體上，通過抗性篩選，PCR鑒定轉化子，獲得陽性轉化子pGEM-T-產物I或pGEM-T-產物II，即所需的DNA質控I或DNA質控II ；將DNA質控I 或DNA質控II轉化并保存于大腸桿菌工程菌中；(5)體外轉錄和純化將pGEM-T-產物I或pGEM-T-產物II經過單酶切進行線性化，酶切位點位于插入基因外，利用體外轉錄試劑盒進行體外RNA的合成，獲得RNA質控I或RNA質控II ；純化步驟為a)補充無RNAse酶滅菌水至100 μ L，然后加入900 μ L TriPure Isolation Reagent，振蕩混勻，室溫靜置5 min，加入200 μ L氯仿，震蕩60 s，然后于 4°C, 12000 r/min高速離心15 min ；2)取500 μ L上清液，并加入等體積異丙醇室溫靜置 30 min, 12000 r/min高速離心15 min，棄去上清，用75%乙醇洗滌1次；3)然后加入1 mL 75%乙醇，保存于-80°C冰箱或液氮。
2.根據權利要求1所述嵌合外源無關序列的核酸質控的制備方法，其特征在于步驟 (2)中所述DNA片段長度在80bp IOOObp之間，無關隨機待檢測微生物探針5’端到待檢測微生物上游引物II 3’端的距離在5 50bp之間。
3.權利要求1所述的嵌合外源無關序列的核酸質控在制備適用于分子診斷或檢測試劑盒核酸質控品的用途。
全文摘要
本發明公開了一種嵌合外源無關序列的核酸質控的制備方法，通過在無關序列的兩側，采用基因克隆法或化學合成法添加微生物特異性引物序列，然后利用PCR擴增，將擴增產物與pGEM-T載體連接，獲得DNA質控，進一步利用體外轉錄技術即可獲得可以作為分子檢測試劑盒的RNA質控。本發明制備的核酸質控均含有一段和檢測對象無關的基因序列，在后續的陽性排查中，可以鑒別是否是由于操作污染造成的虛假擴增。在陰性對照正常的條件下，核酸質控樣品的陽性擴增，指征檢測反應的有效和正確。
文檔編號C12Q1/68GK102443628SQ20111033977
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者李應國, 李賢良, 楊俊 , 王昱, 聶福平, 肖進文 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心