一種用于大腸桿菌基因敲入的負篩選標記的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體是涉及一種重組工程方法將待目的基因敲入至大 腸桿菌基因組的負篩選標記。
【背景技術】
[0002] 基因表達是現代生物學的一個重要手段，是獲得治療性藥物蛋白和催化用酶等應 用領域的必需手段。在基礎研究領域，基因表達也是研究基因和蛋白的功能和研究生物體 代謝和調控等必不可少的策略。常規的基因表達常常是將目的基因克隆在質粒上再轉化至 宿主菌（最常見的是大腸桿菌），質粒以游離于菌體染色體的形式進行復制，一般常在誘導 之下基因表達。雖然基于質粒的表達最為常見，但基于染色體的基因表達呈現出一些獨特 的優點，如無需抗生素的壓力以維持質粒的存在，可同時進行多個基因的表達而避免選擇 質粒和克隆至質粒的困難。在某些情況之下，由于目的基因的毒性而不能克隆在常為多拷 貝的質粒之上，而基于染色體的表達由于是單拷貝的形式，可以避免毒性的問題。
[0003] 將基因敲入至大腸桿菌基因組常常采用正篩選標記和負篩選標記相結合的方法。 正篩選標記為抗生素抗性基因。目前所采用的負篩選標記有著諸多的缺點，遺傳學中最常 用的負篩選標記為sacB基因。sacB基因編碼的蔗糖6-果糖基轉移酶催化蔗糖而生成對菌 株有毒性的聚鹿糖，故含有sacB的菌株不能生存。但sacB較大（1. 7kb)，sacB和抗生素抗 性基因組成基因盒后，一般在2. 5kb以上，難以進行PCR擴增或難以獲得足夠的量用于轉化 實驗，且當此基因盒整合至基因組之后，對所得菌株進行基因型分析也難以擴增出全長進 行分析，而只能設計針對sacB或抗性基因的引物進行基因型分析。另外，常有高達10%的 細胞對sacB基因產物表現出隨機的抗性，即為背景克隆。這些不足均制約了sacB基因作為 負篩選標記的使用。其他的一些負篩選標記，如thyA、galK、rpsL、upp和pryF等，需要首先 對宿主菌進行突變得到突變株，再以此突變菌株出發進行基因敲入，這樣一方面增加了工 作量，又有著遺傳操作的限制，且常常需要額外添加某些生長元素以維持突變菌株的生存。 鑒于此，開發簡便、實用和高效率的負篩選標記具重要意義。

【發明內容】

[0004] 為開發適用簡潔和高效的負篩選標記用于大腸桿菌基因組的敲入，從而為目的基 因基于染色體的表達提供平臺以及為研究基因和蛋白的功能奠定基礎。
[0005] 本發明公開了plac啟動子驅動的毒性基因ccdB作為大腸桿菌基因敲入的負篩選 標記的應用。
[0006] 本發明提供了一種新型的負篩選標記，即plac啟動子驅動的毒性基因ccdB。本發 明所涉及的基因敲除的方法，包括如下兩個關鍵的步驟：
[0007] (1)第一步是自含plac-ccdB-aacCl模板質粒PLS3161擴增含有同源臂的線性 DNA片段，電轉化至表達重組酶的大腸桿菌。在慶大霉素篩選之下，重組酶催化同源臂之間 的同源重組而將此DNA片段整合至大腸桿菌基因組。
[0008] (2)第二步是利用相同的同源臂擴增目的DNA片段，將目的DNA片段電轉化表 達重組酶的第一步所得菌株，在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的篩選之下，ccdB表達， 其毒性作為負篩選標記的特征，重組酶催化同源臂之間的同源重組，外源DNA片段取代 plac-ccdB-aacCl基因盒而實現基因敲入。
[0009] 本發明所使用的、包含plac-ccdB-aacCl基因盒的模板質粒pLS3161是由如下方 法獲得：以PMK2010為模板，SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2為引物PCR擴增得到363bp的 plac的3'端和ccdB基因，以之為模板，SEQIDN0. 3和和SEQIDN0. 2為引物PCR擴增得 到 414bp完整的plac和ccdB基因。以pBAD322G為模板，SEQIDNO. 4 和SEQIDNO. 5 為 引物PCR擴增得到757bp的aacCl。414bp的plac-ccdB片段和757bp的aacCl片段均以 Xhol酶切，兩個片段和pKD4以T4DNA聚合酶處理所得的鈍端載體以T4DNA連接酶進行連 接。連接產物轉化含有pir基因和gyrA462突變基因型的大腸桿菌宿主菌DB3. 1Apir的 感受態細胞，在50μg/ml的氨芐青霉素和25μg/ml的慶大霉素抗性篩選之下得到重組克 隆。重組克隆以酶切和測序進行驗證得到PLS3161。
[0010] ccdB基因是來源于F質粒的毒性蛋白基因（包含ccdB基因的大腸桿囷質粒F DNA的GenBank收錄號為NC_002483,其中ccdB基因的序列位點為D616_p97105)，所編碼 的CcdB蛋白作用于DNA回旋酶催化周期的不同階段。DNA回旋酶是一種獨特II型拓撲異 構酶，作用底物為共價閉環DNA，使DNA表現出復制所必須的負超螺旋構型。CcdB通過抑制 DNA回旋酶的活性而對細胞表現出毒性而抑制細胞的生長。F質粒同時含有ccdA基因，用 于解除ccdB基因的毒性。
[0011] 本發明中將ccdB置于plac啟動子之下用作負篩選標記來使用。當plac-ccdB整 合至大腸桿菌基因組后，基因組上的lacl基因和plac-ccdB組成了一個嚴謹的調控系統。 lacl基因所編碼的調節蛋白LacI抑制plac啟動子的活性，此時ccdB不能表達故不表現 出對菌株的毒性；而當環境中存在IPTG時，IPTG和調節蛋白Lacl結合，Lacl抑制plac的 活性被解除，plac啟動子得以驅使下游的ccdB基因表達。ccdB編碼的毒性蛋白對菌株有 毒性，菌體細胞不能生存。此時，重組酶催化的同源片段之間發生同源重組，外源基因取代 plac-ccdB的菌株得以存活，這樣就實現了目的基因的敲入。乳糖操縱元的plac啟動子在 大腸桿菌中不同的屬種的基因組中均含有。目前幾乎所用的大腸桿菌基因組中均含有lacl 基因，因此plac-ccdB具有極好的宿主菌的適用性。如某種大腸桿菌宿主菌已攜帶慶大霉 素抗性基因，則可將aacCl置換為其他的抗性基因進行敲入實驗。
[0012] plac-ccdB-aacCl基因盒的全長只用1165bp，大大小于常用的sacB-neo等基因 盒，因此極易擴增得到目的PCR產物（S卩用于電轉化的線性底物DNA)。又因為線性底物DNA 轉化至MG1655和DH10B等不含Pir基因的宿主菌株，不會帶來質粒轉化的背景干擾，故所 得的PCR產物無需凝膠回收。凝膠回收一方面造成DNA較大的損失，一方面由于紫外線對 DNA的照射，DNA的轉化效率急劇降低。篩選基因敲入菌株時只需在固體篩選培養基中含 ImMIPTG，因此方法簡便快捷，任何誘導表達重組酶的質粒均可使用。
[0013] 本發明運用重組工程方法來實現plac-ccdB-aacCl兩側的同源臂和基因組上同 源片段之間的同源重組。重組工程是利用λ-噬菌體來源的重組酶催化同源片段之間的同 源重組進行DNA克隆和修飾的一種DNA操作手段。重組酶基因包含reda，redβ和redγ 基因。redα基因編碼5' 一3'DNA外切酶，外切酶作用于轉化的雙鏈線性DNA分子而得到 DNA單鏈分子；redβ基因編碼單鏈結合蛋白，其結合在單鏈DNA上催化同源DNA分子之間 的重組；redγ基因編碼Gam蛋白，Gam蛋白抑制內源性核酸酶對外源DNA片段的降解，利于 提高同源重組的效率。重組工程避免了繁瑣的基因克隆等操作步驟，隨著其應用的日趨廣 泛，已逐漸成為常規的基因組操作手段。
[0014] 基因表達具有廣闊的應用前景，在目的蛋白，治療用蛋白藥物、催化用酶和免疫治 療等方面的有著多種應用。簡便快捷和高效的基因敲入手段將極大地促進其基因組學和蛋 白質學等研究。本發明的負篩選標記所基因敲除手段可能成為通用的研究手段。
【附圖說明】
[0015] 圖1為含負篩選標記的plac-ccdB-aacCl基因盒用于目的基因敲入的示意圖。
[0016] HA1和HA2分別表示左側和右側的同源臂，plac為由異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)誘導的啟動子，ccdB是來源于F質粒的毒性蛋白基因，aacCl是慶大霉素抗性基因。 首先以PLS3161為模板，設計的引物中含有HA1和HA2的序列，PCR擴增得到含有兩側為同 源臂的Plac-ccdB-aacCl。將此線性DNA片段轉化至表達由λ-噬菌體來源的重組酶的大 腸桿菌細胞中，重組酶催化線性DNA片段中的同源臂和大腸桿菌基因組中的同源片段進行 同源重組，在慶大霉素的抗性篩選之下而獲得Plac-ccdB-aacCl基因盒敲入至大腸桿菌基 因組的抗性菌株。其次，以含相同同源臂的引物擴增目的基因，轉化至含Plac-ccdB-aacCl 基因盒、并誘導表達重組酶的大腸桿菌中，所得菌體鋪布于含IPTG的篩選平板，IPTG誘導 ccdB表達而呈現毒性，表現出負篩選的功能。重組