專利名稱：：使用brca1相關蛋白(brap)基因內單核苷酸多態性判定炎癥性疾病的方法
技術領域：
：本發明涉及炎癥性疾病的診斷方法，該方法包含檢測存在于BRCAl相關蛋白(BRAP)基因中的基因多態性；還涉及該方法中使用的寡核苷酸、含有該寡核苷酸的炎癥性疾病診斷用試劑盒、以及它們的應用。
背景技術：
：即使生活方式變化以及新的藥理學研究進展，包括心肌梗塞在內的冠狀動脈疾病在很多國家仍成為主要的死亡原因。因此，人們強烈希望能夠鑒定其發病中的遺傳性以及環境性因子。已知共同(共通)的遺傳變異與罹患糖尿病或高血壓等生活方式病的危險性顯著相關。鑒定多基因性疾病的易感基因可以有利用“連鎖”的方法以及利用“相關”的方法。連鎖分析是檢測疾病易感基因的基因座與基因標記(主要是微衛星)的基因座是否連鎖、即，研究基因座之間的關系；而相關性分析是檢測特定的基因標記(主要是單核苷酸多態性SNP)的哪一個態(等位基因)與疾病相關、即，研究等位基因之間的關系。因此可以說，使用共同的變異作為標記的相關性分析比疾病相關基因的局部存在的連鎖分析強很多。單核苷酸多態性(SNPs)是研究與疾病的易罹患性或藥物反應性相關的基因時有用的多態性標記。SNPs對基因產物的質或量有直接影響，使某種疾病或藥物的嚴重副作用產生的危險性增加。因此，期待通過研究多個SNPs，有助于疾病相關基因的鑒定或建立避免藥物副作用的診斷方法。關于基因變異與心肌梗塞的關系有以下方法分析淋巴毒素-a(LT-α)基因、IKappaB-Iike(IKBL)基因、或BATl基因的多態性，判定心肌梗塞的遺傳性因素的方法(W02004/015100號公報)；分析半乳凝素_2的多態性，判定心肌梗塞的遺傳性因素的方法(國際公開W02005/017200號公報)等。還有人報道了醛脫氫酶2基因內的SNP與心肌梗塞的相關性(S.Takagi等人.，HypertensRes.Vol.25，No.5(2002)，677681頁)。但是這些報告中，樣品數、P值均不充分，數據的可靠性低。即，該文獻中，只是用少量的樣品數分析了ALDH2的SNP，因此可以認為是基因分型錯誤，結果的可靠性低，其顯著性也低。如上所述，與心肌梗塞有關的基因變異的研究尚不足夠。非專利文獻1:S.Takagi等人.，HypertensRes.Vol.25，No.5(2002)，677681頁專利文獻1國際公開W02004/015100號公報專利文獻2國際公開W02005/017200號公報
發明內容發明所要解決的課題本發明要解決的課題是鑒定與心肌梗塞等炎癥性疾病的發病進展相關的新型單4核苷酸多態性(SNP)。本發明進一步要解決的課題是利用鑒定的SNP，提供心肌梗塞等炎癥性疾病的診斷方法、或炎癥性疾病的治療藥物的開發方法。解決課題的方法本發明人等為解決上述課題進行了深入研究，結果通過鑒定BRCAl相關蛋白(BRAP)基因內的單核苷酸多態性(SNP)與心肌梗塞的發病進展相關，完成了本發明。S卩，本發明提供以下的發明。(1)炎癥性疾病的判定方法，該方法包含檢測存在于BRCAl相關蛋白(BRAP)基因中的至少一種基因多態性。(2)炎癥性疾病的判定方法，該方法包含檢測存在于BRCAl相關蛋白(BRAP)基因中的至少一種單核苷酸多態性。(3)炎癥性疾病的判定方法，該方法包含檢測以下任意一種多態性(i)SEQIDNO1所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸的A/G多態性(NCBISNPDatabase中的登記號為rs3782886)；(ii)SEQIDNO2所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性(NCBISNPDatabase中的登記號為rsll066001)；或(iii)與上述(i)或(ii)所述的多態性的連鎖不平衡的指標r2為0.8以上(優選為0.9以上)的連鎖不平衡狀態的多態性。(4)(1)(3)中任一項所述的方法，其中，炎癥性疾病是心肌梗塞。(5)寡核苷酸，該寡核苷酸可以與連續的至少10個核苷酸序列或其互補序列雜交，在(1)(4)中任一項所述的方法中作為探針使用，其中，上述連續的至少10個核苷酸序列或其互補序列含有SEQIDNO1所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸的A/G多態性、或SEQIDNO2所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性。(6)寡核苷酸，該寡核苷酸可以擴增連續的至少10個核苷酸序列和/或其互補序列，在(1)(4)中任一項所述的方法中作為引物使用，其中，上述連續的至少10個核苷酸序列和/或其互補序列含有SEQIDNO:1所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸的A/G多態性、或SEQIDNO:2所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性。(7)(6)所述的寡核苷酸，其中，引物是正向引物和/或反向引物。(8)炎癥性疾病診斷用試劑盒，該試劑盒含有(5)(7)中任一項所述的寡核苷酸的1種以上。(9)(8)所述的試劑盒，其中，炎癥性疾病是心肌梗塞。(IO)BRCAl相關蛋白(BRAP)的表達狀態的分析方法，該方法包含檢測SEQIDNO1所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸的A/G多態性、或SEQIDNO:2所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性。(11)炎癥性疾病的治療藥物的篩選方法，該方法包含以下步驟在候選物質的存在下，分析細胞內的BRCAl相關蛋白(BRAP)的表達量或BRCAl相關蛋白(BRAP)的功能，選擇抑制該表達量的物質、或者抑制或修飾該功能的物質。5(12)BRAP的轉錄活性的測定方法，該方法包含將BRAP基因片段導入細胞中，培養該細胞，分析該基因的表達，其中，所述BRAP基因片段含有SEQIDNO:2所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性。(13)抑制或促進BRAP的轉錄活性的物質的篩選方法，該方法包含將BRAP基因片段導入細胞中，在抑制或促進BRAP轉錄活性的候選物質的存在下培養該細胞，分析該基因的表達，其中，所述BRAP基因片段含有SEQIDNO:2所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性。(H)BRAP的轉錄控制因子的篩選方法，該方法包含使BRAP基因片段與預想存在BRAP的轉錄控制因子的試樣接觸，檢測上述片段與轉錄控制因子的結合，其中，所述BRAP基因片段含有SEQIDNO:2所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性。發明效果根據本發明，新鑒定了與心肌梗塞等炎癥性疾病的發病進展相關的單核苷酸多態性(SNP)。通過利用本發明鑒定的SNP，可以提供心肌梗塞等炎癥性疾病的診斷方法、或炎癥性疾病的治療藥物的開發方法。圖1表示通過TAP法鑒定BRAP(a)、通過C0S7強制表達系統確認BRAP和半乳凝素_2的結合(b)、以及血管平滑肌細胞中半乳凝素_2與BRAP的共同存在(c)。圖2是表示冠狀動脈血管平滑肌細胞中的BRAP內含子3A/GSNP的螢光素酶測定(a)、冠狀動脈血管平滑肌細胞提取液中的BRAP內含子3A/GSNP區的凝膠移位分析(b)、冠狀動脈血管內皮細胞中的BRAP、ALDH2敲除帶來的NFκB活性的變化。具體實施例方式本發明中，鑒定出BRCAl相關蛋白(BRAP)基因產物與作為心肌梗塞等炎癥性疾病易感基因產物而已知的半乳凝素_2基因產物結合。通過利用本發明鑒定的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的SNP，可以得到心肌梗塞等炎癥性疾病的新型診斷、預防方法、以及治療藥物的開發。以下對于本發明的實施方案進一步具體說明。[1]炎癥性疾病的判定方法本發明的方法是通過檢測存在于顯示與炎癥性疾病相關性的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因中的基因多態性、特別是單核苷酸多態性(SNPs)，來判定炎癥性疾病是否發病、或者炎癥性疾病發病的可能性的方法。本發明中，“檢測存在于BRCAl相關蛋白(BRAP)基因中的至少一種基因多態性(單核苷酸多態性等)”是指(i)直接檢測該基因多態性(稱為基因側多態性)、以及(ii)檢測存在于上述基因的互補序列一側的基因多態性(稱為互補側多態性)，由該檢測結果推定基因側多態性。但是，基因側的核苷酸與互補序列一側的核苷酸并不一定完全是互補的關系，因此更優選直接檢測基因側多態性。存在于BRCAl相關蛋白(BRAP)2基因中的基因多態性的優選具體例子有(i)SEQIDNO=I所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸的A/G多態性(NCBISNPDatabase中的登記號為rs3782886)；(ii)SEQIDNO2所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性(NCBISNPDatabase中的登記號為rsll066001)；或(iii)與上述(i)或(ii)所述的多態性的連鎖不平衡的指標r2為0.8以上(優選為0.9以上)的連鎖不平衡狀態的多態性。需要說明的是，SEQIDNO=I中第90號的核苷酸r表示為A或G的任意一種。SEQIDNO2中第270號的核苷酸r表示為A或G的任意一種。與上述(i)或(ii)所述的多態性的連鎖不平衡的指標r2為0.8以上(優選為0.9以上)的連鎖不平衡狀態的多態性可以是BRCAl相關蛋白(BRAP)基因內的該多態性、以及FLJ30092基因內的該多態性，還可以是上述2種基因以外的基因內的該多態性。其中FLJ30092基因是AF-I特異性蛋白質磷酸酶基因。與上述(i)或(ii)所述的多態性的連鎖不平衡的指標r2為0.8以上(優選為0.9以上)的連鎖不平衡狀態的多態性的具體例子有FLJ30092基因內的SNP(NCBISNPDatabase中的登記號為is2074356)、醛脫氫酶2家族(ALDH2)基因內的2個SNP(NCBISNPDatabase中的登記號為rs671和rs4646776)等。例如，如后述的表4所示，SEQIDNO1所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸為A時，則可以判定炎癥性疾病不發病、或者發病的可能性低。與此相對，SEQIDNO=I所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸為G時，則可以判定炎癥性疾病發病、或發病的可能性高。本發明中，可以使用與上述⑴或(ii)所述的多態性的連鎖不平衡的指標Δ2為0.8以上(優選為0.9以上)的連鎖不平衡狀態的多態性。假設有2個連鎖的基因座。假設都存在兩個等位基因(如SNP的兩個等位基因座雙等位基因座)，第一基因座的等位基因稱為1，2、第二基因座的等位基因稱為1，2(當然第一基因座和第二基因座的等位基因1是不同的)。如果第一基因座和第二基因座沒有連鎖不平衡，則染色體具有第一基因座1，2的其中一個、還是第二基因座1，2的其中一個，這有四個單元型。各自單元型的頻率如下。[表1]單元型頻率單元型(笫一基因座-第二基因座)頻率~Πρ1-2ρ122-1p212-2p22這種情況下，各基因座的等位基因1，2的頻率如下。[表2]等位基因頻率“·”不是乘積的符號，而是點。“pi·”是一個變數。如果沒有連鎖不平衡，則1-1的單元型的頻率是第一基因座、第二基因座的等位基因1的頻率的界值(関)。即沒有連鎖不平衡，則pll=pi·ρ·1但是如果有連鎖不平衡，則上式不成立。如下式所示，用D表示其偏離程度，則D=pll-pl·ρ·1這樣，四個單元型的頻率可以使用等位基因的頻率和D，如下表示。[表3]連鎖不平衡存在下的單元型頻率等位基因頻率將D稱為連鎖不平衡系數。D也可如下表示。D=pllp22-pl2p21沒有連鎖不平衡時，D=0，D>0時，稱為正的連鎖不平衡。以r作為重組比例，則D是每個世代以r的比例減少。S卩，以某一世代的連鎖不平衡系數為D，則η世代后的連鎖不平衡系數Dn為Dn=(l-r)nD實際上都希望所有的單元型頻率與等位基因頻率取0和1之間的值，因此D的范圍如下限定。S卩，D>0或D=O時，D的可取的最大值是Dmax=min(pi·ρ·2，ρ2·ρ·1)D<0時，D的可取的最小值是Dmin=max(_pl·ρ·1，_ρ2·ρ·2)因此如下所述，將連鎖不平衡系數用標準化的以下的值表示。D，=D/Dmax(D為正時)D，=D/Dmin(D為負時)[也有論文稱D<0時，D，=_D/Dmin]上述定義時，D’一定為正或0。[但是，[]內則為D<0]除D或D’以外，還可使用以下的P。P2等于x2/n，常常用Δ2表示。Δ2=ρ2=D2/(pi·ρ2·ρ·Ip·2)8包括這些都是常用的連鎖不平衡的指標t上述Δ2(或ρ2)與連鎖不平衡的指標r2同含義。上述多態性中，對于其中的等位基因頻率，任意的患者群比任意的非罹患者群中都顯著高，這可用作本發明的診斷方法。患者群與非罹患者群只要分別是含有可以產生統計學上可靠的結果的足夠數量的群即可，其大小(樣品數)、各樣品的背景(例如籍貫、年齡、性別、疾病等)等沒有特別限定。本說明書中，疾病的“判定”是指判斷是否有疾病發病、判斷疾病發病的可能性(罹患危險性的預想)、疾病的遺傳因素的研究等。疾病的“判定”可以將上述單核苷酸多態性的檢測方法的結果與根據需要的其它的多態性分析(VNTR或RFLP)和/或其它的檢查結果結合進行。本說明書中，“炎癥性疾病”只要是可確認誘導了已知與炎癥性病態相關的細胞粘著因子或細胞因子的疾病即可，沒有特別限定，例如有慢性類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、炎癥性腸炎、各種變態反應、細菌性休克、心肌梗塞或腦卒中等動脈硬化性疾病等，特別是心肌梗塞。(檢測對象)基因多態性的檢測對象優選基因組DNA，還可以根據情況(即多態性位點及其相鄰區域的序列與基因組相同或完全互補時)使用cDNA或mRNA。采集上述對象的試樣可以是任意的生物學試樣，例如有血液、髓液、精液、腹腔液、尿等體液；肝臟等組織細胞；毛發等體毛等。基因組DNA等可按照常規方法由這些試樣中提取、純化，進行制備。(擴增)檢測基因多態性時，首先擴增含有基因多態性的部分。擴增例如通過PCR法進行，也可以按照其它公知的擴增方法、例如NASBA法、LCR法、SDA法、LAMP法等進行。關于引物的選擇，例如是可以擴增SEQIDNO:1或SEQIDNO2所示的序列中含有上述單核苷酸多態性位點的連續的至少10個核苷酸以上、優選10100個核苷酸、更優選1050個核苷酸的序列和/或其互補序列的引物。引物只要是為了擴增含有上述單核苷酸多態性位點的規定核苷酸數的序列而發揮引物的功能即可，其序列中可以含有1或多個取代、缺失、添加。用于擴增的引物可以選擇正向引物或反向引物的其中一方與單核苷酸多態性位點雜交，這樣可以只在試樣有一對等位基因型時擴增。引物可根據需要用熒光物質或放射性物質等標記。(基因多態性的檢測)基因多態性的檢測可通過與一對等位基因型特異性的探針雜交來進行。探針可以根據需要用熒光物質或放射性物質等適當的手段進行標記。探針只要是含有上述單核苷酸多態性位點、與被檢試樣雜交、具有在所采用的檢測條件下可檢測的程度的特異性即可，沒有特別限定。探針可以使用寡核苷酸，該寡核苷酸可以與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的序列中含有上述單核苷酸多態性位點的連續的10個核苷酸以上、優選10100個核苷酸的序列、更優選1050個核苷酸的序列或它們的互補序列進行雜交。還優選選擇單核苷酸多態性位點幾乎存在于探針的中心部的寡核苷酸。該寡核苷酸只要可發揮探針的功能，即、在與目標等位基因型的序列雜交、但與其它等位基因型的序列不雜交的條件下進行雜交即可，其序列中可以含有1或多個取代、缺失、添加。探針包含象RCA(滾環擴增)法擴增中使用的單鏈探針(掛鎖探針)那樣，與基因組DNA退火、通過形成環狀來滿足上述探針的條件的探針。本發明中使用的雜交條件是足以區分等位基因型的條件。例如，試樣為一個等位基因型時可雜交、而為其它等位基因型時則不雜交的條件，例如嚴格的條件。這里，“嚴格的條件”例如有分子克隆實驗室手冊第2版(Sambrook等人.，1989)所記載的條件等。具體例如有在含有6XSSC(IXSSC的組成0.15MNaCUO.015M檸檬酸鈉，ρΗ7.0)、0·5%SDS,5Xdenhardt和100mg/ml鯡魚精子DNA的溶液中與探針一起在65°C下保溫過夜的條件等。探針可以將其一端固定在基板上，作為DNA芯片使用。此時，DNA芯片中可以只固定與一個等位基因型對應的探針，也可以固定與兩個等位型基因型對應的探針。基因多態性的檢測可通過限制酶切片段長度多態性分析法(RFLPRestrictionfragmentlengthpolymorphism)進行。該方法中，用限制酶來消化試樣核酸，根據單核苷酸多態性是哪一種基因型，其可能或未被限制酶切割，通過研究消化物的片段的尺寸來研究試樣核酸是否被該限制酶切割，由此分析試樣的多態性。基因多態性的檢測可以通過直接測序確定擴增產物來進行(直接測序法)。序列的確定例如可通過雙脫氧法、Maxam-Gilbert法等公知的方法來進行。基因多態性的檢測還可以采用變性梯度凝膠電泳法(DGCEdenaturinggradientgelelectrophoresis)、單鏈構象多態個生分析(SSCP:singlestrandconformationpolymorphism)、等位基因特異性PCR(allele_specificPCR)、ASO(allelespecificoligonucleotide，等位基因特異性寡核苷酸)的雜交法、錯配位點的化學切割(CCMchemicalcleavageofmismatches,化學裂角軍錯配)、HET(heteroduplexmethod,異源雙鏈法)法、PEX(primerextension，引物延伸)法、RCA(rollingcircleamplification，滾環擴增)法等。[2]炎癥性疾病診斷用試劑盒作為上述引物和探針的寡核苷酸可以以含有該寡核苷酸的炎癥疾病診斷用試劑盒的形式提供，該試劑盒可以含有在上述基因多態性分析法中使用的限制酶、聚合酶、核苷三磷酸、標記物、緩沖液等。[3]BRCA1相關蛋白(BRAP)的表達狀態的分析方法根據本發明，通過檢測上述單核苷酸多態性，可以分析BRCAl相關蛋白(BRAP)的10表達狀態。例如在SEQIDNO2所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸為G時(BRAP內含子3270G)，可以判斷BRAP的表達量高。與此相對，SEQIDNO2所示的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸為A時(BRAP內含子3270A)，可以判斷BRAP的表達量低。[4]炎癥性疾病的治療藥物的篩選方法根據本發明，通過在候選物質存在下分析細胞內BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的表達量、選擇抑制該表達量的物質，可以篩選炎癥性疾病的治療藥物。例如分析在候選物質存在下細胞內BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的表達量，可以選擇使該表達量減少的物質。上述篩選的一個例子可通過以下步驟進行使細胞與候選物質接觸的步驟；分析細胞內BRCAl相關蛋白(BRAP)基因的表達量的步驟；以及與候選物質非存在下的條件比較，選擇使該基因的表達量變化的候選物質作為炎癥性疾病的治療藥物的步驟。候選物質可以使用任意的物質。對候選物質的種類沒有特別限定，可以是各個低分子合成化合物，也可以是存在于天然產物提取物中的化合物，或者還可以是化合物文庫、噬菌體展示文庫、組合文庫。候選物質為低分子化合物，優選為低分子化合物的化合物文庫。化合物文庫的構建是本領域技術人員公知的，還可以使用市售的化合物文庫。[5]BRCA1相關蛋白(BRAP)的轉錄活性的測定方法根據本發明，還可以將上述含有單核苷酸多態性的BRCAl相關蛋白(BRAP)基因片段導入細胞、培養該細胞，通過分析該基因的表達來測定BRCAl相關蛋白(BRAP)的轉錄活性。根據本發明的優選方案，在上述BRCAl相關蛋白(BRAP)基因片段的下游結合報道基因，得到轉錄單元，將其導入細胞，培養該細胞，通過測定報道活性來分析該基因的表達。例如單核苷酸多態性存在于啟動子位點時，在含有該單核苷酸多態性的基因的下游插入報道基因，培養導入了該體系的細胞，測定報道活性，則可以測定單核苷酸多態性導致的轉錄效率的差異。這里，報道基因使用螢光素酶、氯霉素、乙酰轉移酶、半乳糖苷酶等的基因。[6]抑制或促進BRCAl相關蛋白(BRAP)的轉錄活性的物質的篩選方法本發明中，將上述含有單核苷酸多態性的BRCAl相關蛋白(BRAP)的基因片段導入細胞，在抑制或促進BRCAl相關蛋白(BRAP)的轉錄活性的候選物質的存在下培養該細胞，通過分析該基因的表達，可以篩選抑制或促進BRCAl相關蛋白(BRAP)的轉錄活性的物質。根據本發明的優選方案，在上述BRCAl相關蛋白(BRAP)基因片段的下游結合報道基因，將所得轉錄單元導入細胞，培養該細胞，通過測定報道活性來分析該基因的表達。例如，在具有可見BRCAl相關蛋白(BRAP)表達量顯著高的單核苷酸多態性(例如BRAP內含子3270G)的基因的下游插入報道基因，將導入了該體系的細胞在候選物質的存在下或非存在下的兩種情況下進行培養，在候選物質存在下進行培養時，如果報道活性降低，則該候選物質可作為抑制BRCAl相關蛋白(BRAP)轉錄活性的物質被選擇。這里，報道基因可以使用上述例舉的基因。候選物質可以使用任意的物質。對候選物質的種類沒有特別限定，可以是各個低分子合成化合物，也可以是存在于天然產物提取物中的化合物，或者還可以是化合物文庫、噬菌體展示文庫、組合文庫。候選物質為低分子化合物，優選為低分子化合物的化合物文庫。化合物文庫的構建是本領域技術人員公知的，還可以使用市售的化合物文庫。由上述篩選方法得到的抑制或促進BRCAl相關蛋白(BRAP)轉錄活性的物質也在本發明的范圍內。上述抑制BRCAl相關蛋白(BRAP)轉錄活性的物質可用作心肌梗塞治療藥物、抗炎癥藥、免疫抑制劑等各種藥物的候選物質。[7]BRCA1相關蛋白(BRAP)的轉錄控制因子的篩選方法本發明中，還可以使上述含有單核苷酸多態性的基因片段與預想可能存在BRCAl相關蛋白(BRAP)的轉錄控制因子的試樣接觸，通過檢測上述片段與轉錄控制因子結合，來篩選BRCAl相關蛋白(BRAP)的轉錄控制因子。上述含有單核苷酸多態性的基因片段與預想可能存在BRCAl相關蛋白(BRAP)的轉錄控制因子的物質結合的檢測可通過凝膠移位法(電泳遷移率變動分析electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)>DNaseI足跡法等進行，優選凝膠移位法。凝膠移位法中，如果結合有蛋白質(轉錄控制因子)，則分子尺寸增大，電泳中DNA的遷移率降低，因此可以將用32P標記的基因片段與轉錄控制因子混合進行凝膠電泳。通過放射自顯影觀察DNA的位置，則有因子結合的DNA緩慢移動，因此可檢測出比平常的條帶緩慢移動的條帶。[8]BRCA1相關蛋白(BRAP)的抑制劑、修飾劑的篩選方法本發明中，分析候選物質的存在下BRCAl相關蛋白(BRAP)的功能，通過選擇抑制或修飾其機能的物質，可以篩選BRCAl相關蛋白的抑制劑、修飾劑。BRAP的功能可例舉與半乳凝素-2結合的功能、或者使NFkB的活性保持或提高的功能等，但并不限于此。因此，例如在候選物質的存在下或非存在下，分析BRCAl相關蛋白(BRAP)與半乳凝素_2的結合狀態，可以選擇抑制上述結合的物質作為BRCAl相關蛋白(BRAP)的抑制劑。或者在候選物質的存在下或非存在下，測定表達BRCAl相關蛋白(BRAP)的細胞、組織、器官或個體的NFkB的活性，可以選擇使NFkB活性降低的物質作為BRCAl相關蛋白的抑制劑。通過以下實施例進一步具體地說明本發明，但本發明并不受實施例的限定。實施例以下通過實施例進一步詳細地說明本發明。[實施例1]與半乳凝素-2結合的蛋白質-BRCAl相關蛋白(BRAP)的鑒定使用由HeLa細胞提取的蛋白質，通過串聯親和純化篩選與心肌梗塞易感基因產物半乳凝素_2結合的新型蛋白質。具體而言，串聯親和純化操作是以Rigaut等人所述的方法(Rigaut，G.等人.Agenericproteinpurificationmethodforproteincomplexcharacterizationandproteomeexploration.NatureBiotechnol.17，10301032(1999))為基本，對該方法加以一些修正來實施。在pCMV-Myc載體(〉^、)中，構建編碼TEV切割位點、S標記和His標記的融合表達盒作為TAP標記序列。構建的TAP載體在巨細胞病毒啟動子的控制下、在哺乳動物細胞內與C末端TAP標記一起表達N末端Myc標記的靶蛋白。在150mm皿內使用Fugene(口工)，將半乳凝素-2TAP載體或作為負對照的TAP載體瞬時轉染HeLa細胞(t-一7>^^研究資源K>夕；自JCRB9004獲得)。使用每20ml中含有1個完全蛋白酶抑制片(Completeproteaseinhibitortablet)(口*Λ)以及5μg/mlMG_132(力卟匕.才夂的蛋白質提取試劑”O”)，在冰上溶解轉染的細胞，使用S-蛋白結合/洗滌緩沖液()”夕工>)稀釋為10倍。將提取物在4°C下用S-蛋白瓊脂糖()^夕工>)溫育1218小時。將瓊脂糖用S-蛋白質結合/洗滌緩沖液洗滌3次，再用TEV蛋白酶分解緩沖液(含有150mMNaCl,0.1%ΝΡ_40、0·5mMEDTA禾口ImMDTT的IOmMTris,ρΗ8·0)洗滌，使用100單位的TEV蛋白酶(4>Ε卜π夕工>)在17°C下溫育2小時，洗脫結合的TAP-標記蛋白質。洗脫的蛋白質用磷酸鹽緩沖液透析，進一步用TALON親和純化系統(”口>歹夕)純化。將這些蛋白質復合物用SDS-PAGE和SimplyBlue(4>'卜α夕工>)洗脫、濃縮、并分析。將蛋白質結合物用7卜々一卜的MALDI/T0F質譜儀進行分析。分析的結果，作為與半乳凝素_2結合的蛋白，是BRCAl相關蛋白(BRAP)(參照圖la)ο[實施例2]BRAP基因內單核苷酸多態性與心肌梗塞的相關性已經了解了半乳凝素-2與BRAP結合，顯示了BRAP的基因產物的功能變化可能與心肌梗塞易感性相關，因此使用BRAP基因內的單核苷酸多態性(SNPs)，對患者(3362人)、對照(3823人)按照國際公開W02004/015100號公報所述的方法進行病例-對照關聯研究。即，SNP的分型通過侵入者分析(Invaderassay)進行、通過卡方檢驗進行分析。結果，BRAP基因內的外顯子5第90號A>G的SNP(NCBISNPDatabase中的登記號為rs3782886)的minorhomozygote(GG等位基因)在心肌梗塞患者中顯著多(表4)。由此顯示了BRAP基因內的外顯子5第90號A>G的SNP與心肌梗塞相關的可能性。該SNP(NCBISNPDatabase中的登記號為rs3782886)與該基因的內含子3270A/GSNP(NCBISNPDatabase中的登記號為rsll066001)、以及在染色體上接近的基因醛脫氫酶2家族(ALDH2)基因內的2個SNP(NCBISNPDatabase中的登記號為rs671和rs4646776)、FLJ30092基因內的一個SNP(NCBISNPDatabase中的登記號為rs2074356)存在強的連鎖不平衡的關系，這可通過HapMap數據庫(http//hapmap.org/)確認。還可見ALDH2基因內的SNP(NCBISNPDatabase中的登記號為rs671)和FLJ30092基因內的SNP(NCBISNPDatabase中的登記號為rs2074356)與心肌梗塞有較強的相關性。[表4]在心肌梗塞的12q24基因組區的SNPs的關聯性t3TO1596細3滅24t.O47.511SXUISte3823m.WJ7,6鄉42,74δ,510,i講7150挪膽SOM6,71S87爾mtm46.944.58.6tmIW2243823S7.438,7S.S基因型統計*；優勢比，**；可信區間[實施例3]對半乳凝素-2與BRAP在C0S7共強制表達體系中的結合的確認在動物細胞內構建表達Myc標記的半乳凝素_2和S-標記的BRAP的載體，在C0S7細胞(猴腎細胞株)中共強制表達，通過用特異性抗體免疫沉降來確認有否與各表達蛋白纟口口。為了在哺乳動物細胞中共免疫沉降，使用Fugene將Myc標記的半乳凝素_2和S-標記的BRAP的表達質粒瞬時轉染C0S7細胞(t-一7研究資源K>夕；自JCRB9127獲得)。在每40ml中含有1個完全蛋白酶抑制片EDTA(口*Λ)以及5μg/mlMG-132(力卟匕·才夕A)的溶解緩沖液(含有150mMNaCl,0.2%NP-40的20mMTris,ρΗ7·5)內實施免疫沉降。轉染24小時后，使用S-蛋白(^K7->)或Myc瓊脂糖(寸>夕·々X)在4°C下對轉染的C0S7細胞進行2小時的處理。將免疫沉降物用溶解緩沖液洗滌3次。使用由S-蛋白(7”'Π或抗Myc過氧化物酶共軛物(寸>夕夕>^)復合而成的辣根過氧化物酶，使免疫混合物可見。使用與BRAP的S標記特異性結合的S-蛋白或與Myc-半乳凝素_2特異性結合的抗myc抗體進行免疫沉降時，半乳凝素-2或BRAP分別同時沉降(參照圖lb)。這表示具有半乳凝素_2與BRAP直接且特異性結合的可能性。[實施例4]BRAP與半乳凝素_2在血管平滑肌細胞中的共同存在將半乳凝素-2特異性抗體用熒光素標記，以及將BRAP特異性抗體用羅丹明標記，免疫染色冠狀動脈血管平滑肌細胞，通過共焦激光顯微鏡觀察半乳凝素_2和BRAP的表達。使用在大腸桿菌中合成的重組蛋白，在兔中制備多克隆抗人半乳凝素-2和BRAP免疫血清。使用EZ標記蛋白質標記試劑盒(I^7—7)，分別用熒光素和羅丹明標記多克隆抗半乳凝素-2免疫血清以及BRAP。培養人冠狀動脈平滑肌細胞(HCASMC，力>Oν”^)并固定。然后與在含有3%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液溶液內標記的抗體一起培養該HCASMC。將檢樣用OLYMPUSFLU0VIEW共焦激光掃描顯微鏡(奧林匹斯)觀察。結果可觀察到半乳凝素-2與BRAP在細胞質和核中共同存在(參照圖Ic)。[實施例5]冠狀動脈血管平滑肌細胞中的BRAP內含子3SNP的螢光素酶測定構建在pGL3基本載體(螢光素酶)中插入BRAP啟動子區(BRAP啟動子-螢光素因基型位性性因等顯隱基因基型位)±性因等顯隱基因基塑位lifct因等務隞基酶)得到的載體。進一步在該載體中分別插入含有1次或3次SNP的A等位基因或G等位基因的寡核苷酸，將該構建物轉染血管平滑肌細胞，進行螢光素酶活性測定。為了構建BRAP啟動子-pGL3基本載體(BRAP啟動子-螢光素酶)，通過使用基因組DNA作為模板的PCR，擴增由5’一側非編碼區第21號核苷酸至啟動子區-991號所對應的DNA片段。將擴增的PCR產物在pGL3-基本載體(口^力‘)的kpnl和SacI限制酶切位點上沿5’-3’方向克隆。為了構建含有BRAP啟動子-SNP-螢光素酶的載體，在BRAP螢光素酶的載體構建物的MluI和XhoI限制酶切位點上克隆1或3次重復的雙鏈寡核苷酸(內含子3的264278號)，構建載體。在HCASMC生長培養基、《千K研)中培養HCASMC。然后使用Nucleofector系統(77夕寸)，將1μg載體構建物以及0.1μgpRL-TK載體(轉染效率的內部控制)轉染細胞。24小時后回收細胞，使用雙螢光素酶報道分析系統(口>#)測定螢光素酶活性。結果，G等位基因與A等位基因比較，可觀察到較強的螢光素酶活性，這顯示在具有G等位基因的個體中，BRAP的表達比A等位基因高(參照圖2a)。[實施例6]使用冠狀動脈血管平滑肌細胞核提取液、通過BRAP內含子3SNP區序列寡核苷酸進行凝膠移位分析按照已報道的方法，將由HCASMC制備的核酸提取物在牛血清白蛋白的存在下、以及與使用DIG凝膠移位試劑盒(π〉-)、用地高辛(DIG)-ll-ddUTP標記的16個的寡核苷酸(BRAP的內含子3的264276)的6個串聯拷貝一起進行溫育。在室溫下不使用Poly[I(dc)]試劑進行反應。比較實驗是在DIG標記的寡核苷酸添加之前用核酸提取物預溫育非標記的寡核苷酸(過量125倍)。使用非改性6%聚丙烯酰胺凝膠將蛋白質/DNA復合物在0.5倍Tris/硼酸/EDTA(TBE)緩沖液內進行分離，然后轉移至硝基纖維素膜上。按照制備者的指示用化學熒光檢測系統(口〉Λ)檢測信號。結果可以確認存在與A等位基因強烈結合的未知因子(參照圖2b)。[實施例7]冠狀動脈血管內皮細胞中敲除BRAP和ALDH2的mRNA時的NFkB活性的變化使用BRAP和ALDH2的各2種siRNA敲除BRAP和ALDH2，將在NFkB特異性的E-選擇啟動子序列上結合有螢光素酶的載體(NFkB可以間接地用螢光素酶測定活性)轉染，測定螢光素酶活性。為了敲除BRAP和ALDH2的mRNA，使用了合成StealthTMRNAi寡核苷酸雙鏈(BRAP是使用BRAP-HSS112138和BRAP-112139，ALDH2是使用ALDH2-HSS100369和ALDH2-HSS100370)。使用StealthRNAi負對照含高GC的雙鏈(4>'卜口夕工>)作為陰性對照。在HCACE生長培養基中培養HCACE。將各StealthRNAi轉染細胞。24小時后，將各StealthRNAi、pNiFty質粒載體以及通過Nucleofector系統(77夕寸)結合有NFkB特異性E-選擇性啟動子(4>e#7工>)的螢光素酶報道基因共轉染細胞。24小時后回收細胞，并通過雙螢光素酶報道分析系統測定螢光素酶活性。使用SYBRGreen和ABI7700測序儀對mRNA進行定量。通過敲除BRAP，NFkB的活性降低，而敲除ALDH2則相反，NFkB的活性升高(參照圖2c)。產業實用性15通過利用本發明中鑒定的SNP，可以提供心肌梗塞等炎癥性疾病的診斷方法或炎癥性疾病的治療藥物的開發方法。權利要求炎癥性疾病的判定方法，該方法包含檢測存在于BRCA1相關蛋白基因中的至少一種基因多態性，其中上述BRCA1相關蛋白簡稱BRAP。2.炎癥性疾病的判定方法，該方法包含檢測存在于BRCAl相關蛋白基因中的至少一種單核苷酸多態性，其中上述BRCAl相關蛋白簡稱BRAP。3.炎癥性疾病的判定方法，該方法包含檢測以下任意一種多態性(i)SEQIDNO1所示的BRCAl相關蛋白基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸的A/G多態性，該多態性在NCBISNPDatabase中的登記號為3782886；(ii)SEQIDNO:2所示的BRCAl相關蛋白基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性，該多態性在NCBISNPDatabase中的登記號為rsl1066001；或(iii)與上述⑴或(ii)所述的多態性的連鎖不平衡的指標r2為0.8以上的連鎖不平衡狀態的多態性，其中上述BRCAl相關蛋白簡稱BRAP。4.權利要求13中任一項所述的方法，其中，炎癥性疾病是心肌梗塞。5.寡核苷酸，該寡核苷酸可以與連續的至少10個核苷酸序列或其互補序列雜交，在權利要求14中任一項所述的方法中作為探針使用，其中，上述連續的至少10個核苷酸序列或其互補序列含有SEQIDNO1所示的BRCAl相關蛋白基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸的A/G多態性、或SEQIDNO:2所示的BRCAl相關蛋白基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性，其中上述BRCAl相關蛋白簡稱BRAP。6.寡核苷酸，該寡核苷酸可以擴增連續的至少10個核苷酸序列和/或其互補序列，在權利要求14中任一項所述的方法中作為引物使用，其中，上述連續的至少10個核苷酸序列和/或其互補序列含有SEQIDNO:1所示的BRCAl相關蛋白基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸的A/G多態性、或SEQIDNO:2所示的BRCAl相關蛋白基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性，其中上述BRCAl相關蛋白簡稱BRAP。7.權利要求6所述的寡核苷酸，其中，引物是正向引物和/或反向引物。8.炎癥性疾病診斷用試劑盒，該試劑盒含有權利要求57中任一項所述的寡核苷酸的1種以上。9.權利要求8所述的試劑盒，其中，炎癥性疾病是心肌梗塞。10.BRCAl相關蛋白的表達狀態的分析方法，該方法包含檢測SEQIDN0:1所示的BRCAl相關蛋白基因的外顯子5的核苷酸序列中第90號核苷酸的A/G多態性、或SEQIDNO2所示的BRCAl相關蛋白基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性，其中上述BRCAl相關蛋白簡稱BRAP。11.炎癥性疾病的治療藥物的篩選方法，該方法包含以下步驟在候選物質的存在下，分析細胞內的BRCAl相關蛋白的表達量或BRCAl相關蛋白的功能，選擇抑制該表達量的物質、或者抑制或修飾該功能的物質，其中上述BRCAl相關蛋白簡稱BRAP。12.BRAP的轉錄活性的測定方法，該方法包含將BRAP基因片段導入細胞中，培養該細胞，分析該基因的表達，其中，所述BRAP基因片段含有SEQIDNO2所示的BRCAl相關蛋白基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性，其中上述BRCAl相關蛋白簡稱BRAP。13.抑制或促進BRAP的轉錄活性的物質的篩選方法，該方法包含將BRAP基因片段導入細胞中，在抑制或促進BRAP轉錄活性的候選物質的存在下培養該細胞，分析該基因的表達，其中，所述BRAP基因片段含有SEQIDNO:2所示的BRCAl相關蛋白基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性，其中上述BRCAl相關蛋白簡稱BRAP。14.BRAP的轉錄控制因子的篩選方法，該方法包含使BRAP基因片段與預想存在BRAP的轉錄控制因子的試樣接觸，檢測上述片段與轉錄控制因子的結合，其中，所述BRAP基因片段含有SEQIDNO:2所示的BRCAl相關蛋白基因的內含子3的核苷酸序列中第270號核苷酸的A/G多態性，其中上述BRCAl相關蛋白簡稱BRAP。全文摘要本發明的目的是鑒定與心肌梗塞等炎癥性疾病的發病進展相關的新型單核苷酸多態性(SNP)。根據本發明，可以提供炎癥性疾病的判定方法，該方法包含檢測存在于BRCA1相關蛋白(BRAP)基因中的至少一種基因多態性。文檔編號C12N15/09GK101918552SQ20088012401公開日2010年12月15日申請日期2008年10月29日優先權日2007年10月29日發明者中村祐輔,尾崎浩一,田中敏博申請人:獨立行政法人理化學研究所