專利名稱：一種利用喜樹aoc基因轉化提高煙草尼古丁含量的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種利用轉基因技術提高煙草尼古丁含量的方法。本發明還涉及利用基因工程獲得的尼古丁含量高的煙草細胞和植株及其培養的子代、再生植株、植物組織或種子。
背景技術：
茉莉酸類物質是植物界中普遍存在的一種激素，參與植物發育和逆境脅迫下應激反應的信號傳導過程。內源和外源的茉莉酸類化合物能顯著提高植物對機械損傷、動物撕咬、病蟲害侵染、低溫、高鹽等不利外界環境的耐受能力。在植物中，茉莉酸類物質的合成途徑是從細胞膜上釋放的亞麻酸開始，在脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物環化酶、OPDA (12-0X0-(10, 15Z)-phytodienoic acid)還原酶、β -氧化酶、茉莉酸甲基化酶等一系列酶的催化生成茉莉酸和甲基茉莉酸。其中由于丙二烯氧化物會自發水解，由此丙二烯氧化物環化酶的作用在茉莉酸類物質的合成途徑中尤為重要。煙草作為一種重要的模式植物，且易于進行遺傳轉化，是植物的信號途徑研究中的熱門對象；作為一種廣泛種植的經濟作物，煙草的尼古丁含量在物種品質和經濟價值上具有非常重要的意義。常態下，純尼古丁是一種難聞、味苦、無色透明的油質液體，揮發性強，能迅速溶于水和乙醇，對人體有毒性。同時又是一種非常寶貴的醫藥、化工原料和良好的高效低毒殺蟲劑。煙草的尼古丁生物合成途徑中起關鍵作用的有喹啉磷酸核糖轉移酶 (QPT)和N-甲基腐胺轉移酶(PMT)兩種酶。在煙草根部這兩種酶的活性直接影響煙葉的尼古丁含量。相比較而言，利用來源于喜樹的茉莉酸類物質合成途徑的關鍵酶丙二烯氧化物環化酶的基因工程來系統性地提高煙草的尼古丁含量具有很大的優勢(1)在茉莉酸類物質的合成和信號傳導研究領域，全世界的研究人員已經進行了幾十年的深入研究，其生理作用和生化機制比較清楚，為在基因工程中利用茉莉酸類物質生物合成途徑的基因打下了良好的理論和實踐基礎。(2)提供一種全新的思路，采用轉aoc基因提高煙草中尼古丁含量的方法。喜樹是一種和煙草親緣關系比較遠的植物，來源于喜樹的丙二烯氧化物環化酶在煙草中能順利表達并達到高活性效果，提高了尼古丁含量。這為開展植物基因工程研究提供了一個新的方向。目前，尚未有任何與本專利申請中所提及的應用基因工程技術把喜樹的茉莉酸物質生物合成途徑的酶基因尤其是丙二烯氧化物環化酶轉到煙草中，提高煙草尼古丁含量的相關報道，包括專利和文獻。

發明內容
本發明的第一目的就是提供一種利用基因工程技術提高煙草尼古丁含量的方法， 該方法將來源于喜樹的丙二烯氧化物環化酶基因轉到煙草中。本發明的第二目的是提供一種高效表達載體，它包含上述喜樹的丙二烯氧化物環化酶基因片斷。本發明的第三目的是提供一種用上述高效表達載體轉化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是煙草。本發明分離出的DNA分子具有編碼丙二烯氧化物環化酶的核苷酸序列的核心片斷，該核心片斷來源于由申請人在GenBank中登錄的喜樹(Ca剛ioiAeca acuminata )丙二烯氧化物環化酶基因(登錄號AY863^8)的核苷酸序列，用引物Pl (5’-gg actagt Atg get get tea tea act tc-3' ,酶切位點用下劃線表示)禾口 P2 (5' -ga ggttacc Tea gtc agt gaa gtt agg aa_3'，feiEII酶切位點用下劃線表示)，采用PCR法可以從喜樹cDNA文庫中擴增出該核心片斷，喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的cDNA序列見SEQ IDNO :1。全長 ll^bp，開放閱讀框位置為第72位堿基到第812位堿基。本發明提出的利用轉基因技術提高煙草尼古丁含量的方法，利用具有編碼喜樹丙二烯氧化物環化酶(AOC)的核苷酸序列(Genbank No. :AY863428)的植物表達載體，采用轉基因方法在煙草細胞、組織、器官、植株中過量表達喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的DNA分子。其具體步驟如下
1、采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)獲得喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的核心片斷；
2、把喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷可操作地連于表達調控序列，形成表達載
體；
3、采用任何轉基因方法轉移喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷到煙草細胞、組織、器官或植株中；
4、在特定的條件下篩選和鑒定轉化子；
5、在適合的條件下培養尼古丁含量提高的煙草轉化子，獲得轉基因后代。本發明涉及的載體包含具有編碼喜樹丙二烯氧化物環化酶的核苷酸序列的核心片斷的DNA。用上述方法獲得的生命體，它是尼古丁含量提高了的煙草的細胞、組織、器官、植株。本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒等。在本發明中，術語“生命體”指煙草的細胞、組織、器官、或植株。本發明中，術語“任何可能的手段”為獲得喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的方法， 具體包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文庫篩選而后人工合成喜樹丙二烯氧化物環化酶基因及其變異體。本發明中，術語“任何轉基因方法”包括根癌農桿菌Ti質粒介導基因轉化、發根農桿菌Ri質粒介導基因轉化、植物病毒載體介導基因轉化、PEG介導基因轉化、脂質體介導基因轉化、電擊法介導基因轉化、超聲波介導基因轉化、顯微注射介導基因轉化、激光微束介導基因轉化、基因槍介導基因轉化、花粉管通道介導基因轉化、生殖細胞浸泡法介導基因轉化。本發明中，術語“在特定的條件下篩選和鑒定轉化子”是指在離體培養的條件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)選擇出有抗生素抗性的轉化子；可以使用PCR、 Southern雜交、Northern雜交和^festern印跡等方法來鑒定轉化子。
本發明中，術語“在適合的條件下培養尼古丁含量提高的煙草轉化子，獲得轉基因后代”是指對經過鑒定的轉化子離體培養，并檢測尼古丁含量，篩選尼古丁含量提高的優良轉化子進行培養，獲得轉基因后代。本發明中，我們從喜樹中克隆丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷，并構建了植物高效表達載體，導入農桿菌并遺傳轉化煙草，以提高煙草的尼古丁含量，提高煙草的品質。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件， 例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照廠商所建議的條件。實施例1
胃_二_北講仆聽賄心賭白始成汰裁麵工禾早細_聿。1、喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷的獲得
根據喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的全長序列，在該基因的內部第72堿基至第812堿基之間設計引物，擴增741bp序列作為基因片斷，并根據植物表達載體pCAMBIA1304的多克隆酶切位點，分別設計兩條含有分el和ifeiEII限制性內切酶位點以及保護堿基的PCR擴增引物，其引物序列為
Pl 5' -RgactagtAtggctgcttcatcaact tc_3，(SEQ ID NO 2),加I 酶切位點用下劃線表示；
P2 5' -gaggttaccTcagtcagtgaagttaggaa-3' (SEQ ID NO :3)，feiEII 酶切位點用下劃線表示。從喜樹的葉片抽提總RNA (上海華舜生物工程有限公司植物RNA提取試劑盒)，反轉錄成cDNA (TaKaRa RNA PCR Kit)，然后進行PCR擴增，PCR反應體系為50 μ L，包含去離子水，10XPCR 緩沖液 5 μ L，dNTP 1 μ L，MgCl2 3 μ L，引物各 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L，Taq 酶 0. 5 μ L。PCR條件為94° C 3分鐘，隨之以94° C 50秒、60° C 50秒、和72° C 50秒進行觀個循環，最后在72° C延伸8分鐘。1%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片斷長度為75^ρ。電泳分離后，回收(上海華舜生物工程有限公司PCR產物回收試劑盒)目的片斷， 取適量回收產物與pMD 18-T載體(TaKaRa PMD 18-T Vector試劑盒)連接后轉入大腸桿菌 DH5ci，在LB+氨芐青霉素(lOOmgL—1)固體培養基上抗性篩選陽性克隆，PCR鑒定后測序(上海博亞生物工程公司完成)。2、CaMV35S組成型啟動子表達載體pCAMBIA-HnAOC的構建
將經過測序驗證正確后的DH5 α (已經轉入帶有喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷的pMD 18-T載體)搖菌，擴大培養，提取質粒，用和feiEII雙酶切，1%瓊脂糖電泳后回收小片斷。將pCAMBIA1304用和feiEII雙酶切，1%瓊脂糖電泳后回收大片斷。將回收的pCAMBIA1304大片斷和喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷用T4連接酶連接后，轉化DH5ci感受態細胞，LB+卡那霉素(100 mgL—1)固體培養基上篩選陽性抗性克隆，PCR和雙酶切鑒定。獲得轉喜樹丙二烯氧化物環化酶基因核心片斷的重組質粒并命名為 pCAMBIA1304-CaA0C。3、pCAMBIA1304-CaA0C 轉化農桿菌 EHA105
將pCAMBIA1304-CaA0C轉化入農桿菌菌株EHA105，劃板挑取陽性單菌落搖菌，取少量菌液抽提質粒，進行PCR和酶切鑒定。陽性克隆定義為EHA105-CaA0C。實施例2
獲得尼古丁含量提高的轉基因煙草。1、農桿菌EHA105-CaA0C。使用前自冰箱取出，接種于50 ml YEB液體(Rif+，Str+， Kan+), 28°C，200rpm振蕩培養兩次。2、第二次活化0D_達0. 3時加100 μ mol Γ1乙酰丁香酮，繼續，200rmp振蕩培養，OD600達0. 6時室溫下4000rpm離心10分鐘。3、棄上清，菌體用MS (加100 μ mol L—1乙酰丁香酮)液體培養基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的0D_=0. 3左右，稱為轉化液。4、取煙草無菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成0.8 cmXO.8 cm左右的葉盤，放在MSCtol mg Γ1 6-芐氨基嘌呤，1 mg L—1萘乙酸)培養基上，防止葉盤脫水；將葉盤放入農桿菌培養液中，190 rpmJ8°C搖床上浸染10 min ；用藥勺撈出葉盤，放在滅菌的吸水紙上，吸干葉盤上的多余菌液；將吸干的葉盤平放在加蓋一層濾紙的MS (加1 mg L—1 6-芐氨基嘌呤，1 mg L—1萘乙酸)培養基上，25°C左右，于暗處共培養約2天。5、共培養后，按以下步驟將葉盤表面的農桿菌洗掉，其間不時搖動，使葉盤充分接觸溶液
a)無菌水15分鐘
b)無菌水+羧芐青霉素(500mg Γ1)15分鐘
c)MS+羧芐青霉素(500 mg L—1)20分鐘
接著用藥勺撈出葉盤，放在吸水紙上，吸干多余水分；將葉盤放在MS (含30 mg Γ1潮霉素和250 mg L—1羧芐青霉素)培養基上，葉盤邊緣輕壓入培養基中；25°C左右，16 h/24 h光照培養；約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于MS(含0.5 mg Γ1萘乙酸、 30 mg/T1潮霉素和250 mg/T1羧芐青霉素)培養基上進行生根培養；約14天之后將幼苗移栽到裝有1:1:1的泥炭土、蛭石和珍珠巖混合物小型的塑料花盆中在25 °C、14 h光/24 h 的條件下生長。6、用PCR分別檢測潮霉素抗性基因和喜樹丙二烯氧化物環化酶基因在轉基因煙草的基因組中的整合，確認轉基因事件。實施例3
轉基因煙H禾Π非轉基因'煙I^t照的M古T含量檢測丨。1、尼古丁提取
1)待煙草在花盆中長至約20cm時，取煙草中部葉片，去掉中脈，在60°C烘箱中將葉片烘干，研磨成粉末。其中野生型和轉基因煙草各選兩份，一份用100 μ M甲基茉莉酸處理，一份不處理。2)將粉末放置于60°C烘箱，烘干至恒重。3)稱取粉末0. 05g，用lml，25mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 8)于30°C下攪動提取Mh，13. 4 krpm離心Imin,取上清。4)含水提取物減壓過濾，用水稀釋10倍，4°C保存待測。2、尼古丁含量測定
用HPLC首先對標準品進行條件優化，然后測定樣品。首先進標準樣，觀察峰形是否尖而對稱；然后進一個樣品，觀察目標峰附近有沒有其它峰干擾。如果均符合要求，上樣，進行 HPLC測定。非轉基因煙草和轉基因煙草中尼古丁含量的比較
每個樣品均取三個重復。非轉基因煙草葉片和八個獨立轉基因煙草葉片中尼古丁的含量經過檢測。在非轉基因煙草葉片中尼古丁的含量為0.四56%，而在轉Cd基因的煙草葉片中尼古丁的含量普遍比非轉基因的高，其中最高含量達到1. 9952%。
權利要求
1.一種利用喜樹AOC基因轉化提高煙草尼古丁含量的方法，其特征在于利用具有編碼喜樹丙二烯氧化物環化酶的核苷酸序列的植物表達載體，采用轉基因方法在煙草細胞、組織、器官、植株中過量表達喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的DNA分子；其具體步驟如下(1)采用基因克隆或人工合成基因方法獲得喜樹丙二烯氧化物環化酶基因的片斷；(2)把喜樹丙二烯氧化物環化酶基因片斷連于表達調控序列，形成植物高效表達載體；(3)采用轉基因方法轉移喜樹丙二烯氧化物環化酶基因片斷到煙草的細胞、組織、器官、植株中；(4)篩選和鑒定轉化子；(5)培養轉化子，獲得轉基因后代；(6)測定轉基因后代的尼古丁含量。
2.一種植物表達載體，其特征在于它包含喜樹丙二烯氧化物環化酶基因片斷。
3.由權利要求1所述方法獲得的生命體，其特征在于為尼古丁含量提高的細胞、組織、 器官或植株。
4.用權利要求1所述方法獲得的尼古丁含量提高的細胞、組織、器官或植株轉基因生命體的后代。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域，具體為一種利用喜樹AOC基因轉化提高煙草尼古丁含量的方法。本發明涉及包含利用喜樹丙二烯氧化物環化酶(AOC)基因構建植物表達載體，利用基因工程技術在煙草中過量表達喜樹AOC基因提高煙草中尼古丁含量的方法。其過程是從喜樹中克隆AOC基因，構建了植物高效表達載體，導入農桿菌并遺傳轉化煙草，測定轉基因煙草葉片中尼古丁含量。本方法可以在煙草中過量表達喜樹AOC基因，提高煙草中的尼古丁含量。
文檔編號C12N15/52GK102181458SQ20111007995
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月31日 優先權日2011年3月31日
發明者唐克軒, 孫小芬, 皮妍, 蔣科技 申請人:復旦大學