專利名稱：一種適用于基因檢測的WideSpace高通量擴增方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學方法進行基因檢測的領域，具體涉及一種以高通量對10 個及以上的基因進行高通量并行檢測的WideSpace擴增方法。
背景技術：
常規的基因檢測技術一般是通過PCR的方法進行基因的擴增和檢測，通量較低， 靶基因的數量一般不超過5種。對于多個基因需要同時進行檢測是無法實現的，因而一種高通量擴增方法是很必要的。本發明方法主要是基于在靶基因特異性引物的兩端加上一對通用放大引物，在靶基因引物特異性擴增的基礎上，利用放大引物進行信號的統一放大，從而實現多個靶基因的高通量并行檢測。

發明內容
本發明的目的是提供一種高通量多靶基因并行檢測技術和方法。為了實現上述目的本發明采用如下技術方案實現的一種適用于基因檢測的 WideSpace高通量擴增方法包括如下步驟
(1)設定靶基因和靶基因的數量η；
(2)靶基因引物、通用放大引物、嵌套引物的設計a)按照引物設計的一般原理進行靶基因引物的設計；b)將所有靶基因引物按照上游和下游順次整合為一長鏈DNA ；c)利用 FastPCR或同類軟件隨機生成一段隨機DNA片段，針對這段隨機DNA片段進行引物設計，得到通用放大引物；將通用放大引物與步驟b)中的長鏈DNA進行二聚體分析，若二聚體均滿足自由能的絕對值在7以內，否則返回步驟c)重新設計，同時將通用放大引物和靶基因進行NCBI Primer Blast在線分析，若通用放大引物和靶基因無非特異擴增，則完成通用放大引物的設計，否則返回步驟c)重新設計；d)將通用放大引物的上游分別添加到每條靶基因引物的上游5'端，將通用放大引物的下游分別添加到每條靶基因引物的下游5'端，即得到η對嵌套引物；
(3)檢測體系和反應條件同時在一個檢測體系中添加所有的嵌套引物和通用放大引物，引物間的比例為嵌套引物1上游嵌套引物1下游嵌套引物2上游嵌套引物2下游 嵌套引物3上游嵌套引物3下游…嵌套引物η上游嵌套引物η下游通用放大引物上游通用放大引物下游等于1:1:1:1:1:1··· :1:1:4:4;
檢測反應2(T25uL檢測反應液含有Ix反應緩沖液，2.(T5.0mmOl/L MgCl2, 200^400 μ mol/L dNTP, 1. 5^3U耐熱DNA聚合酶，各種嵌套引物上游和嵌套引物下游濃度均為0.廣0. 5 μ mol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的濃度均為0. Γ2μπι01/ L, 1. 5 5% DMS0,0. Γθ. 5 mol/L 甜菜堿，50^200 ng cDNA;
反應條件為預變性95°C，5 min ;5 10個循環的預擴增94°C，30 s;45°C 55°C， 35s; 72°C, 60 s 120s; 35 40 個循環94°C，40s，55°C 62°C，40s，65°C 72°C，2 min 5 min ；補充延伸:72°C,10 min ；(4)產物的檢測根據步驟(1)中靶基因的長度跨度，選擇電泳系統進行檢測。本發明的優點是克服了常規基因檢測方法難以在一個反應中同步完成5個以上基因靶標的檢測。本發明可以引用于轉基因檢測、病原微生物的檢測篩查、多基因表達分析等相關領域。


圖1為WideSpace高通量擴增方法示意圖； 圖2為通用放大引物上下游和長鏈DNA序列圖； 圖3為通用引物和長鏈DNA之間互補關系圖4為通用放大引物上游的退火溫度(TM)和二聚體分析圖； 圖5為通用放大引物下游的退火溫度(TM)和二聚體分析圖； 圖6為通用放大引物NCBI Primer Blast在線分析； 圖7為靶基因NCBI Primer Blast在線分析；
圖1中Target RNA-靶基因的RNA ；cDNA-由RNA反轉錄合成的單鏈DNA片段；Target seq-靶基因序列引物區；Ect seq-其他序列；Wsp tag-ffsP引物序列；IPC-反應的內部參照。
具體實施例方式實施例1，一種適用于基因檢測的WideSpace高通量擴增方法包括如下步驟 (1)設定靶基因和靶基因的數量η。根據靶基因的數量η和電泳系統的分辨率，合理分
配終產物的片段大小的長度跨度對于電泳系統分辨率在10 bp 20 bp之間的，各個靶基因的產物片段長度跨度在15 bp 25 bp之間；對于電泳系統分辨率在50 bp 100 bp之間的，各個靶基因的產物片段長度跨度在60 bp 110 bp之間。(2)靶基因引物、通用放大引物、嵌套引物的設計a)按照引物設計的一般原理進行靶基因引物的設計；為了保證后續檢測的成功，要求所有上下游引物的GC%含量在55% 60%之間，TM值不小于58°C。b)將所有靶基因引物按照上游和下游順次整合為一長鏈DNA ； c)利用i^ast PCR或同類軟件隨機生成一段隨機DNA片段，針對這段隨機DNA片段進行引物設計，得到通用放大引物，要求上下游引物的GC%含量在55% 60%之間，TM值不小于58°C ； 將通用放大引物與步驟b)中的長鏈DNA進行二聚體分析，若二聚體均滿足自由能的絕對值在7以內，否則返回步驟c)重新設計，同時將通用放大引物和靶基因引物進行NCBI Primer Blast在線分析，若通用放大引物和靶基因引物均無非特異擴增，則完成通用放大引物的設計，否則返回步驟c)重新設計；d)將通用放大引物的上游分別添加到每條靶基因引物的上游5'端，將通用放大引物的下游分別添加到每條靶基因引物的下游5'端，即得到η對嵌套引物。所有的引物均按照PAGE (及以上)的純度進行化學合成。(3)檢測體系和反應條件同時在一個檢測體系中添加所有的嵌套引物和通用放大引物，引物間的比例為嵌套引物1上游嵌套引物1下游嵌套引物2上游嵌套引物2 下游嵌套引物3上游嵌套引物3下游…嵌套引物η上游嵌套引物η下游通用放大引物上游通用放大引物下游等于1 1 1 1 1 1··· 1 1:4:4。檢測體系中的反應液為2(T25uL檢測反應液含有Ix反應緩沖液(500 mmol/LKCl，100 mmol/L Tris-HCl, 1% Triton X-100), 2. 0 5. 0 mmol/L MgCl2, 200^400 μ mol/ L dNTP (含A、G、C、T)，3U耐熱DNA聚合酶，各種嵌套引物上游和嵌套引物下游濃度均為0.廣0.5 μ mol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的濃度均為0.4 2 ymol/L,5% DMS0，0.5 mol/1甜菜堿，50 200 ng cDNA。其中各物質的摩爾濃度為溶液的終濃度。反應條件為預變性95°C，5 min;5 10個循環的預擴增94°C，30 s;45°C 55 °C , 35s; 72 °C , 60s 120s; 35 40 個循環94°C，40s，55°C 62°C，40s，65°C 72°C， 2 min 5 min ；補充延伸72°C，10 min。(4)產物的檢測根據步驟(1)中靶基因的長度跨度，選擇配套的電泳系統進行檢測。對于片段差距在^P IObP之間的產物，需要使用Agilent 2100 (或類似)的毛細管電泳系統進行分離和檢測。實施例2，若檢測對象為RNA，需要在實施例1步驟(3)之前，提前進行一個單獨的反轉錄反應。2(T25 uL的反轉錄反應液含lx反轉錄緩沖液(50 mmol/L Tris-Hcl, 75mmol/L KCl, 1· 5 5. 0mmol/L MgCl2, lOmmol/L DTT, pH8. 3(25°C )) ,0. 5mmol/L dNTP (含A、G、C、T)，20U RNA酶抑制劑，廣2 U逆轉錄酶，0. Γθ. 5 umol/L下游嵌套引物， 100 500 ng樣品RNA，按參數40 55°C，15 60 min, 85°C , 5 min進行反應。反應完畢后，進行實施例1步驟(3)的檢測反應。其中各物質的摩爾濃度為溶液的終濃度。實施例3，(1)假定的檢測對象為Genel，Gene2, Gene3, Gene4, Gene5, 一共五個基因。(2)按引物設計普通規則設計引物的GC%含量在55% 60%之間，TM值不小于 58°C，獲得靶基因特異性引物如下
Genel
上游5，-TCACCTGTATCTTGAATTATG-3， 下游5’ -GTACAACTATAGCAGAATCTT-3’ ； Gene2
上游5，-TAGACGCAGGTTGAAGAT-3， 下游5’ -GAGTGAGGATAGCATACGA-3’ ； Gene3
上游5’ -CCACCTGCAGCCGATAACACCTC-3’ 下游5，-GGTGGAATTGGCTCTTCCTGCGTTT-3，； Gene4
上游5，-CAGTGGAGTGGAAGGAGAA-3， 下游5’ -ATTACCGTGCCTGTTGGA-3’ ； Gene5
上游5，-CGTACGTGCCGGCGACCATT-3， 下游5’ -GCTTGGGCGACCACGGGAAT-3，。內參基因IPC的設計同上述基因。(3)嵌套引物設計過程
(a)首尾連接所有基因特異性引物(Genel-Gene2-Gene3-Gene4-Gene5)上游-(Genel-Gene2-Gene3-Gene4-Gene5)下游相連為1條長鏈DNA片段5' -TCACCTGTATCTTGAATTATGTAGACGCAGGTTGAAGATCCACCTGCAGCCGATAACACCTCCAGTGGA GTGGAAGGAGAACGTACGTGCCGGCGACCATTGTACAACTATAGCAGAATCTTGAGTGAGGATAGCATACGAGGTGG AATTGGCTCTTCCTGCGTTTATTACCGTGCCTGTTGGAGCTTGGGCGACCACGGGAAT-3’
(b)根據!^astPCR產生隨機序列，手工獲得一對上下游引物，引物符合一般原則外，還應滿足GC%含量在55% 60%之間，TM值不小于58°C。引物初定后，根據后續的分析實時調整。通用放大引物
上游 5，-TCGTGTAGAGACTTACCCGCAT -3， 下游 5，-ACACCAGACAGTCAACAGATCCT-3，。(C)FastPCR分析通用放大引物上下游和以上長鏈DNA的交叉結合特性，參見圖2。(d)要求通用引物和長鏈DNA之間無明顯的結合(互補)，參見圖3。.
(e)通用引物的退火溫度(TM)、二聚體結構分析，滿足設計要求參見圖4、圖5。(f)NCBI在線BLAST分析引物的特異性，參見圖6、圖7。(g)通用放大引物添加到基因特異性引物5’端，形成嵌套引物，序列如下 Genel
上游5’ - TCGTGTAGAGACTTACCCGCATTCACCTGTATCTTGAATTATG-3， 下游5’ - ACACCAGACAGTCAACAGATCCTGTACAACTATAGCAGAATCTT-3’ ； Gene2
上游5’ - TCGTGTAGAGACTTACCCGCATTAGACGCAGGTTGAAGAT-3， 下游5’ - ACACCAGACAGTCAACAGATCCTGAGTGAGGATAGCATACGA-3’ ； Gene3
上游5’ - TCGTGTAGAGACTTACCCGCATCCACCTGCAGCCGATAACACCTC-3’ 下游5’ - ACACCAGACAGTCAACAGATCCTGGTGGAATTGGCTCTTCCTGCGTTT-3’ ； Gene4
上游5’ - TCGTGTAGAGACTTACCCGCATCAGTGGAGTGGAAGGAGAA-3’ 下游5’ - ACACCAGACAGTCAACAGATCCTATTACCGTGCCTGTTGGA-3’ ； Gene5
上游5’ - TCGTGTAGAGACTTACCCGCATCGTACGTGCCGGCGACCATT-3’ 下游5’ - ACACCAGACAGTCAACAGATCCTGCTTGGGCGACCACGGGAAT-3，。(h)按照PAGE級別合成，使用時用RNAse酶Free水溶解，工作液濃度10 umol/L。(4)檢測反應
按照下表配制反應體系 表1反應體系05uL)
權利要求
1.一種適用于基因檢測的WideSpace高通量擴增方法，其特征在于包括如下步驟(1)設定靶基因和靶基因的數量η；(2)靶基因引物、通用放大引物、嵌套引物的設計a)按照引物設計的一般原理進行靶基因引物的設計；b)將所有靶基因引物按照上游和下游順次整合為一長鏈DNA ；c)利用 FastPCR或同類軟件隨機生成一段隨機DNA片段，針對這段隨機DNA片段進行引物設計，得到通用放大引物；將通用放大引物與步驟b)中的長鏈DNA進行二聚體分析，若二聚體均滿足自由能的絕對值在7以內，否則返回步驟c)重新設計，同時將通用放大引物和靶基因進行NCBI Primer Blast在線分析，若通用放大引物和靶基因無非特異擴增，則完成通用放大引物的設計，否則返回步驟c)重新設計；d)將通用放大引物的上游分別添加到每條靶基因引物的上游5'端，將通用放大引物的下游分別添加到每條靶基因引物的下游5'端，即得到η對嵌套引物；(3)檢測體系和反應條件同時在一個檢測體系中添加所有的嵌套引物和通用放大引物，引物間的比例為嵌套引物1上游嵌套引物1下游嵌套引物2上游嵌套引物2下游 嵌套引物3上游嵌套引物3下游…嵌套引物η上游嵌套引物η下游通用放大引物上游通用放大引物下游等于1:1:1:1:1:1··· :1:1:4:4 ；檢測反應2(T25uL檢測反應液含有Ix反應緩沖液，2.(T5.0mmOl/L MgCl2, 200^400 μ mol/LdNTP, 1. 5^3U耐熱DNA聚合酶，各種嵌套引物上游和嵌套引物下游濃度均為0.廣0. 5 μ mol/L，通用放大引物上游和通用放大引物下游的濃度均為0. r2ymol/L, 1. 5 5% DMS0,0. Γθ. 5 mol/L 甜菜堿，50^200 ng cDNA;反應條件為預變性95°C，5 min ;5 10個循環的預擴增94°C，30 s;45°C 55°C， 35s; 72°C, 60 s 120s; 35 40個循環94°C，40s，55°C 62°C，40s，65°C 72°C，2 min 5 min ；補充延伸:72°C,10 min ；(4)產物的檢測根據步驟(1)中靶基因的長度跨度，選擇電泳系統進行檢測。
2.根據權利要求1所述一種適用于基因檢測的WideSpace高通量擴增方法，其特征在于所述 Ix 反應緩沖液包含 500 mmol/LKCl, 100 mmol/LTris-HCl 和 1% Triton X-100。
3.根據權利要求1所述一種適用于基因檢測的WideSpace高通量擴增方法，其特征在于當靶基因為RNA時，需要在步驟(3)之前進行反轉錄。
4.根據權利要求3所述一種適用于基因檢測的WideSpace高通量擴增方法，其特征在于2(T25 uL的所述反轉錄的反應液含Ix反轉錄緩沖液，0. 5mmol/L dNTP, 20U RNA酶抑制劑，Γ2 U逆轉錄酶，0. Γ0. 5 umol/L下游嵌套引物，100 500 ng樣品RNA,反應條件40 55°C，15 60 min，85°C，5 min進行反應；反應完畢后，按權利要求1所述步驟(3)和(4)進行反應、檢測。
5.根據權利要求4所述一種適用于基因檢測的WideSpace高通量擴增方法，其特征在于所述 Ix 反轉錄緩沖液包含 50 mmol/L Tris-Hcl, 75mmol/L KCl, 1. 5 5. Ommo 1/L MgCl2, IOmmo 1/L DTT。
全文摘要
本發明共公開了一種適用于基因檢測的WideSpace高通量擴增方法，該方法包括了靶基因引物、通用放大引物和嵌套引物的設計，設計好通用放大引物后，將通用放大引物的上游分別添加到每條靶基因的上游引物5′端，將通用放大引物的下游分別添加到每條靶基因的下游引物5′端，即可得到嵌套引物。本發明克服了常規基因檢測方法難以在一個反應中同步完成5個以上基因靶標的檢測。本發明可以引用于轉基因檢測、病原微生物的檢測篩查、多基因表達分析等相關領域。
文檔編號C12Q1/68GK102399874SQ20111033977
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者李應國, 楊俊 , 王國民, 王昱, 聶福平, 肖進文 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心