專利名稱：一種新的高效免疫磁珠分選人t淋巴細胞的方法
技術領域：
本發明屬于細胞培養領域，具體涉及人T淋巴細胞的分選及免疫磁珠分離法的操作方法。
背景技術：
免疫磁珠分選法是目前科學研 究中廣泛應用的先進的細胞分離技木。它是通過細胞表面抗原分子與連接磁珠的特異性單克隆抗體結合，在外加磁場的作用下，使得通過單抗與磁珠相連的細胞被吸引而滯留在磁場中；而無此表面抗原的細胞，因不能與連接磁珠的特異性單抗結合，而不能在磁場中停留，借此將細胞分離。作為懸浮生長的細胞，T淋巴細胞不能用貼壁篩選法這種分離貼壁細胞的方法。故分選T淋巴細胞的方法可以則大多數均用免疫磁珠分離方法或者流式細胞木。但是由于流式細胞術對細胞損傷較大，而且可能會對分選出來的細胞造成污染，而無法進行后續實驗，所以本實驗還是選用免疫磁珠分離方法作為分選T淋巴細胞的首選方法。由體內直接取出組織或細胞進行培養叫原代培養。原代培養細胞離體時間短,性狀與體內相似，適用于研究。T淋巴細胞的培養則屬于原代培養，由于無法傳代，導致實驗中所用的活細胞數量隨實驗時間的延長而逐漸下降。故如何能在相同體積的人外周血當中最大化分選出人T淋巴細胞，盡可能延長T淋巴細胞的生存時間，則成為所有在研究淋巴細胞培養領域中關注的ー個技術熱點。本發明的目的是在T淋巴細胞的體外培養技術中，使實驗者得到大量純化的T淋巴細胞。該方法操作簡單，可行實用。

發明內容
為了得到更多數量的純化的人T淋巴細胞，克服T淋巴細胞無法傳代的弱點，本發明提供一種實驗操作方法，使得在相同體積的人外周血當中能盡可能多的分選出人T淋巴細胞。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是本發明提供一種高效免疫磁珠分選人T淋巴細胞的方法，在實驗中，免疫磁珠法在用免疫磁珠分離方法分選T淋巴細胞的過程中，運用密度梯度離心法分離至加入PBS得到以單個核細胞為主的細胞懸液時，不帶蓋放入磁極5分鐘之后，在不拿出磁極的情況下，用移液器吸出細胞懸液，然后再將吸出的細胞懸液又一次吸入試管中，放入磁極5分鐘，當第二次則直接倒出細胞懸液，換新PBS，重復兩次。加入RPMI-1640細胞培養液，用臺盼蘭染色，并且進行活細胞計數，此時細胞數為分離出的T淋巴細胞的數量。首先要動作規范，則在試管與磁極一起將PBS液倒出的時候，動作既要緩慢也要連貫，倒完液體之后則需要停頓幾秒。PBS最多換三次，以減少T淋巴細胞的損失。本發明的有益效果是故如何能在相同體積的人外周血當中最大化分選出人T淋巴細胞，盡可能延長T淋巴細胞的生存時間，操作簡單易行。
具體實施例方式I.材料與方法I. I研究對象健康成年人(主要篩選身體健康,無疾病的志愿獻血者)T淋巴細胞。I. 2 材料EasySep 正選人⑶3試劑盒(StemCell公司)，人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)，RPMI-1640細胞培養基(成都哈里生物)。
I. 3人外周血單個核細胞的分離培養人外周血15ml，肝素抗凝，與D-hank’ s緩沖溶液等倍稀釋，然后用人淋巴細胞分離液分離(分離液與外周血的比例為I : I)，以2500轉離心20分鐘。吸取中間白膜層，カロ適量D-hank’ s緩沖溶液，1500轉離心10分鐘。用RPMI-1640細胞培養液洗滌一次，棄上清，加入含有2%的胎牛血清和lmmol/L EDTA(こニ胺四こ酸)的PBS (磷酸鹽緩沖液)8ml，用臺盼蘭染色，并且進行活細胞計數，活細胞數均大于90%以上，此時細胞數為分離出的單個核細胞數量。選出數量為IX IO7個單個核細胞進入下ー步實驗。I. 4人外周血T淋巴細胞的分離培養首先，將之前分離出的總單個核細胞均分成A組與B組，每組含4ml PBS，使得兩支5ml圓底聚苯こ烯管中的細胞懸液含有相同數量級的單個核細胞。1500轉離心5分鐘。棄上清，兩管均加入100 μ I PBS吹打制成細胞懸液，然后按每ml細胞加入100 μ 1CD3抗體的比例，加入對應的⑶3抗體，吹打混勻，室溫下孵育15分鐘，再加入體積為⑶3抗體一半的免疫磁珠，室溫孵育10分鐘。加入終體積為2. 5ml的PBS。A組細胞懸液，不帶蓋放入磁極5分鐘之后，在不拿出磁極的情況下，倒出細胞懸液，然后拿出試管再加入新的PBS，這樣重復三次。B組細胞懸液，不帶蓋放入磁極5分鐘之后，在不拿出磁極的情況下，用移液器吸出細胞懸液，然后再將吸出的細胞懸液又一次吸入試管中，放入磁極5分鐘，當第二次則直接倒出細胞懸液，換新PBS，重復兩次。最后兩組均加入RPMI-1640細胞培養液，用臺盼蘭染色，并且進行活細胞計數，此時細胞數為分離出的T淋巴細胞的數量。I. 5數據統計兩組間均數比較用t檢驗，數據以5 ±s表示。采用SPSS 17. O for WINDOWS軟件進行分析，檢驗水平為O. 05，當P < O. 05說明有統計學意義。2.實驗結果每組分離出的單個核細胞都為5X IO6個，則分離出的T淋巴細胞數量與單個核細胞數量的比值，A組則在12% 17%之間，B組則在36% 60%之間。表I兩組所分離出的T淋巴細胞數量的比較5 土s，n = 30023]* :與 A 組相比，t = 3. 337 P < O. 05。
權利要求
1.一種高效免疫磁珠分選人T淋巴細胞的方法，包括使用密度梯度離心法分離至加入PBS得到以單個核細胞為主的細胞懸液時(第一次加液)，反復換PBS緩沖液不超過三次。
2.根據權利要求I所述，其特征是第一次加入PBS后，不帶蓋放入磁極5分鐘之后，在不拿出磁極的情況下，用移液器吸出細胞懸液，然后再將吸出的細胞懸液又一次吸入試管中，放入磁極5分鐘。
3.根據權利要求I所述，其特征是當第二、三次加入PBS后，放入磁極5分鐘，則直接倒出細胞懸液。
全文摘要
本發明利用免疫磁珠分選技術，在T淋巴細胞的體外培養技術中，建立一種實驗操作方法，在相同體積的人外周血當中最大化分選出人T淋巴細胞，得到大量純化的T淋巴細胞，盡量彌補淋巴細胞只能原代培養無法傳代的弱點。該方法操作簡單，可行實用。
文檔編號C12N5/0783GK102719398SQ201110079789
公開日2012年10月10日 申請日期2011年3月31日 優先權日2011年3月31日
發明者趙品楠 申請人:趙品楠