專利名稱：核酸芯片、其制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及酶、微生物或者核酸分子的檢測領域。具體地說，本發明涉及可用于細
胞遷移、細胞增值、細胞分化、細胞凋亡等功能基因篩選的核酸芯片、其制備方法及用途。
背景技術：
RNA干擾(RNA interfering, RNAi)是由雙鏈RNA (double-stranded RNA， dsRNA) 誘發引起同源mRNA高效特異性降解的現象，是生物界一種古老而且進化上高度保守的基 因表達調控機制。1998年研究者發現在C. elegans或果蠅中注入dsRNA可特異性抑制基因 表達，并將這種由dsRNA引發的抑制特定基因表達的現象成為RNAi。隨后RNAi的基礎研究 和應用迅速成為生命科學的熱點領域之一。RNAi研究取得了突破性進展，被《Science》雜 志評為2001年的十大科學進展之一，并名列2002年十大科學進展之首。兩位科學家也因 此獲得了 2006年諾貝爾生理或醫學獎。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基 因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領 域。 RNA干擾技術沉默基因具備簡單、高效、快速等特點。根據實驗的要求，實現特定 基因的沉默，可以使用化學合成的siRNA，也可以使用esiRNA，或者shRNA表達質粒，或者表 達shRNA的病毒等不同形式核酸分子。因為絕大多數模式生物和人的全基因組序列完全已 知，所以針對每一條基因，都可以方便地合成幾條對應的siRNA或構建幾個對應的shRNA質 粒。近年來，有不同規模和形式的siRNA文庫已建立起來。Dharmacon， Ambion以及Sigma 等公司甚至提供人、小鼠等生物的全基因組siRNA文庫，這使得大規模使用RNA干擾技術成 為現實。近年來，利用siRNA文庫在全基因組篩選功能基因已經取得一些令人矚目的結果。 但是，由于其昂貴的篩選成本和繁瑣的操作過程，大大限制了 RNA干擾技術的進一步推廣 和應用。 在研究如何降低siRNA生產成本的同時，科學家和企業家也致力于開發新的方 法來降低siRNA文庫的使用成本。例如，幾個課題組最近開發一種所謂的反向轉染技 術 (Wheeler， D. et al.Nature Genetics Supplement,2005 ;Bailey， S. et al. Nature Methods, 2006 ;Erfle，H.et al. Nature Protocols, 2007)。簡單i井，這種方f去就是^H七學合 成的siRNA，或者將shRNA質粒，或者將表達shRNA的病毒通過點樣的方式固定在玻片表面， 形成一個點陣列，然后直接在玻片表面上鋪長細胞。由于陣列中每個siRNA或者shRNA只能 特異地轉染到一定區域的細胞內，不會形成相互污染。這樣使得在一個io厘米見方的玻璃 片上制備出上千個siRNA點陣，能同時進行研究，因此大大降低地研究成本。這些方法同樣 具有很多缺點。比如，細胞在玻片或硅片上長成一片，很難區分或辨別siRNA的點陣位置， 對后期采集分析信號造成極大的困難；siRNA點陣之間的細胞也會對相鄰點陣中的細胞造 成一定影響；而且，對一些細胞現象如遷移不適用。

發明內容
本發明的目的正是為了解決上述技術問題，提供一種新型的核酸芯片及其制備方 法以及用途。 通過采用表面修飾手段和微納米技術，本發明不僅很好解決傳統反向轉染芯片的 問題，還大大拓展它們的應用范圍，比如對細胞遷移等功能基因的篩選。 本發明所稱的"非生物相容性材料"是指細胞不能在該材料表面進行正常生長、增 殖等活動的材料，若將細胞置于該材料表面培養，則細胞會產生明顯的凋亡或死亡。
"智會g材料(intelligent materials or smart materials)，，是指在^i度、pH 值、化學、壓力、電荷、磁場等參數變化時，材料的物理或化學性會發生變化的所有材料，包 括但不限于聚-N-異丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))、聚乙烯基己內酰胺 (Poly (N-vinylc即rolact咖))、聚丙烯酸、聚丙烯月青、聚醚(Polyethylene-polypropylen eglycol，如BASF公司的Pluronic豕卜'-'S7、 Pluronic*卜'-'S'S、 Pluronic F-108或Piuronic您 F127)、聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物(Polyoxypropylene-polyoxyethylene Block Copolymer)、聚乙二酉享_聚丙二酉享共聚物(Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)、殼聚糖、海藻酸鈉，以及它們的衍生物或混合物。"光刻膠材料(photoresist)"又稱光致抗蝕劑，由感光樹脂、增感劑和溶劑三種主 要成分組成的對光敏感的混合液體。感光樹脂經光照后，在曝光區能很快地發生光固化反 應，使得這種材料的物理性能，特別是溶解性、親合性等發生明顯變化。經適當的溶劑處理， 溶去可溶性部分，得到所需圖像。根據其化學反應機理和顯影原理，可分負性膠和正性膠兩 類。包括但不限于AZ^光刻膠系歹lJ (Microchemicals) ，TI 35E光刻膠(Microchemicals) ， TI 35ES光刻膠(Microchemicals) ， PMGI光刻膠(MicroChem Corp.) ， LOR光刻膠(MicroChem Corp.) ， SU-8光刻膠(MicroChem Corp. ) ， KMPR* 1000光刻膠(MicroChem Corp.) ， PMMA光 刻膠(MicroChem Corp.)等。"核酸"是指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其衍生物組成的材料。包 括但不限于DNA、 siRNA、 esiRNA、 shRNA載體、質粒載體、或以病毒形式存在的載體等。
"核酸-轉染試劑脂質體"是指當兩性分子如磷脂、鞘脂、聚合物等分散于水相時，
分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，避開水相，而親水頭部暴露在水相，形成具有單層或雙 分子層結構的封閉囊泡，核酸分子可以包封在這些囊泡內或吸附在這些囊泡表面。由于這 種囊泡膜層具有生物膜特征，可與細胞融合，能將脂質體囊泡中的核酸或其他成份導入細 胞中。脂質體大小直徑0. 02毫米 5毫米之間。常用轉染試劑包括但不限于Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 、 DharmaconFECT轉染試劑等。 本發明是通過如下的技術方案實現的。第一步，用去垢劑和超純水清洗芯片。該 芯片可以是任何形狀的固態物質，例如玻片、硅片、塑料片、甚至紙片等。第二步，制備覆 蓋層材料溶液。該覆蓋層材料可以為任何非生物相容性材料。優選地，覆蓋材料為智能 材料、光刻膠材料、pH敏感材料或溫度敏感材料。更為優選地，覆蓋材料為聚-N-異丙基 丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))或其衍生物或混合物。比如，制備成6% (w/ v)的Poly(N-isopropylacrylamide) (Sigma)乙醇溶液。第三步，在芯片表面鋪覆一層 覆蓋材料，并制備出不同大小或形狀的微結構圖案。根據覆蓋材料的性能，可使用等離 子刻蝕技術、光刻法、壓印技術等制備圖案。例如，使用光敏材料時，可利用光刻法工藝(photolithography)制備不同形狀的微孔。優選地，利用氧氣刻蝕機和掩膜保護，刻蝕 Poly(N-isopropylacrylamide)的圖案。例如，刻蝕條件為50pa氧壓，200W功率，刻蝕時間 約3-5分鐘。刻蝕完畢，將芯片放入超凈臺中紫外照射消毒。 下一步是在有圖案的芯片上點制核酸陣列。核酸包括但不限于DNA、 siRNA、 esiRNA、 shRNA載體、質粒載體、或以病毒形式存在的載體等。優選地，核酸為siRNA分子。 將核酸_轉染試劑混合制備成脂質體，然后將脂質體混合包裹在轉染載體溶液中。該轉染 載體溶液包含但不限于明膠(gelatin)。轉染載體的作用是在干燥條件下或培養液中能 穩定核酸_轉染試劑脂質體結構，而且在培養液中可以緩釋核酸_轉染試劑脂質體，進入 細胞中。優選地，制備核酸-轉染試劑脂質體，并包裹在核酸轉染載體溶液的方法如下1) 制備核酸_轉染試劑脂質體將0. 1M蔗糖的3微升OptiMEM(Invitrogen)以及2. 5微升 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)加入200微升實驗管中并且充分混勻；然后加入1微升 100iiM的siRNA，混勻后室溫孵育20分鐘；2)制備轉染載體溶液配制O. 1% (w/v)的明膠 (gelatin, Sigma， Type B)水溶液，其中包含有0. 01 % (w/v) fib皿ectin (Invitrogen) ;3) 將脂質體混合包裹在轉染載體溶液中在孵育20分鐘后的核酸-轉染試劑脂質體的試管 中，加入7.5微升轉染載體溶液并充分混勻。然后，將包裹核酸的轉染載體溶液點加在不同 的圖案位置。例如，利用針式或噴墨式點樣儀，同時將包含不同核酸分子的上千種轉染載體 溶液點加在芯片對應的圖案位置上。又例如，也可使用液體分裝儀器(Wang， J.et al. Lap Chip, 2009)來完成點陣制備。 最后，將核酸芯片固定在3. 5cm的培養皿中室溫干燥保存以備使用。使用時將培 養皿置于37t:控溫臺上，加入2-3ml包含lX 105至5X 106個細胞的37"培養基。細胞培 養完成后(約48小時)，將培養皿室溫放置5分鐘使得聚合物完全溶解，再加入PBS清洗三 次，隨時進行相應的實驗，并通過顯微鏡從事觀察或記錄。 與現有基于孔板(如96孔板或384孔板或1536孔板等)篩選技術相比，本發明 提供的核酸芯片具有成本低、便于使用等優點。 與現有技術中已有的核酸芯片相比，本發明提供的核酸芯片在至少以下三個方面 具有特別優異的效果。傳統的核酸芯片僅簡單地將核酸分子附著于基底表面的特定部位 ( 一般這些特定部位排列成點陣)，在進行細胞培養的時候，細胞會無任何區別地在基底的 全部表面生長，這樣會帶來兩個問題一是基底全部表面都被細胞覆蓋，使得對核酸分子位 置的確定變得困難，不利于信號采集與分析；二是核酸分子點陣中的細胞會受到點陣之間 的細胞的干擾，從而影響到觀測結果的準確度和可靠性。但是，使用本發明提供的核酸芯片 進行細胞功能基因篩選研究的時候就不會遇到以上的問題。由于點陣之間的基底表面被非 生物相容性材料覆蓋，細胞只會在核酸分子點陣區域內生長，，不會形成相互干擾。因而，通 過觀察細胞生長的部位便能容易地確定核酸分子點陣的分布區域。最后，當上述非生物相 容性材料去除，細胞能從點陣內向外的擴散便不會再受到其他細胞的干擾，因此本發明提 供的芯片，可以用于準確、可靠地研究細胞遷移的相關試驗。
本發明技術方案總結如下 1. —種核酸芯片，包括基底，該基底的一部分表面附著有核酸分子，其特征在于所
述基底上未附著核酸分子的區域被可抑制細胞生長的材料覆蓋。 2.根據第1項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為非生物相容性材料。
3.根據第1或2項所述的核酸芯片，其特征在于該材料容易制備成微結構圖案。
4.根據1-3的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為智能材料。
5.根據1-3的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為光刻膠、溫度敏感 材料或pH敏感材料。 6.根據1-5的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為聚-N-異丙基丙烯 酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))、聚乙烯基己內酰胺(Poly (N_vinylcaprolactam))、 聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚氨酯、聚醚(Polyethylene-polypropylene glycol)、聚氧丙烯_聚 氧乙條共聚物(Polyoxypropylene-polyoxyethylene block copolymer)、聚乙二酉享_聚丙 二酉享共聚物(Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)、殼聚糖、海 藻酸鈉，以及它們的衍生物或混合物。 7.根據1-6的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料層的厚度為1-500微 米。 8.根據1-7的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子分布在基底表 面多個彼此分立的區域內。 9.根據第8項所述的核酸芯片，其特征在于所述多個彼此分立的區域排列成規則 的點陣。 10.根據第8或9項所述的核酸芯片，其特征在于所述多個彼此分立的區域為圓 形，其直徑在50微米-1毫米之間，彼此間距在50微米-10毫米之間。 11.根據1-10的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子被包裹在轉 染載體中，通過轉染載體附著在基底表面。 12.根據1-11的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子與轉染試劑
形成核酸_轉染試劑脂質體被包裹在轉染載體中，通過轉染載體附著在基底表面。 13.根據第11或12項所述的核酸芯片，其特征在于所述轉染載體為在干燥條件下
或培養液中能保護核酸或核酸_轉染試劑脂質體結構不被破壞的材料或混合物。 14.根據11-13的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述轉染載體為能在培
養液中使得核酸或核酸_轉染試劑脂質體緩釋進入細胞的材料或混合物。 15.根據11-14的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述轉染載體為明膠
(gelatin)、纖粘連蛋白(fibronectin)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(RGD)、透明質
酸(Hyaluronicacid, HA)、瓊脂糖、水凝膠(hydrogel)、聚乳酸(polylactide， PLA)、聚
乙二醇(Polyglycolide)、聚乳酸-羥基乙酸(Polylactide-glycolide， PLGA)、聚烯烴
(polyolefins)、聚酉旨(polyesters)、聚酉先月安(polyamides)、聚石發酸酉旨(polycarbonates)或
聚砜樹脂(polysulfones)，或它們的衍生物或混合物。 16.根據第15項所述的核酸芯片，其特征在于所述明膠的溶液濃度范圍為質量百 分比0. 05%到1%。 17.根據第16項所述的核酸芯片，其特征在于所述明膠中含有蔗糖或纖粘連蛋白 (fibronectin)，其中蔗糖的摩爾濃度范圍為O. 05M到1M，纖粘連蛋白的濃度范圍為質量百 分比0. 005 %到0. 05%。 18.根據1-17的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子為DNA、 siRNA、 esiRNA、質粒或以病毒形式存在的載體。
19.根據1-18的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述基底的材料為玻璃、 聚苯乙烯、聚乙烯、塑料、硅片、陶瓷或紙張。 20. —種制備根據1-19的任意一項所述的核酸芯片的方法，其特征在于其包括如 下步驟 1)將基底清洗干凈，干燥后在其表面制備可抑制細胞生長材料的圖案；
2)將核酸分子或核酸_轉染試劑脂質體包裹在轉染載體中； 3)將包裹核酸分子或核酸_轉染試劑脂質體的轉染載體固定到基底上未被可抑 制細胞生長的材料覆蓋的區域中。 21.根據第20項所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈晾干后，將可抑制細胞生長的材料溶于水、乙醇或其它溶劑中形成溶液，將 所述溶液均勻覆蓋基底表面并干燥，然后將預先準備好的掩模覆蓋在所述可抑制細胞生長 的材料上，將未被掩模遮蓋的部分刻蝕除去，露出基底。 22.根據第21項所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于所述刻蝕為氧氣等離子 體刻蝕。 23.根據第20項所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈，干燥后，將可抑制細胞生長的材料溶于乙醇或水中形成溶液，利用壓印技 術(stampfabrication)直接在基底表面印出所需圖案。 24.根據第20項所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈，干燥后，利用光刻膠在表面制備出相反的圖案，然后在基底涂鍍或共價鍵 連接一種可抑制細胞生長的材料，最后去除光刻膠，保留可抑制細胞生長材料的圖案。
25. —種使用根據1-19的任意一項所述的核酸芯片進行細胞功能基因篩選的方 法，其特征在于包括如下步驟 1)將細胞與核酸芯片上的轉染載體接觸，使核酸或核酸_轉染試劑脂質體緩釋進 入細胞； 2)觀測核酸分子對細胞功能的影響。 26.根據第25項所述的使用核酸芯片進行細胞功能基因篩選的方法，其特征在于 步驟1所述核酸或核酸_轉染試劑脂質體緩釋進入細胞的過程為在芯片上加入細胞和培 養液后開始的2小時，核酸或核酸-轉染試劑脂質體釋放量少于10%，而在隨后的12至24 小時內，逐漸釋放至少40 % 。 27.根據第25或26項所述的使用核酸芯片進行細胞功能基因篩選的方法，其特征 在于步驟2中所述的細胞功能為細胞增值、細胞分化、細胞凋亡、細胞遷移或細胞自噬。
28.根據第27項所述的使用核酸芯片進行細胞功能基因篩選的方法，其特征在于 所述細胞遷移可通過單位時間內細胞小島面積變化來評估。 圖1本發明的核酸芯片制備以及細胞小島陣列形成示意圖。在干凈的玻璃片表面 上鋪覆一層聚-N-異丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide)， PNIAAm， Sigma)。待 干燥后利用等離子刻蝕機，刻蝕出上百個500或800微米直徑的小孔。因為圖案的大小和 形狀完全由掩膜上圖案的大小和形狀決定，所以可以方便地設計、刻蝕出任何形狀或大小


的聚-N-異丙基丙烯酰胺材料圖案。然后，含不同核酸分子轉染載體溶液點加在對應的圖 案位置，制成核酸芯片。加入細胞后培養兩到三天，將培養基溫度降低至室溫移去異-N-丙 基丙烯酰胺，細胞自組裝形成小島。每個小島對應一個核酸點陣，點陣中的核酸將有效地轉 染到對應的小島細胞中。觀察細胞的形態、數目、特定蛋白(利用免疫熒光標記等辦法)、細 胞核等參數，可以達到篩選或研究特定核酸功能的目的。 圖2相差顯微鏡照片顯示細胞小島形狀。左圖顯示四個小島，右圖顯示一個小島。 [OOM] 圖3利用熒光標記的siRNA (如FAM-siRNA，上圖)和GFP質粒(下圖)驗證小 島之間沒有明顯的交叉污染。左圖為相差顯微鏡照片，右圖為對應的熒光顯微鏡照片。 FAM-siRNA或GFP質粒只點在左上角和右下角。 圖4通過細胞小島面積隨時間的變化，來評估細胞的遷移速度。上圖為相差顯微 鏡照片顯示0小時，8小時，15小時三個時間點細胞小島面積變化。下圖為細胞小島面積隨 時間按的變化曲線。每小時測量一次細胞小島面積變化。 圖5三種不同細胞，Hela細胞，H印G2細胞，U2-0S細胞，遷移速度的比較。同一實 驗重復五次，求平均值。結果表明Hela細胞< H印G2細胞< U2-0S細胞。
圖6模擬傳統劃痕法(Wound healing assay)研究細胞遷移。從左到右不同分別 是0小時，6小時，10小時拍得照片。 圖7研究三條基因Pten， Rhog， Sgef分別抑制后對Hela細胞遷移的影響。左圖 為實時熒光定量PCR結果，表明合成的三條基因的siRNA能有效的抑制相應的基因。抑制 Pten基因能提高Hela細胞的遷移速度，相反抑制Rhog或Sgef基因將降低Hela細胞的遷 移速度(右圖)。NC為不相關siRNA序列，為對照實驗使用。 圖8研究三條基因Pten， Rhog， Sgef分別抑制后對U2-0S細胞遷移的影響。左圖 為實時熒光定量PCR結果，表明合成的三條基因的siRNA能有效的抑制相應的基因。抑制 Pten基因能提高U2-0S細胞的遷移速度，相反抑制Rhog或Sgef基因將降低U2-0S細胞的 遷移速度(右圖)。NC為不相關siRNA序列，為對照實驗使用。
具體實施例方式
以下將通過具體的實施例說明本發明，但是這些具體的實施例不應當理解為對本
發明的限制，對某些細節進行修改將仍然落入本發明的保護范圍之內。 實例1細胞培養 實驗中用到的細胞包括Hela， H印G2和U2-0S。細胞培養基是Dulbecco' s ModifiedEagle Medium(DMEM， Invitrogen)，其中包含10%胎牛血清和1 %雙抗。培養條 件濕度95%，溫度37"，5% C02。細胞傳代時，先用PBS清洗一遍，再加入包含5mM EDTA 的0. 25%胰酶，觀察細胞邊緣浮起外觀變圓時加入血清終止消化。使用移液器將貼壁細胞 吹下來，離心除去上清液，獲得沉積的細胞。加入適量的培養基稀釋后使用細胞計數板計 數，然后培養。 實例2利用分配器制備核酸點陣 使用基于微流體技術的分配器(Wang， et al. L即Chip， 2009)進行核酸點陣制備。 根據不同的實驗要求，也可以使用其它點樣儀。分配器設計成帶有六個獨立的管道，因此可 以同時分配六個不同的樣品。壓縮空氣產生的氣壓脈沖(0.04兆帕，15毫秒)可以驅動大約iio納升液體試劑填充在沒有聚合物覆蓋的一個孔表面。點樣時芯片放置在37t:控溫臺
上以免液體試劑溶解聚合物。點樣結束，用超純水清洗分配器管道并且用壓縮空氣吹干以 便下次使用。 實例3細胞自組裝小島 用去垢劑和超純水清洗實驗室常用的玻片(25毫米X 25毫米)表面。干燥后在其 表面滴一層聚合物薄膜，使用65微升6% (w/v)的Poly(N-isopropylacrylamide) (Sigma 或PolySciences)乙醇溶液，干燥后，在室溫中保存12小時。根據實驗要求制備硅片掩模， 利用微加工技術可在其上刻出不同大小或形狀微孔。具體講，將硅片掩模蓋在薄膜干燥后 的玻片上，放入氧氣等離子刻蝕機中刻蝕。刻蝕條件為50pa氧壓，200W功率，刻蝕時間約 3.5分鐘。刻蝕完畢，將玻片放入超凈臺中紫外照射消毒，然后使用分配器在其上加工出 siRNA微陣列。玻片可以用蠟固定在3.5cm的培養皿中室溫干燥保存以備使用。使用時將 培養皿置于37t:控溫臺上，加入3ml包含IX 106個細胞的37t:培養基。細胞培養完成后 (約48小時)，將培養皿室溫放置5分鐘使得聚合物完全溶解，再加入PBS清洗三次，隨時 進行相關實驗(圖2)。 實例4核酸點陣間的交叉污染研究 我們利用熒光標記的siRNA和GFP質粒來研究核酸陣列是否會形成交叉污染。例 如，在兩個對角(如左上角和右下角)點制FAM-siRNA陣列，另外兩個對角(如左下角和右 上角)點制兩個沒有標記siRNA陣列，點陣直徑大小為0. 8毫米，點之間相隔距離為2毫 米。加入細胞培養兩天后，在FAM-siRNA點的細胞中可檢測到熒光信號；相反，在沒有標記 siRNA的細胞中，沒有檢測任何熒光信號(圖3)。同樣，我們利用GFP質粒和普通質粒重復 上述實驗，只在GFP質粒陣列點中發現細胞有熒光信號。這些結果說明，核酸點陣沒有形成 交叉污染。 實例5細胞遷移 細胞遷移在生理學和病理學過程中扮演著非常重要的角色，包括胚胎發育，傷口 愈合，炎癥反應，癌癥細胞侵染和轉移等過程。在過去的這幾年當中，細胞遷移領域取得了 極大的研究進展。細胞遷移是一個多步驟的循環過程，以細胞極化為開端，前端向外突出延 展并且緊密貼壁，后端貼壁松脫并且向前端收縮。然而，這些步驟的分子機理還不是很清 楚，這使得治療癌癥，尤其是當癌細胞發生轉移時，仍然是一項棘手的任務。系統性地鑒別 調控細胞遷移的新型分子，可以幫助我們更好地了解細胞遷移相關的復雜信號網絡。以此 項技術為基礎，就可以找到一些可行的靶點用于治療和診斷。 傳統的大規模RNA干擾篩選主要是在96或384孔板中完成的，并不適合細胞遷移 的結果分析。傳統檢測細胞遷移的技術，包括體外劃線實驗、Boyden小室實驗，都需要額外 的熟練的操作或者特殊的器具，這就導致大規模篩選時不夠精確和低效率。利用本發明制 備的siRNA細胞微陣列芯片，可以用于高通量的篩選調控細胞遷移的功能基因。由于使用 了一種熱敏感的聚合物——聚N-異丙基丙烯酰胺，我們可以輕易的制作出大小和形狀標準 化的圖形。這些填充了小RNA的圖形被細胞所覆蓋。添加細胞培養2到3天后，在室溫下 去除聚N-異丙基丙烯酰胺，組成細胞小島陣列(圖3)。不同時間測量細胞小島面積的變 化，可以計算面積的變化，除以時間間隔來衡量細胞的遷移速度(圖4)。很明顯，在一定的 時間段內(如不超過16小時)，細胞的速度為線性。我們比較發現Hela細胞的遷移速度小于H印G2細胞，而H印G2細胞遷移速度小于U2-0S細胞(圖5)。 實例6模擬劃痕法(wound healing assay)研究細胞的遷移 如果掩膜上的圖案是長方型，本發明可以制備長方型細胞小島(圖6)。當去除聚
N-異丙基丙烯酰胺，細胞開始向周邊移動，最終在中間會合。這些實驗能模擬傳統的劃痕法
(woundhealing assay)，用于細胞遷移的石開究。 實例7 為了考察siRNA芯片研究細胞遷移的可能性，我們合成三條基因Pten，Rhog，Sgef 的siRNA。序列如下
PTEN siRNA sense : 5' -pGUUAGCAGAAACAAAAGGAGdTdT
antisense 5'-pCUCCUUUUGUUUCUGCUAACdTdT
RhoG siRNA sense : 5' -pGCAACAGGAUGGUGUCAAGdTdT
antisense，5， -pUCGUCCAAGAUCGACAUCCdTdT
sGEF siRNA sense 5' -pCAAAUGGCCUUGCCGCUAAdTdTantisense 5' -pUUAGCGGCAAGGCCAUUUGdTdT 我們選取兩種細胞Hela和U2_0S細胞進行研究。首先，檢測三條基因siRNA的抑 制效果。利用實時熒光定量PCR方法，定量檢測了分別轉染三條基因siRNA后48小時，各 自基因mRNA表達水平的變化。圖7表明合成的三條基因的siRNA能有效的抑制相應的基 因(左圖)。其次，考察三條基因被抑制后細胞的遷移行為變化。結果表明抑制Pten后能 提高Hela細胞的遷移速度，相反抑制Rhog或Sgef將降低Hela細胞的遷移速度(右圖)。 利用U2-0S細胞，重復了上述實驗，發現了同樣的規律。這些結果與先前其他研究小組的 手艮道完全——致(Czauderna， F. et al. Nucleic Acids Research, 2003 ;Ellerbroek， S. et al. Molecular Biology ofthe Cell,2004 ;Katoh， H. et al. Journal of Cell Science, 2006)。因此，有力地證明本發明提供的siRNA芯片研究細胞遷移的有效性。
權利要求
一種核酸芯片，包括基底，該基底的一部分表面附著有核酸分子，其特征在于所述基底上未附著核酸分子的區域被可抑制細胞生長的材料覆蓋。
2. 根據權利要求1所述的核酸芯片，其特征在于該材料為非生物相容性材料。
3. 根據權利要求1或2所述的核酸芯片，其特征在于該材料容易制備成微結構圖案。
4. 根據權利要求1-3的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為智能材料。
5. 根據權利要求1-3的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料為光刻膠、溫度 敏感材料或pH敏感材料。
6. 根據權利要求1-5的任意 一 項所述的核酸芯片，其特征在于該材料 為聚-N-異丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide))、聚乙烯基己 內酰胺(Poly(N-vinylc即rolactam))、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚氨酉旨、聚醚 (Polyethylene-polypropylene glycol)、聚氧丙烯_聚氧乙烯共聚物(Polyoxypropylene -polyoxyethylene block copolymer)、聚乙二酉享-聚丙二酉享共聚物(Polyethylene glycol polypropylene glycol block copolymer)、殼聚糖、海藻酸鈉，以及它們的衍生物或混合 物。
7. 根據權利要求l-6的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于該材料層的厚度為 1-500微米。
8. 根據權利要求1-7的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子分布在基 底表面多個彼此分立的區域內。
9. 根據權利要求8所述的核酸芯片，其特征在于所述多個彼此分立的區域排列成規則 的點陣。
10. 根據權利要求8或9所述的核酸芯片，其特征在于所述多個彼此分立的區域為圓 形，其直徑在50微米-1毫米之間，彼此間距在50微米-10毫米之間。
11. 根據權利要求i-io的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子被包裹 在轉染載體中，通過轉染載體附著在基底表面。
12. 根據權利要求1-11的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子與轉染 試劑形成核酸_轉染試劑脂質體被包裹在轉染載體中，通過轉染載體附著在基底表面。
13. 根據權利要求11或12所述的核酸芯片，其特征在于所述轉染載體為在干燥條件下 或培養液中能保護核酸或核酸_轉染試劑脂質體結構不被破壞的材料或混合物。
14. 根據權利要求11-13的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述轉染載體為能 在培養液中使得核酸或核酸_轉染試劑脂質體緩釋進入細胞的材料或混合物。
15. 根據權利要求11-14的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述轉染載體為明 膠(gelatin)、纖粘連蛋白(fibronectin)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(RGD)、透明 質酸(Hyaluronic acid， HA)、瓊脂糖、水凝膠(hydrogel)、聚乳酸(polylactide， PLA)、 聚乙二醇(Polyglycolide)、聚乳酸-羥基乙酸(Polylactide-glycolide， PLGA)、聚烯烴 (polyolefins)、聚酉旨(polyesters)、聚酉先月安(polyamides)、聚石發酸酉旨(polycarbonates)或 聚砜樹脂(polysulfones)，或它們的衍生物或混合物。
16. 根據權利要求15所述的核酸芯片，其特征在于所述明膠的溶液濃度范圍為質量百 分比0. 05%到1%。
17. 根據權利要求16所述的核酸芯片，其特征在于所述明膠中含有蔗糖或纖粘連蛋白(fibronectin)，其中蔗糖的摩爾濃度范圍為O. 05M到1M，纖粘連蛋白的濃度范圍為質量百 分比0. 005 %到0. 05%。
18. 根據權利要求1-17的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述核酸分子為DNA、 siRNA、 esiRNA、質粒或以病毒形式存在的載體。
19. 根據權利要求1-18的任意一項所述的核酸芯片，其特征在于所述基底的材料為玻 璃、聚苯乙烯、聚乙烯、塑料、硅片、陶瓷或紙張。
20. —種制備根據權利要求1-19的任意一項所述的核酸芯片的方法，其特征在于其包 括如下步驟1) 將基底清洗干凈，干燥后在其表面制備可抑制細胞生長材料的圖案；2) 將核酸分子或核酸-轉染試劑脂質體包裹在轉染載體中；3) 將包裹核酸分子或核酸_轉染試劑脂質體的轉染載體固定到基底上未被可抑制細 胞生長的材料覆蓋的區域中。
21. 根據權利要求20所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈晾干后，將可抑制細胞生長的材料溶于水、乙醇或其它溶劑中形成溶液，將 所述溶液均勻覆蓋基底表面并干燥，然后將預先準備好的掩模覆蓋在所述可抑制細胞生長 的材料上，將未被掩模遮蓋的部分刻蝕除去，露出基底。
22. 根據權利要求21所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于所述刻蝕為氧氣等離子 體刻蝕。
23. 根據權利要求20所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈，干燥后，將可抑制細胞生長的材料溶于乙醇或水中形成溶液，利用壓印技 術(stamp fabrication)直接在基底表面印出所需圖案。
24. 根據權利要求20所述的制備核酸芯片的方法，其特征在于步驟1操作方法如下 將基底清洗干凈，干燥后，利用光刻膠在表面制備出相反的圖案，然后在基底涂鍍或共價鍵 連接一種可抑制細胞生長的材料，最后去除光刻膠，保留可抑制細胞生長材料的圖案。
25. —種使用根據權利要求1-19的任意一項所述的核酸芯片進行細胞功能基因篩選 的方法，其特征在于包括如下步驟1) 將細胞與核酸芯片上的轉染載體接觸，使核酸或核酸_轉染試劑脂質體緩釋進入細胞；2) 觀測核酸分子對細胞功能的影響。
26. 根據權利要求25所述的使用核酸芯片進行細胞功能基因篩選的方法，其特征在于 步驟1所述核酸或核酸_轉染試劑脂質體緩釋進入細胞的過程為在芯片上加入細胞和培 養液后開始的2小時，核酸或核酸-轉染試劑脂質體釋放量少于10%，而在隨后的12至24 小時內，逐漸釋放至少40 % 。
27. 根據權利要求25或26所述的使用核酸芯片進行細胞功能基因篩選的方法，其特征 在于步驟2中所述的細胞功能為細胞增值、細胞分化、細胞凋亡、細胞遷移或細胞自噬。
28. 根據權利要求27所述的使用核酸芯片進行細胞功能基因篩選的方法，其特征在于 所述細胞遷移可通過單位時間內細胞小島面積變化來評估。
全文摘要
本發明涉及核酸芯片、其制備方法及用途，屬于酶、微生物或者核酸分子的檢測領域。本發明的核酸芯片包括基底，該基底的一部分表面附著有核酸分子，基底上未附著核酸分子的區域被可抑制細胞生長的材料覆蓋，該材料可以是非生物相容性材料，例如可以是聚-N-異丙基丙烯酰胺、聚乙烯基己內酰胺、聚丙烯酸、殼聚糖、海藻酸鈉等，核酸分子可以是DNA、siRNA、esiRNA、質粒等。本發明的核酸芯片特別適于進行細胞增值、細胞分化、細胞凋亡、細胞遷移等功能基因篩選方面的研究。
文檔編號C12Q1/68GK101696449SQ20091021056
公開日2010年4月21日 申請日期2009年11月10日 優先權日2009年11月10日
發明者席建忠, 黃巖誼 申請人:北京大學;