專利名稱：哺乳動物體細胞用培養基以及該培養基的添加劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及體外培養哺乳動物的體細胞時所使用的培養基以及用于構成該培養 基的添加劑。
背景技術：
體細胞是可在細胞治療或再生醫療中應用的重要的細胞，所述體細胞含有包括人 在內的哺乳類的具有多分化能力的細胞和這些細胞所分化的細胞。培養這些細胞使其增 殖，這從細胞治療用的細胞生產性或促進這些醫療研究的進展方面考慮非常重要。已知體細胞通常是在添加10%左右的血清的血清培養基中增殖。作為血清，通常 使用由作為上述所欲培養的體細胞所來源的來自個體的血液(例如采集了要培養的體細 胞的患者的血液)得到的、來自自身的血清，或牛血清等來自其它種的血清。但是，使用來自自身的血清時，必須較大量地使用患者的血液，因此患者的負擔增 大。而使用來自其它種的血清時，存在可能混入未知的病毒或朊病毒等感染性病原體的問 題。任何血清的成分都尚未完全了解，根據所使用的血清的起源或市售產品批次的不 同，其含有成分可能不同，因此在大量使用血清進行培養時，難以使所得培養細胞的品質一定。因此，人們希望能夠在不使用血清或者是盡可能地抑制其使用量的培養基中使體 細胞增殖。日本特表平11-506610號(專利文獻1)中公開了含有最小必需培養基、血清白蛋 白、鐵源、胰島素以及谷氨酰胺的人間葉系細胞用的無血清培養基。并記載該無血清培養基 中可以加入具有人間葉系細胞核有絲分裂促進活性的血清素。但是，在加入了血清素的無 血清培養基中培養間葉系干細胞后，有增殖較為緩慢、短時間內細胞特性變化、增殖性降低 的問題。日本特表號(專利文獻2)中公開了含有溶血磷脂受體、即，內皮細 胞分化基因(Edg)家族受體的配體，例如溶血磷脂酸(LPA)、1-磷酸鞘氨醇(SlP)等的、用 于調節人胚胎干細胞(ES)分化的無血清培養基。已知LPA具有抑制脂肪前體細胞向脂肪 細胞分化的效果(J. Biol. Chem. Vol. 280，15，14656-14662 (2005)；非專利文獻1)。還已知 LPA 具有細胞增殖促進效果(Sci.STKE，Vol.2005，Issue 292，pe35 頁，12 July 2005 ；非 專利文獻 2 ;American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. Vol. 34, 274-285頁，2006;非專利文獻3)，但細胞增殖促進效果是在含血清培養基中確認的，在無 血清培養基或者是在以下的低血清培養基中細胞增殖促進效果尚未得知。W02007/080919(專利文獻3)中記載了來自人骨髓的間葉系干細胞的無血清培養 基，并記載作為培養條件，除ITS添加物(含胰島素、運鐵蛋白、硒等的添加物)之外，堿性 成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子(TGF-β)、血小板源性 生長因子(PDGF)是必須的，但是如果要添加的生長因子為3種以下，則有增殖性降低的問題。對于包括人在內的哺乳類的具有多分化能力的細胞增殖，已知細胞因子或生長因 子對其產生影響。例如有血小板源性生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、 表皮細胞生長因子(EGF)等(Folia Histochemica Et Cytobiological Vol. 44，No. 4， 215-230 頁，2006 ；非專利文獻 6 J Cell Biochem. Vol. 64，2，278-94 頁，1997 ；非專利文獻 7)。在體外培養包括人的哺乳類的體細胞時，已知N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)具有通 過抑制程序性細胞死亡來減少細胞死亡的效果(Molecular Human Reproduction Vol. 8， No3. 3，228-236 頁，2002 ；非專利文獻 8 ;J Leukoc Biol. Vol. 76, No. 1，152-61 頁，2004 ；非 專利文獻9)。專利文獻1 日本特表平11-506610號公報專利文獻2 日本特表號公報專利文獻3 :W02007/080919非專利文獻1 J. Biol. Chem. Vol. 280,15,14656-14662 (2005)非專利文獻2 :Sci. STKE, Vol. 2005，Issue 292，p. pe35,12 July2005非專利文獻3 American Journal of Respiratory Cell and MolecularBiology. Vol. 34,274-285 頁，2006非專利文獻4 :Science. Vol. 294，1875-1878 頁，2001非專利文獻5:J Biol Chem. Vol. 277，No. 29,25851-25854 頁，2002非專利文獻6:Folia Histochemica Et Cytobiological Vol. 44, No. 4，215-230 頁，2006非專利文獻7 :J Cell Biochem. Vol. 64，2，278-94 頁，1997非專利文獻 8 =Molecular Human Reproduction Vol. 8，Νο3· 3，228—236 頁，2002非專利文獻9 :J Leukoc Biol. Vol. 76，No. 1，152-61 頁，200
發明內容
發明所需解決的課題本發明的課題在于提供哺乳動物體細胞用培養基以及用于構成該培養基的添加 劑，所述培養基在培養哺乳動物的體細胞時，在盡可能地抑制在培養基中添加血清或者是 不添加血清的情況下可以有效地使哺乳動物的體細胞增殖。用于解決課題的方法本發明人進行了深入的研究，結果發現通過在培養基中摻混內皮細胞分化基因 (Edg)家族受體的配體以及血清素受體的配體，即使培養基完全不含有或只含有少量血清， 也可以使哺乳動物的體細胞有效增殖。從而完成了本發明。S卩，本發明提供哺乳動物體細胞用培養基，該培養基含有內皮細胞分化基因(Edg) 家族受體的配體、和血清素受體的配體。本發明還提供哺乳動物體細胞用培養基的添加劑， 該添加劑含有內皮細胞分化基因(Edg)家族受體的配體以及血清素受體的配體。發明的效果本發明的培養基和培養基添加劑可以在不使用以往培養體細胞時添加到培養基中的血清、或者降低其添加量的條件下，有效地使體細胞增殖。因此，可以解決由于使用血 清而產生的問題，即，對患者的負擔、感染性病原體的混入等問題。即使在添加血清的情況 下，也可以抑制由于所添加的血清批次之間的偏差而導致的細胞增殖性的偏差。并且即使 使用人血清作為血清，也可以有效地使體細胞增殖。通過本發明的培養方法，可以抑制血清 的使用量來培養體細胞，因此可以提供穩定品質的培養體細胞。因此，所得培養體細胞是感 染性病原體混入問題被抑制到最小限度的穩定品質的培養體細胞。實施發明的最佳方式本說明書中，“體細胞”是構成多細胞生物的細胞中的增殖細胞以外的細胞，包括 為某種目的進行特化而不會成為除此以外的細胞的分化的細胞，以及具有分化分化為具有 幾種不同功能的細胞的能力的細胞。前者的細胞是成體的功能性細胞，包括皮膚細胞、神 經細胞、肌細胞、血液系細胞、成纖維細胞、肝細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等形成生物體內各 器官的細胞。后者稱為干細胞，是可分化轉換為上述已分化的細胞中至少1種以上的分化 細胞的細胞，包含胚胎干細胞和成體干細胞。“成體干細胞”是具有分化為具有幾種不同功 能的細胞的能力的干細胞和前體細胞中除了胚胎干細胞以外的細胞，包含誘導多功能干細 胞、造血干細胞、間葉系干細胞、神經干細胞、皮膚干細胞、肝臟干細胞、胰腺干細胞等。作為在本發明的培養基中培養的細胞，只要是哺乳動物的體細胞即可，沒有任何 限定。優選的實例可例舉成纖維細胞等的間葉系細胞、脂肪組織源性干細胞或骨髓源性間 葉系干細胞等的成體干細胞，但并不受其限定。本發明的培養基中含有內皮細胞分化基因(Edg)家族受體的配體作為必須成分。 這里，Edg家族受體是基因序列同源性高的G蛋白偶聯型受體的一組，目前在人、小鼠、綿羊 等哺乳類中鑒定出Edg-I至Edg-8 (非專利文獻4、5)。其中，已知Edg-2、Edg-4和Edg_7發 揮LPA受體功能，Edg-l、Edg-3、Edg-5、Edg-6和Edg-8發揮SlP受體功能。另外，“受體的 配體”是與該受體特異性結合的物質，不只是存在于生物體內的天然的配體，也包含作為激 動劑或拮抗劑已知的天然的或合成的其它化合物。Edg家族受體的配體(以下為了便利，可稱為“Edg配體”)優選選自溶血磷脂酸 LPA及其鹽、1-磷酸鞘氨醇(SlP)以及Edg家族受體的激動劑的一種或多種的化合物。Edg家族受體的激動劑是與Edg家族受體結合、與LPA和SlP同樣作用的物質， 例如有1-磷酸二氫鞘氨醇、血小板活化因子(PAF)、鞘氨醇磷脂酰膽堿、烷基LPA類似物、 FTY720 等。LPA是由下述通式(I)所示的化合物R-O-CH2CH(OH) CH2PO4H2(I)(式中，R是碳原子數10-30的烷基、碳原子數10-30的鏈烯基或碳原子數10_30 的酰基)。上式(I)的R基中，酰基的碳原子數不包含羰基的碳原子數。LPA的鹽可以使用以往公知的鹽，例如有鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽，銨鹽等。LPA或LPA的鹽例如有1_油酰基溶血磷脂酸鈉鹽、LPA鉀鹽。Edg配體可以單獨使用，還可以將兩種以上混合使用。本發明的培養基可以進一步含有血清素受體的配體(為了便利，可稱為“血清素 配體”)。血清素受體是主要位于中樞神經系統的G蛋白結合受體的一種。作為血清素配
6體，優選選自血清素、其鹽以及血清素激動劑的一種或多種化合物。血清素被稱為5-羥色 胺，已知發揮神經遞質的作用。血清素激動劑是已知與血清素受體結合、與血清素同樣作用 的物質，例如有伊沙匹隆、S 口 C >、丁螺環酮、1-[2-(4_氨基苯基)乙基]-4-(3_雙氟甲 基苯基)哌嗪(PADD)、N, N- 二丙基-5-羧酰胺色胺(DP-5CT)、α -甲基-5-羥色胺(HT)、 2-甲基-5-ΗΤ等。血清素的鹽可以使用以往公知的鹽，例如鹽酸鹽等。血清素配體可以單獨使用，也可以將2種以上組合使用。培養基中的Edg配體的濃度(含有多種時，為其總濃度)通常是0.01-100μΜ 左右。Edg配體為選自溶血磷脂酸(LPA)及其鹽的至少一種時，其在培養基中的濃度優 選0.25-10 μ Μ。另外，Edg配體為1-磷酸鞘氨醇(SlP)時，其在培養基中的濃度優選 0.01 μ Μ-0. 2 μ M0另外，培養基中的血清素配體的濃度(含有多種時，為其總濃度)優選 0. 1-100 μ Μ,進一步優選 0. 25-20 μ Μ。本發明的培養基進一步優選含有抗氧化劑。抗氧化劑的優選實例為選自N-乙酰 半胱氨酸(NAC)、L-半胱氨酸、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和2-巰基乙醇的至少一種，進 一步優選選自N-乙酰半胱氨酸和L-半胱氨酸的至少一種。已知這些抗氧化劑具有程序性 細胞死亡抑制作用，因此對于培養細胞的保持、增殖有效。抗氧化劑可以單獨使用，也可以 將兩種以上組合使用。培養基中的抗氧化劑濃度(含有多種時，為其總濃度)優選O.OlmM-lOmM，進一步 優選 0. ImM-ImM0本發明的培養基進一步優選含有動物血清白蛋白。白蛋白是血清的主要成分，已 知在血液中擔負著藥物的傳遞等作用。通過含有動物血清白蛋白，可以進一步促進培養細 胞的增殖。動物血清白蛋白的優選實例有人血清白蛋白(HSA)和基因重組人血清白蛋白 (rHSA)、牛血清白蛋白(BSA)等。這些白蛋白可以單獨使用，也可以將兩種以上組合使用。培養基中的白蛋白的濃度(含有多種時，為其總濃度)優選0.0001-10重量％，進 一步優選0. 0001-1重量％。本發明的培養基優選進一步含有生長因子。通過含有生長因子，可以進一步促進 培養細胞增殖。生長因子的優選實例有表皮生長因子(EGF)、類胰島素生長因子(IGF)、轉 化生長因子(TGF)、神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、血管內皮細胞生長 因子(VEGF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅 細胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、肝細胞生長因子(HGF)等，進一步優選的實例是 血小板源性生長因子(PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)。這 些生長因子本身在該領域都是周知的。生長因子可以單獨使用也可以將兩種以上組合使 用。特別如下述實施例中具體所示，即使只含有血小板源性生長因子(PDGF)和堿性成纖維 細胞生長因子(bFGF)兩種作為生長因子，也可以充分實現間葉系細胞的增殖，因此在間葉 系干細胞培養中使用的培養基中，培養基中所含的生長因子即使只含有這兩種生長因子也 足夠。本發明的培養基可以進一步含有血小板源性生長因子受體(PDGFR)的配體 (PDGF)，特別是在培養間葉系干細胞的培養基中，優選含有它們。PDGFR是主要存在于間葉 系細胞中的酪氨酸激酶關聯型受體的一種，通過含有其配體，可以高效地使間葉系干細胞 的細胞增殖。作為 PDGFR 的配體，可例舉PDGF-AA、PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD
7等，它們均為眾所周知的。PDGFR的配體可以單獨使用，也可以將兩種以上組合使用。本發明的培養基可以含有堿性成纖維細胞生長因子受體(FGFR)的配體(FGF)，特 別優選在培養間葉系干細胞的培養基中含有它們。已知FGFR主要存在于間葉系細胞中， 通過含有對應于它的配體，可以改善間葉系干細胞的壽命。PDGFR的配體已知存在有堿性 成纖維細胞生長因子(bFGF)和酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)等共20種以上。例如有 FGF-l、FGF-4等。特別已知bFGF強烈參與組織的形成。它們均為眾所周知。生長因子的濃度(含有多種時，為其總濃度)優選0. Ι-lOOng/mL，進一步優選 1-lOng/mLo本發明的培養基可以進一步含有表面活性劑。可以認為，通過含有低濃度的表面 活性劑，具有減少對細胞膜的不良影響的效果。已知如果將高濃度的表面活性劑添加到 培養基中，則抑制細胞增殖或誘導細胞死亡。作為表面活性劑，優選聚氧乙烯失水山梨醇 脂肪酸酯(商品名吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80等)、烷基苯氧基聚乙二醇(商品名 TritonX-IOO等)、烷基苯基聚乙二醇(商品名TritonX-114、NP_40等)的非離子性表面活 性劑。表面活性劑可以單獨使用，也可以將2種以上組合使用。表面活性劑的濃度(含有多種時，為其總濃度)通常為0. Ι-lOOng/mL,優選 1-lOng/mLo本發明的培養基可以與常規的哺乳動物細胞用培養基同樣地含有血清，但通過含 有Edg配體和血清素配體兩者，即使是不含有或者是只以低濃度含有血清的培養基也可以 使細胞高效增殖，因此培養基為無血清培養基或低血清培養基時，可以最良好地發揮本發 明的效果。即，相對于培養基總量，本發明的培養基中的血清含量優選0-5重量％，更優選 0-1重量％。本說明書和權利要求的范圍中，將含有血清但其含量為5重量％以下、優選1 重量％的培養基稱為低血清培養基。本發明的培養基除含有上述Edg配體和血清素配體、進一步優選含有上述抗氧化 劑、動物血清白蛋白、生長因子和表面活性劑的一種以上之外，還可以與公知的哺乳動物細 胞用培養基同樣。因此基本上通過在公知的基礎培養基、優選無血清或低血清基礎培養基 中添加上述兩種必須成分、進一步優選一種以上上述優選的成分，可以獲得本發明的培養基。以往共知的無血清基礎培養基有Eagle培養基等的最小必需培養基(MEM)、 Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)、最小必需培養基α (MEM-α )、間葉系細胞基礎培養基 (MSCBM)、Ham，s F-12 和 F-10 培養基、DMEM/F12 培養基、WiIliams 培養基 E、RPMI-1640 培 養基、MCDB培養基、199培養基、Fisher培養基、Iscove改良Dulbecco培養基(IMDM) ,McCoy
改良培養基等。本發明的培養基可以含有周知的在哺乳動物細胞用培養基中含有的各種添加劑。 上述周知的添加劑可例舉氨基酸類、無機鹽類、維生素類和碳源或抗生素等其它的添加 劑。作為氨基酸類，可例舉甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、 L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴 氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和 L-纈氨酸。
作為無機鹽類，可例舉氯化鈣、硫酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、硫酸鎂、 氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鋅和硒酸。作為維生素類，可例舉膽堿、維生素A、維生素Bi、維生素B2、維生素B3、維生素 B4、維生素B5、維生素B6、維生素B7、維生素B12、維生素B13、維生素B15、維生素B17、維生 素Bh、維生素Bt、維生素Bx、維生素C、維生素D、維生素E、維生素F、維生素K、維生素M和 維生素P。將這些添加劑添加到哺乳動物細胞用培養基中，這本身是公知的，各添加劑的添 加量也可以與公知的培養基同樣，還可以通過常規實驗適當設定。例如氨基酸類的添加量 通常是每種氨基酸為5mg/L-500mg/L左右，優選10mg/L-400mg/L左右，無機鹽類的添加量 通常是每種無機鹽類為0mg/L-10g/L左右，優選0.01mg/L-7g/L左右，維生素的添加量是每 種維生素為 0. 01mg/L-500mg/L 左右，優選 0. 05mg/L-300mg/L 左右。作為其它添加劑，可例舉(1)皮質酮、孕酮等的生長因子，(2)青霉素、鏈霉素、慶 大霉素和卡那霉素等抗生素，⑶葡萄糖、半乳糖、果糖和蔗糖等碳源，⑷鎂、鐵、鋅、鈣、 鉀、鈉、銅、硒、鈷、錫、鉬、鎳和硅等微量金屬元素以及腺苷5’ - 一磷酸、皮質酮、乙醇胺、胰 島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、次黃嘌呤、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三碘甲腺原氨 酸、運鐵蛋白、乳鐵蛋白等其它添加劑。這些添加劑的添加量也與以往同樣，還可以根據各 添加劑的目的通過常規實驗適當設定。通常為0. 001mg/L-5g/L,特別為0. l_3g/L左右。本發明的培養基除用于為了體細胞的增殖或保持的培養之外，當培養的細胞為干 細胞時，可以用于干細胞的分化誘導。用于干細胞的分化誘導時，可以進一步添加分化誘導 劑。作為分化誘導劑，可例舉細胞因子(各種白細胞介素、促紅細胞生成素、血小板生成素 等)、集落刺激因子(例如G-CSF等)、類固醇激素(地塞米松等)、吲哚(吲哚美辛)、噻唑 烷衍生物(羅西格列酮等)等。可以使用它們的一種或多種。分化誘導劑的添加量也與以 往同樣，通常相對于培養基的總量可以加入IX 10,至IX 10_6重量％左右。本發明的培養基可以含有上述各種添加劑的一種或多種。通常可以組合含有多種 添加劑。本發明的培養基中的哺乳動物體細胞培養本身可以按照與以往同樣的方法進行， 通常在30-37°C的溫度和5% CO2的環境下以及5-21% O2的環境下進行。本發明還提供用于構成上述本發明的培養基的添加劑。因此，本發明的添加劑含 有上述Edg配體和血清素配體。進一步優選含有上述優選的各種成分。還進一步優選含有 上述各種添加劑的一種或多種。就本發明的添加劑而言，如下添加劑是簡便的，因而優選， 所述添加劑具有通過溶解于水或基礎培養基中而可以形成上述本發明培養基的組成。這種 情況下，添加劑中所含的各種成分的摻混比例與培養基中各成分的含量的比例相同。需說 明的是，作為基礎培養基，可例舉以往在哺乳動物細胞的培養中使用的上述各種培養基。以下根據實施例更具體地說明本發明。本發明并不受這些實施例的限定。如沒有 特別說明，“ %，，是指“重量％ ”，各種添加物的濃度是指在培養基中的終濃度。因此，例如 “加入了 2.5ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的低血清培養基C”是指加入在低血清 培養基C中的終濃度為2. 5ng/mL的bFGF量。實施例1實施例1 來自人脂肪組織的干細胞(hMADS)的培養
(1-1)配體的制備將2. Img的血清素鹽酸鹽(Sigma制備)溶解于IOmL DMEM(L0NZA制備)，制備配體 1 (S-I)，作為血清素配體。將2. 3mg 1-油酰基溶血磷脂酸鈉鹽(LPA =CAYMAN制備)溶解于 IOmL PBS中，制備配體2 (S-2)，作為Edg配體。進一步將2. Img血清素鹽酸鹽和2. 3mgLPA 溶解于IOmL PBS中，制備配體3 (S-3)。(l_2)hMADS 的增殖在含有氨基酸類(上述全部氨基酸類)、無機鹽類(上述全部無機鹽類)、維生素 類(上述的全部維生素類)以及其它添加劑(腺苷5’ - 一磷酸、皮質酮、乙醇胺、D-半乳 糖、D-葡萄糖、胰島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、次黃嘌呤、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、 三碘甲腺原氨酸和運鐵蛋白)的培養基中加入7X10_4% 2-巰基乙醇(2-Me)、100U/mL青 霉素·鏈霉素(GIBG0制備)、0. 5%胎牛血清(FCS)和2. 5ng/mL堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)，得到低血清培養基C。以各種濃度向低血清培養基C中添加(1-1)制備的S-I和/或S-2，得到低血清培 養基。具體是按照以下濃度添加S-I和/或S-2。在培養基C中添加了 0% S-I和0. 2% S-2的低血清培養基(0. 2% S_2)，在培養基C中添加了 0.001% S-I和0.2% S-2的低血清培養基(0.2% S-2， 0. 001% S-1)、在培養基C中添加了 0. 01% S-I和0. 2% S-2的低血清培養基(0. 2% S_2，0. 01%
s-l)、在培養基C中添加了 0. 1% S-I和0. 2% s-2的低血清培養基(0. 2% S-2,0. 1% s-l)、在培養基C中添加了 S-I和0. 2% S-2的低血清培養基(0. 2% S-2,1% S-l)、在培養基C中添加了 10% S-I和0. 2% S-2的低血清培養基(0. 2 % S-2,10%
s-l)、在培養基C中添加了 0. S-I和0% S-2的低血清培養基(0. 1% S_l)、在培養基C中添加了 0. S-I和0.002% S-2的低血清培養基(0. 1 % S-I, 0. 002%S-2)、在培養基C中添加了 0. S-I和0. 02% S-2的低血清培養基(0. 1% S-1,0. 02% S-2)、在培養基C中添加了 0. 1% S-I和0. 2% S-2的低血清培養基(0. 1% S-1,0. 2% S-2)、在培養基C中添加了 0. 1% S-I和0. 5% S-2的低血清培養基(0. 1% S-1,0. 5% S-2)、在培養基C中添加了 0. S-I和S-2的低血清培養基(0. 1% S-1,1% S-2)、在培養基C中添加了 0. S-I和2% S-2的低血清培養基(0. 1% S-1,2% S-2)、在培養基C中添加了 S-I和0% S-2的低血清培養基(1% S_l)、在培養基C中添加了 0% S-I和S-2的低血清培養基(1% S_2)、在培養基C中添加了 S-I和S-2的低血清培養基(1% S_l，S-2)。需說明的是，S-I相當于約10μΜ，1% 3_2相當于約51^。
10
在DMEM/F12中加入非必需氨基酸(GIBC0制備)、7 X 1(Γ4% 2-ME、100U/L青霉 素·鏈霉素、10% FCS、2. 5ng/L bFGF，得到以往的含血清的培養基(以往培養基)將IOmL這些培養基分別加入到直徑IOOmm的培養皿中，以初始細胞數10，000個 細胞/mL接種hMADS，在37°C下、5% CO2的環境下進行培養。由使用血細胞計數盤計數每個細胞繼代的細胞數的結果計算自培養開始的21天 期間的群體倍增數(η)的變化。群體倍增數是進行細胞分裂的次數(η)。細胞分裂中，1個 細胞分裂為2個，因此，進行η次分裂，則細胞數為2η。群體倍增數按照以下公式求出。群體倍增數(n) = Log⑵[(Pl計數細胞數/Pl接種細胞數)X (P2計數細胞數/P2 接種細胞數)X…](上式中，Pl、P2…表示第1繼代、第2繼代…)群體倍增數多1次則表示細胞數多2倍，多2次則表示細胞數多4倍，因此群體倍 增數多η次，則細胞倍數多2Χ倍。結果表示在

圖1-3中。圖1表示使S-2的濃度一定時的群體倍增數的變化。圖1中給出了以往培養基(〇)、低血清培養基C( A),0.2% S-2(X),0.2% S-2,0. 001% S-l(-),0. 2% S-2,0. 01% S-I ( * ) ,0. 2% S-2,0. 1% S-I (+),0. 2% S-2,1% S-I ( Δ )和 0. 2% S-2,10% S-l( )的群體倍增數。圖2表示使S-I的濃度一定時的群體倍增數的變化。圖2中給出了以往培養基(〇)、低血清培養基((▲)、(). 1%S-1(X),0. 1%S-1, 0. 002% S-2 (-)、0· 1 % S-1,0. 02% S-2( * )、0· 1 % S-1,0. 2% S-2 (+)、0· 1 % S-1,0. 5% S-2(A )、0· 1% S-1,1% S-2( )和 0. S-1,2% S_2 ( )的群體倍增數。上述低血清培養基C中加入S-3的結果如圖3所示。圖3中給出了以往培養基(〇)、低血清培養基C ( ▲ )、1 % S-I ( )、1 % S-2 ( ■) 和1%S_3(·)的群體倍增數。(l_3)hMADS向脂肪細胞的分化將細胞以21000個細胞/cm2的細胞密度轉移至含有0. ImL脂肪細胞分化培養基 (DMEM、10% FCS,500 μ M異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、1 μ M地塞米松、1 μ M胰島素、1 μ M羅西 格列酮)的96孔培養板的孔中，所述細胞已經使用(1-2)的以往培養基和在低血清培養基 C中加入S-3的培養基維持多個繼代，在37°C、5% CO2中培養10天，進行向脂肪細胞的分 化誘導。向脂肪細胞的分化通過油紅0染色確認。結果表示在圖4(A)中。(l_4)hMADS向骨細胞的分化將細胞以10000個細胞/cm2的細胞密度轉移至含有0. 5mL骨細胞分化培養基 (DMEM、10% FCS、200yM抗壞血酸、0. ΙμΜ地塞米松、IOmM β -磷酸甘油酯)的24孔培養 板的孔中，所述細胞已經使用(1-2)的以往培養基和在低血清培養基C中加入S-3的培養 基維持多個繼代，在37°C、5% CO2中培養15天，進行向骨細胞的分化誘導。向骨細胞的分 化通過茜素紅0染色確認。結果表示在圖4(B)中。由圖4的結果可知，在低血清培養基C中加入S-3的培養基所培養的hMADS與在 含有10%血清的以往培養基中培養的細胞同程度地染色，因此，同程度地分化為脂肪細胞 和骨細胞。由此可知，在這些培養基中培養的細胞均具有保持未分化性的能力，作為干細胞的分化能力沒有差別。另外，即使使用人血清代替(1-2)中使用的FCS，也可確認圖1-4所示的增殖和分 化傾向沒有變化。實施例2實施例2 來自人骨髓的間葉系干細胞(hMSC)的培養(2-1)配體的制備將2. Img血清素鹽酸鹽(Sigma制備)溶解于IOmL DMEM(L0NZA制備)，制備配體 1 (S-I)，將其作為血清素配體。將2. 3mg 1-油酰基溶血磷脂酸鈉鹽(LPA =CAYMAN制備)溶解于IOmL PBS,制備 配體2 (S-2)，將1. 9mg 1-磷酸鞘氨醇(SIP =CAYMAN制備)溶解于IOmL DMEM中，制備配體 2(S-2’)，將它們作為Edg配體。進一步將2. Img血清素鹽酸鹽和2. 3mg LPA溶解于IOmL PBS中，制備配體3 (S-3)。(2-2) hMSC 的增殖從實施例1中制備的基礎培養基中除去次黃嘌呤和胸苷以及一部份無機鹽類(硫 酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅)，在所得的基礎培養基中加入 100U/mL青霉素·鏈霉素(GIBC0制備)以及0. 5% FCS，得到低血清培養基Cl。在上述基 礎培養基中加入100U/mL青霉素·鏈霉素(GIBC0制備)以及1. 0% FCS，得到低血清培養
^S C2 ο以各種濃度在低血清培養基Cl中添加(2-1)制備的S-I和/或2，得到低血清培 養基。具體來說，是以以下濃度添加S-I和/或S-2。在低血清培養基Cl中加入了 0% S-I和0. 2% S_2的低血清培養基(0. 2% S_2)、在低血清培養基Cl中加入了 0. 001% S-I和0.2% S-2的低血清培養基(0.2% S-2,0. 001% S-1)、在低血清培養基Cl中加入了 0.01% S-I和0.2% S-2的低血清培養基(0.2% S-2,0. 01% S-1)、在低血清培養基Cl中加入了 0. S-I和0. 2% S-2的低血清培養基(0. 2% S-2， 0. 1% S-1)、在低血清培養基Cl中加入了 S-I和0. 2% S_2的低血清培養基(0. 2% S_2，
1% s-1)、在低血清培養基Cl中加入了 10% S-I ^P 0.2% S-2的低血清培養基(0. 2% S-2，
10% s-1)、在低血清培養基Cl中加入了 0.S-I和0% S-2的低血清培養基(0. 1% S_l)、在低血清培養基Cl中加入了 0. 1% S-I和0. 002% S_2的低血清培養基(0. 1% S-1,0. 002% S-2)、在低血清培養基Cl中加入了 0. S-I和0.02% S_2的低血清培養基(0. 1 % S-1,0. 02% s-2)、在低血清培養基Cl中加入了 0.S-I和0. 2% S_2的低血清培養基(0. 1%S-1,
0. 2% s-2)、在低血清培養基Cl中加入了 0. S-I和S-2的低血清培養基(0. 1% S-1,
121 % S-2)、在低血清培養基Cl中加入了 0. S-I和2% S_2的低血清培養基(0. 1% S-1, 2% S-2)、在低血清培養基Cl中加入了 S-I和0% S-2的低血清培養基(1% S_l)、在低血清培養基Cl中加入了 0% S-I和S-2的低血清培養基(1% S_2)、在低血清培養基Cl中加入了 S-I和S-2的低血清培養基(1% S_l，l% S-2)、在低血清培養基Cl中加入了 0. 5%的FCS、1 % S-1和S-2的低血清培養基 (1% S-3,1% FCS)。以各種濃度在低血清培養基C2中添加(2-1)制備的S-I和/或2’，得到低血清培 養基。具體是以以下濃度添加S-I和/或S-2’。在低血清培養基C2中加入了S-2’的低血清培養基(0. l%S-2',
1% s-1)、在低血清培養基C2中加入了 S-I和0.02% S-2’的低血清培養基(0.02% S-2M% s-1)、在低血清培養基C2中加入了 S-I和0.01% S-2，的低血清培養基(0.01% S-2M% s-1)、在低血清培養基C2中加入了 S-I和0. 002% S_2’的低血清培養基(0. 002% S-2M% s-1)、在低血清培養基C2中加入了 1%5-1和0.0002%5_2，的低血清培養基(0.0002% S-2M% s-1)。將含有10% FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的人間葉系干細胞專用培養基試劑盒 (hMSC Bullet試劑盒，LONZA制備)作為以往的培養基。將IOmL這些培養基分別加入到直徑IOOmm的培養皿中，以初始細胞數10，000個 細胞/mL接種hMSC，在37°C下、5% CO2的環境下進行培養。使用血細胞計數盤計數各個細胞繼代的細胞數，圖5-7是使用計數的結果計算自 培養開始的19天期間的群體倍增數(η)的變化，圖8是使用計數的結果計算自培養的開始 18天期間的群體倍增數(η)的變化。結果如圖5-8所示。圖5表示使S-2的濃度一定時的群體倍增數的變化。圖5中給出了以往培養基(〇)、低血清培養基Cl( ▲)、(). 2% S-2(X),0.2% S-2,0. 001% S-I (-)、0· 2% S-2,0. 01% S_l( * )、0· 2% S-2,0. 1% S_1 (+)、0· 2% S-2,1% S-I(A)、0· 2% S-2,10% S-l( )、1% S-l( □ )、1% S-2( ■)和 S-1,1% S-2 ( ·) 的群體倍增數。圖6表示使S-I的濃度一定時的群體倍增數的變化。圖6中給出了以往培養基(〇)、低血清培養基Cl (▲)、(). S-I(X),0. 1% S-1,0. 002% S-2 (-)、0· 1% S-1,0. 02% S_2 ( * )、0· 1% S-1,0. 2% S-2 (+)、0. 1% S-1,1% S-2( )、0. 1% S-1, 2% S-2( O ) ,1% S-I ( □ ) ,1% S-2 ( ■)禾Π 1 % S-1,1% S-2 ( ·) 的群體倍增數。在上述低血清培養基Cl中加入S-3時的結果如圖7所示。
圖7中給出了以往培養基(〇)、低血清培養基Cl( ▲ )、1 % S-l( S-2 ( ■ )、1 % S-3 ( ·)和 1 % S-3，1 % FCS ( )的群體倍增數。圖8表示使S-I的濃度一定時的群體倍增數的變化。圖8 中給出了 以往培養基(〇)、0. 1 % S-2M % S-K Δ )>0. 02% S-2M % s-l( )、0. 01 % S-2M % s-l( ■ )、0· 002 % S-2M % s-l( O )、0· 0002 % S-2M % S-I(D)的群體倍增數。(2-3)hMSC向脂肪細胞的分化將細胞以20000個細胞/cm2的細胞密度轉移至含有0. ImL脂肪細胞分化培養基 (DMEM、10% FCS,500 μ M異丁基甲基黃嘌呤(IBMS)、1 μ M地塞米松、1 μ M胰島素、1 μ M羅西 格列酮)的96孔培養板的孔中，所述細胞已經使用(2-2)的以往培養基以及1%S-3，1% FCS保持多個繼代，在37°C、5% CO2中培養14天，進行向脂肪細胞的分化誘導。向脂肪細 胞的分化通過油紅0染色確認。結果如圖9(A)所示。(2_4)hMSC向骨細胞的分化將細胞以3000個細胞/cm2的細胞密度轉移至含有0. 5mL骨細胞分化培養基 (DMEMU0% FCS,200 μ M抗壞血酸、0. 1 μ M地塞米松、IOmM β -磷酸甘油酯)的24孔培養 板的孔中，所述細胞已經使用(2-2)的以往培養基以及1%3-3，1% 05保持多個繼代，在 37°C,5% CO2中培養14天，進行向骨細胞的分化誘導。向骨細胞的分化通過茜素紅S染色 確認。結果如圖9(B)所示。由圖9的結果可知，在S_3，1%FCS中培養的hMADS與在含有10%血清的以往 培養基中培養的細胞同程度染色，因此，同程度地分化為脂肪細胞和骨細胞。由此可知，在 這些培養基中培養的細胞均具有保持未分化性的能力，作為干細胞的分化能力沒有差別。另外，即使使用人血清代替(2-2)中使用的FCS，也可確認圖5-9所示的增殖和分 化傾向沒有變化。另外，即使使用SlP代替LPA作為Edg配體，也可確認分化傾向沒有變化。實施例3在含有氨基酸類(上述全部氨基酸類)、無機鹽類(上述全部無機鹽類)、維生素 類(上述的全部維生素類)以及其它添加劑(腺苷5’-一磷酸、皮質酮、乙醇胺、D-半乳糖、 D-葡萄糖、胰島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、次黃嘌呤、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三 碘甲腺原氨酸和運鐵蛋白)的培養基中加入7X10_4% 2-ME、100U/L青霉素 鏈霉素、0. 5% FCS、2.5ng/mL bFGF和1% (1-1)中制備的S-3，得到低血清培養基3 (1 % S-3LS)。除不含有FCS以外，按照與上述低血清培養基3同樣的組成，得到無血清培養基 3(1% S-3SF)。在DMEM/F12 中加入 lmg/L 非必需氨基酸(GIBC0 制備)、7 X 2_ME、100U/L 青 霉素·鏈霉素、10% FCS、2. 5ng/L bFGF，得到以往的含血清的培養基(以往培養基)將IOmL這些培養基分別加入到直徑IOOmm的培養皿中，以初始細胞數10，000個 細胞/mL接種hFB，在37°C下、5% CO2的環境下進行培養。使用血細胞計數盤計數每個細胞繼代的細胞數，由計數結果計算自培養開始的22 天期間的群體倍增數(η)。結果如圖10所示。圖10中給出了以往培養基(〇)、1%S_3LS(·)和1%S_3SF(A)的群體倍增數。實施例4實施例4 血清批次差異的降低效果(hMSC的培養)(4-1)配體的制備將2. Img血清素鹽酸鹽和2. 3mg LPA溶解于IOmL PBS中，制備配體3 (S-3)。(4-2) hMSC 的增殖從實施例1中制備的基礎培養基中除去次黃嘌呤和胸苷以及一部份無機鹽類(硫 酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅)，在所得的基礎培養基中加入 100U/mL青霉素 鏈霉素(GIBC0制備)以及各1. 0%的批次不同的FCS，得到低血清培養基 C2 (FCS1-4)。在低血清培養基C2(FCS1_4)中添加(4-1)制備的1 % S_3，得到低血清培養基 (1% S-3,1% FCS (1-4))。在DMEM中分別加入10 %的L-谷氨酰胺、抗生素以及與上述4種批次對應的 FCS(1-4)，得到以往的含血清培養基(以往培養基(FCS1-4))。將IOmL這些培養基分別加入到直徑IOOmm的培養皿中，以初始細胞數10，000個 細胞/mL接種hMSC，在37°C下、5% CO2的環境下進行培養。使用血細胞計數盤計數各個細胞繼代的細胞數，使用計數的結果計算自培養開始 18天期間的群體倍增數(η)的變化。改變FCS批次時的群體倍增數的變化如圖11-14所示。 圖11-14中，以往培養基(FCS1-4)用(〇)表示。低血清培養基(1% S-3,1% FCS(1-4)) 用(·)表示。將使用以往培養基(FCS1-4)和低血清培養基(1 % S-3，1 % FCS (1-4))培養14天 時的群體倍增數(η)匯總于圖15表示。由圖11-15的結果可知，在低血清培養基(1% S_3，l% FCS)中，與含有10%血清 的以往培養基比較，FCS的制備批次差異對細胞增殖的影響降低。實施例5實施例5 在人血清中的培養(hMSC的培養)(5-1)配體的制備將2. Img血清素鹽酸鹽和2. 3mg LPA溶解于IOmL PBS中，制備配體3 (S-3)。(5-2) hMSC 的增殖從實施例1中制備的基礎培養基中除去次黃嘌呤和胸苷以及一部份無機鹽類(硫 酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅)，在所得的基礎培養基中加入 100U/mL青霉素·鏈霉素(GIBC0制備)以及各1. 0%的批次不同的人血清HS，得到低血清 培養基 C3 (HS1，2)。在低血清培養基C3 (HSl，2)中添加(5_1)制備的1 % S_3，得到低血清培養基(1% S-3,1% HS(1，2))。在DMEM中分別加入10% L-谷氨酰胺、抗生素以及與上述2種批次對應的人血清 HS(1，2)，得到以往的含血清培養基(以往培養基(HS 1,2)) 0將IOmL這些培養基分別加入到直徑IOOmm的培養皿中，以初始細胞數10，000個 細胞/mL接種hMSC，在37°C下、5% CO2的環境下進行培養。
使用血細胞計數盤計數各個細胞繼代的細胞數，使用計數的結果計算自培養開始 的18天期間的群體倍增數(η)的變化。改變HS批次時的群體倍增數的變化如圖16、17所 示。以往培養基(HS1，2)用(〇)表示，低血清培養基(1% S-3,1% HS(1,2))用(·)表
7J\ ο由圖16、17的結果可知，可以在使用人血清的低血清培養基(1% S-3,1% HS)中培養。實施例6實施例6 來自人骨髓的間葉系干細胞(hMSC)的培養2在水中，在含有氨基酸類(上述全部氨基酸類)、無機鹽類(除硫酸銅、硝酸鐵 (III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅之外的全部無機鹽類)、維生素類(上述的全部 維生素類)以及其它添加劑(腺苷5’ - 一磷酸、皮質酮、乙醇胺、D-半乳糖、D-葡萄糖、胰 島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三碘甲腺原氨酸和運鐵蛋 白)的基礎培養基中加入Ing/mL血小板源性生長因子(PDGF)、2. 5ng/mL堿性成纖維細胞 生長因子(bFGF)、0. 02重量％人血清白蛋白和500 μ M N-乙酰半胱氨酸(NAC)、100U/mL青 霉素·鏈霉素(GIBG0制備)以及(1-1)中制備的S-3，得到無血清增殖培養基A。在DMEM中加入100U/mL青霉素·鏈霉素和10% FBS，得到以往的含血清培養基 (以往培養基A)。將IOmL這些培養基分別加入到直徑IOOmm的培養皿中，以初始細胞數15，000個 細胞/mL接種hMSC，在37°C下、5% CO2的環境下進行培養。使用血細胞計數盤計數每個細胞繼代的細胞數，由計數結果計算自培養開始的18 天期間的群體倍增數(η)的變化。結果如圖18所示。如圖18所示，在本發明的無血清增殖培養基A中培養，則不管 是無血清還是只含有2種生長因子，群體倍增數與在含有血清的以往培養基A中培養時同寸。hMSC向脂肪細胞的分化將細胞以30000個細胞/cm2的細胞密度轉移至含有0. 3mL脂肪細胞分化培養基 (DMEM、10% FCS,500 μ M ΙΒΜΧ、1 μ M地塞米松、1 μ M胰島素、1 μ M羅西格列酮)的48孔培養 板的孔中，所述細胞已經在以往培養基A和無血清增殖培養基A中保持多個繼代，在37°C、 5% CO2中培養14天，進行向脂肪細胞的分化誘導。向脂肪細胞的分化通過油紅0染色確 認。結果如圖19(A)所示。如圖19(A)所示，在本發明的無血清增殖培養基A中將細 胞保持多個繼代后施加分化誘導時，雖然比在含有血清的以往培養基A中保持多個繼代時 的情況稍少，但是細胞與以往培養基大致相同程度地被染色，可確認有向脂肪細胞的明確 的分化。hMSC向骨細胞的分化將細胞以3000個細胞/cm2的細胞密度轉移至含有0. 7mL骨細胞分化培養基 (01^11、10% 05、20(^11抗壞血酸、0.1“11地塞米松、101111 β-磷酸甘油酯)的12孔培養板 的孔中，所述細胞已經在以往培養基和無血清增殖培養基A中保持多個繼代，在37°C、5% CO2中培養21天，進行向骨細胞的分化誘導。向骨細胞的分化通過茜素紅S染色確認。
16
實施例7實施例7 來自人骨髓的間葉系干細胞(hMSC)的培養3在水中，在含有氨基酸類(上述全部氨基酸類)、無機鹽類(除硫酸銅、硝酸鐵 (III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅之外的全部無機鹽類)、維生素類(上述的全部 維生素類)以及其它添加劑(腺苷5’ - 一磷酸、皮質酮、乙醇胺、D-半乳糖、D-葡萄糖、胰 島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、三碘甲腺原氨酸和運鐵蛋白)的 基礎培養基中加入0.02重量％人血清白蛋白和500 μ M N-乙酰半胱氨酸(NAC)、100U/mL 青霉素 鏈霉素(GIBG0制備)以及(1-1)中制備的S-3，得到無血清增殖培養基B。將所得的無血清增殖培養基B以及實施例6中制備的無血清增殖培養基A以及以 往培養基各IOmL分別加入到直徑IOOmm的培養皿中，以初始細胞數20，000個細胞/mL接 種hMSC，在37°C下、5% CO2的環境下進行培養。使用血細胞計數盤計數每個細胞繼代的細胞數，由計數結果計算自培養開始的21 天期間的群體倍增數(η)的變化。結果如圖20所示。如圖20所示，在不含有生長因子的本發明的無血清增殖培養 基B中培養時，與在含有生長因子的本發明的無血清培養基B中培養時、以及在往培養基A 中培養時比較，群體倍增數減少，但細胞可以增殖。hMSC向脂肪細胞的分化將細胞以30000個細胞/cm2的細胞密度轉移至含有0. 3mL脂肪細胞分化培養基 (DMEMU0% FCS,500yM IBMX、1 μ M地塞米松、1 μ M胰島素、1 μ M羅西格列酮)的48孔培 養板的孔中，所述細胞已經在以往培養基A或無血清增殖培養基A或者無血清增殖培養基B 中保持多個繼代，在37°C、5% CO2中培養14天，進行向脂肪細胞的分化誘導。向脂肪細胞 的分化通過油紅0染色確認。結果如圖21㈧所示。如圖21㈧所示，分別在3種培養基中保持繼代后施加分 化誘導的細胞被相同程度地染色，在不含有生長因子的本發明的無血清培養基B中保持繼 代后施加分化誘導時，也可確認與含有血清的以往培養基同等地分化。hMSC向骨細胞的分化將細胞以3000個細胞/cm2的細胞密度轉移至含有0. 7mL骨細胞分化培養基 (DMEMU0% FCS,200 μ M抗壞血酸、0. 1 μ M地塞米松、IOmM β -磷酸甘油酯)的12孔培養 板的孔中，所述細胞已經在以往培養基A或無血清增殖培養基A或者無血清增殖培養基B 中保持多個繼代，在37°C、5% CO2中培養21天，進行向骨細胞的分化誘導。向骨細胞的分 化通過茜素紅S染色確認。結果如圖21(A)所示。如圖21(A)所示，在無血清增殖培養基A或無血清增殖培 養基B中保持繼代后施加分化誘導的細胞，與在以往培養基A中保持多個繼代的情況相比， 被相同程度地染色，可確認向骨細胞的分化。可以確認，本發明的無血清培養基在即使不含 有生長因子的情況下，也可以保持向骨細胞的分化能力。附圖簡述圖1是表示實施例1中得到的人脂肪組織源性干細胞(hMADS)的群體倍增數變化 的圖表。圖2是表示實施例1中得到的人脂肪組織源性干細胞(hMADS)的群體倍增數變化的圖表。圖3是表示實施例1中得到的人脂肪組織源性干細胞(hMADS)的群體倍增數變化 的圖表。圖4表示人脂肪組織源性干細胞(hMADS)向脂肪細胞的分化㈧以及向骨細胞的 分化⑶。圖5是表示實施例2所得的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數變化 的圖表。圖6是表示實施例2所得的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數變化 的圖表。圖7是表示實施例2所得的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數變化 的圖表。圖8是表示實施例2所得的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數變化 的圖表。圖9表示人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)向脂肪細胞的分化㈧以及向骨細胞 的分化⑶。圖10是表示實施例3所得的人成纖維細胞(hFB)的群體倍增數變化的圖表。圖11是表示實施例4所得的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數變化 的圖表。圖12是表示實施例4所得的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數變化 的圖表。圖13是表示實施例4所得的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數變化 的圖表。圖14是表示實施例4所得的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數變化 的圖表。圖15是表示實施例4中得到的、在含有不同批次胎牛血清(FCS)的培養基中培養 14天的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數的圖。圖16是表示實施例5中得到的、在含有人血清的培養基中培養的人骨髓源性間葉 系干細胞(hMSC)的群體倍增數變化的圖表。圖17是表示實施例5中得到的、在含有人血清的培養基中培養的人骨髓源性間葉 系干細胞(hMSC)的群體倍增數變化的圖表。圖18是表示實施例6中得到的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數變 化的圖表。圖19是表示實施例6中得到的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)向脂肪細胞的分 化(A)以及向骨細胞的分化(B)。圖20是表示實施例7中得到的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)的群體倍增數變 化的圖表。圖21是表示實施例7中得到的人骨髓源性間葉系干細胞(hMSC)向脂肪細胞的分 化(A)以及向骨細胞的分化(B)。
權利要求
哺乳動物體細胞用培養基，該培養基含有內皮細胞分化基因(Edg)家族受體的配體以及血清素受體的配體。
2.權利要求1所述的培養基，該培養基為無血清或低血清培養基。
3.權利要求1或2所述的培養基，其中，內皮細胞分化基因家族受體的上述配體在培養 基中的濃度為0. 01-100 μ Μ，血清素受體的上述配體在培養基中的濃度為0. 1-100 μ Μ。
4.權利要求1-3中任一項所述的培養基，其中，內皮細胞分化基因家族受體的上述配 體為選自溶血磷脂酸(LPA)及其鹽、鞘氨醇一磷酸(SlP)以及內皮細胞分化基因(Edg)家 族受體的激動劑的至少一種。
5.權利要求1或2所述的培養基，其中，內皮細胞分化基因家族受體的上述配體為選自 溶血磷脂酸(LPA)及其鹽的至少一種，其在培養基中的濃度為0. 25-10 μ M ；血清素受體的 上述配體在培養基中的濃度為0. 25-20 μ Μ。
6.權利要求1-5中任一項所述的培養基，其中，血清素受體的上述配體為選自血清素、 其鹽以及血清素受體的激動劑的至少一種。
7.權利要求1-6中任一項所述的培養基，該培養基進一步含有抗氧化劑。
8.權利要求7所述的培養基，其中，上述抗氧化劑為選自N-乙酰半胱氨酸和L-半胱氨 酸的至少一種。
9.權利要求7或8所述的培養基，其中，上述抗氧化劑在培養基中的濃度為 0. OlmM-lOmM。
10.權利要求1-9中任一項所述的培養基，該培養基進一步含有動物血清白蛋白。
11.權利要求1-10中任一項所述的培養基，其中，上述血清白蛋白在培養基中的濃度 為 0. 0001-10 重量 ％。
12.權利要求1-11中任一項所述的培養基，該培養基進一步含有生長因子。
13.權利要求12所述的培養基，其中，上述生長因子為選自血小板源性生長因子 (PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)的至少一種。
14.權利要求13所述的培養基，其中，培養基中所含的上述生長因子是血小板源性生 長因子(PDGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)兩種。
15.權利要求12-14中任一項所述的培養基，其中，上述生長因子在培養基中的濃度為 0.1-lOOng/mL。
16.哺乳動物體細胞用培養基的添加劑，該添加劑含有內皮細胞分化基因(Edg)家族 受體的配體以及血清素受體的配體。
17.權利要求16所述的添加劑，其中，內皮細胞分化基因家族受體的上述配體為選自 溶血磷脂酸(LPA)及其鹽、鞘氨醇一磷酸(SlP)以及內皮細胞分化基因(Edg)家族受體的 激動劑的至少一種。
18.權利要求16或17所述的添加劑，其中，血清素受體的上述配體為選自血清素、其鹽 以及血清素受體的激動劑的至少一種。
19.權利要求16-18中任一項所述的添加劑，該添加劑進一步含有抗氧化劑。
20.權利要求16-19中任一項所述的添加劑，該添加劑進一步含有動物血清白蛋白。
21.權利要求16-20中任一項所述的添加劑，該添加劑進一步含有生長因子。
22.權利要求16-21中任一項所述的添加劑，該添加劑具有通過溶解于水或基礎培養基而形成權利要求1-15中任一項所述的培養基的組成。
23.哺乳動物體細胞的培養方法，該方法包括在權利要求1-15中任一項所述的培養基 中培養哺乳動物體細胞。
全文摘要
本發明公開了哺乳動物體細胞用培養基以及構成該培養基的添加劑，所述培養基在培養哺乳動物的體細胞時在盡可能地抑制向培養基中添加血清或者是不添加血清的情況下可以使哺乳動物體細胞有效增殖。通過在培養基中摻混內皮細胞分化基因(Edg)家族受體的配體以及血清素受體的配體，即使在培養基完全不含或者只少量含有血清的情況下也可以使哺乳動物的體細胞有效增殖。
文檔編號C12N5/0775GK101918542SQ20088012398
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月26日 優先權日2007年12月28日
發明者堀田佳之, 山隈晴美, 杉村逸郎 申請人:富士瑞必歐株式會社