專利名稱：通過極光激酶a的熒光原位雜交非侵入性檢測膀胱癌的制作方法
通過極光激酶A的熒光原位雜交非侵入性檢測膀胱癌
背景技術：
本發明在由National Cancer Institute授予的授權號UOl CA85078下由美國政 府支持進行。美國政府具有本發明中的特定權利。本發明一般涉及癌癥檢測領域。更具體而言，它涉及膀胱癌的檢測。發明_既述在一個實施方案中，本發明涉及檢測患者中的膀胱癌的方法，其包括從患者的尿 中分離膀胱細胞；使膀胱細胞與經標記的DNA探針雜交，其中探針識別極光激酶Aburora kinase Α)基因的至少部分，以產生與經標記的DNA探針雜交的膀胱細胞樣品；并且計數樣 品中的膀胱細胞數目、樣品中的每個膀胱細胞中的極光激酶A基因拷貝數、和樣品中具有 極光激酶A基因的至少拷貝數第一閾值的膀胱細胞數目。附圖簡述下述附圖構成本發明說明書的部分，并且包括在內以進一步證實本發明的特定方 面。本發明通過參考與本文呈現的特定實施方案的詳述組合的這些附圖中的一個或多個可 以得到更好地理解。

圖1。極光激酶A在移行細胞癌(TCC)中的表達及其與DNA倍數性的關聯。A，通 過定量RT-PCR揭示的相鄰尿道上皮和TCC的成對樣品中的極光激酶A水平。B和C，分別 通過顯示近二倍體(2c)DNA含量和顯著的非整倍體(6c)的腫瘤核的圖像分析產生的DNA 直方圖。D，低級別(級別1-2)、淺表(Ta-Tla)和高級別(級別3)、侵入性(Tlb和更高的) TCC以及近二倍體和非整倍體TCC中的極光激酶A的平均表達水平。圖2。在膀胱癌細胞系中的極光激酶A表達和染色體拷貝數。A，通過定量RT-PCR， 極光激酶A在膀胱癌細胞系中的表達與經培養的尿道上皮細胞(NU204)相比較。B，使用針 對染色體3、7和17的著絲粒探針通過定量FISH揭示的染色體拷貝數。C，在3組膀胱癌細 胞系中的極光激酶A的平均表達水平。D，在C中顯示的3組膀胱癌細胞系中，用針對染色 體3、7和17的著絲粒探針通過FISH揭示的癌細胞系中的平均染色體拷貝數。圖3。使用抗GFP抗體用包含野生型極光激酶A插入片段的腺病毒載體轉染的 SV40尿道上皮細胞中的極光激酶A-GFP融合蛋白的異位表達。A，顯示極光激酶A-GFP融合 蛋白的表達的Western印跡分析(上圖)。用DAPI作為核復染劑顯示極光激酶A-GFP融合 蛋白的異位表達的免疫熒光分析(下圖)。用不含極光激酶A插入片段的腺病毒載體感染 的細胞的免疫熒光圖像(a，b)。用紅色濾光器獲得的圖像揭示2個中心體(a)。用綠色濾 光器獲得的圖像揭示沒有極光激酶A-GFP融合蛋白的異位表達(b)。用包含極光激酶A插 入片段的腺病毒載體感染的細胞的免疫熒光圖像(c，d)。用紅色濾光器獲得的圖像顯示用 抗微管蛋白抗體揭示的中心體倍增(紅色)(c)。用綠色濾光器獲得的圖像顯示在中心體中 異位表達的極光激酶A-GFP蛋白質(d)。B，通過異位表達的極光激酶A誘導的中心體和染 色體拷貝數的定量評估。C，與用PI復染劑揭示的DNA含量(紅色熒光)相關的異位表達 的極光激酶A-GFP蛋白質(綠色熒光)的雙重熒光FACS分析。在用包含野生型極光激酶 A插入片段的腺病毒載體感染后的雙重熒光分布圖(右圖)。用空腺病毒載體感染的細胞的對照分布圖(右圖)。與對照相比較(左圖)，注意到在指定為A和B的分布圖區域中的 非整倍體(aneuploid)細胞的增加(右圖)。D，通過C中顯示的雙重熒光FACS分析和軟瓊 脂上的集落形成揭示的非整倍體細胞的定量評估。Ad/對照用不含極光激酶A插入片段 的腺病毒載體感染的細胞，Ad/極光激酶A GFP 用包含野生型極光激酶A的腺病毒載體轉 染的細胞，MOI 感染復數。圖4。用極光激酶A FISH探針檢測排泄尿中的癌細胞。A，雙重熒光FISH證實， 極光激酶A基因拷貝數(紅色)和染色體特異性探針的短臂(綠色)。正常尿道上皮細胞 中的極光激酶A的二倍體拷貝數(a)。在低級別(級別1-2) TCC中的低水平極光激酶A基 因擴增(3個拷貝)(b)。在高級別(級別3)侵入性TCC中的高水平極光激酶A基因擴增 (> 4個拷貝)(c)。在包含極光激酶A的多個拷貝和染色體20p探針的高級別(級別3) 侵入性TCC中的染色體20的多體性polysomy (d)。B，來自具有膀胱TCC的23個患者(訓 練組)的排泄尿樣品中的極光激酶A基因拷貝數的定量FISH分析。顯示了在個別患者中 顯示極光激酶A的低(3-4個拷貝)和高(> 4個拷貝)擴增水平的細胞百分比。C，由來 自具有膀胱癌的患者的23份尿樣品組成的訓練組和來自7個健康未受影響對照的7份尿 樣品中關于極光激酶AFISH測試的ROC曲線(η = 30)。D，由來自具有膀胱癌的患者的51 份尿樣品組成的測試組和來自健康未受影響對照的30份尿樣品中關于極光激酶A FISH測 試的ROC曲線(η = 81)。Ε，通過組織學級別的極光激酶A得分。圖5。來自具有膀胱TCC的74個患者和37個健康對照(組合的訓練和測試組) 的排泄尿樣品中的極光激酶A基因拷貝數的定量FISH分析。顯示了在個別患者中顯示極 光激酶A的低(3-4個拷貝)和高(> 4個拷貝)擴增水平的細胞百分比。圖 6。AURKA 20ql3 探針的圖。舉例說明性實施方案的描述以非整倍性形式表現染色體不穩定性的惡性細胞經常顯示額外的中心體和多極 有絲分裂紡錘體，暗示在細胞器控制有絲分裂時的染色體分離的異常在非整倍性的發展中 起作用。η極光激酶A也稱為STK15或BTAK，是絲氨酸蘇氨酸激酶家族成員，其中包括果蠅 (Drosophilia)極光和釀酒酵母(Saccharomycescervisiae) IPLl激酶。4_6這些激酶已鑒 定為人細胞中的正常染色體分離和中心體功能(包括中心體分離和突變調節)的關鍵調節 物。7此外，已顯示位于染色體20ql3上的極光激酶A基因的過表達與非整倍性和染色體不 穩定性相關，促進哺乳動物細胞和幾種人腫瘤(包括尿道上皮癌)中的致瘤性轉化和進展。
4,8有趣的是，經誘導以經歷體外轉化的原代人尿道上皮細胞表現染色體20ql3. 2的 擴增，暗示在這個染色體上的一種或多種基因的過表達可能在膀胱癌的發展中起顯著作 用。9這些觀察連同在染色體20ql3上的極光激酶A編碼基因也已鑒定為小鼠和人中的腫 瘤易感性基因座1(1以及極光激酶A誘導p53腫瘤抑制基因的功能滅活5的事實，暗示極光激 酶A的表達增加可能是人尿道上皮細胞中的染色體不穩定性和轉化的關鍵遺傳決定因素。在一個實施方案中，本發明涉及檢測患者中的膀胱癌的方法，其包括從患者的尿 中分離膀胱細胞；使膀胱細胞與經標記的DNA探針雜交，其中探針識別極光激酶A基因的至 少部分，以產生與經標記的DNA探針雜交的膀胱細胞樣品；并且計數樣品中的膀胱細胞數目、樣品中的每個膀胱細胞中的極光激酶A基因拷貝數、和樣品中具有極光激酶A基因的至 少拷貝數第一閾值的膀胱細胞數目。從患者的尿中分離膀胱細胞(最通常地，尿道上皮細胞)可以通過本領域已知的 任何技術來執行。在一個實施方案中，分離膀胱細胞可以通過下述來完成收集來自患者的 排泄尿樣品(約100-200ml)，在夠以使尿中的膀胱細胞形成團塊的旋轉速度和持續時間下 離心，棄去上清液，并且使形成團塊的膀胱細胞重懸浮于合適溶液中用于貯存或使用。在一 個實施方案中，離心的持續時間和旋轉速度是約15分鐘和以約lOOOrpm。在一個實施方案 中，使形成團塊的膀胱細胞重懸浮于具有10% DMSO(二甲基亞砜)的2ml DMEM(Dulbecco/ Vogt ModifiedEagle' s Minimal Essential Medium)中并且C存于 _70°C，直至在其在該 方法的后續步驟中使用前使重懸浮的膀胱細胞解凍的時候。在解凍后和在雜交前，膀胱細胞可以在PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)或適合于洗滌膀胱 細胞的其它緩沖液中洗滌一次或多次，例如3次，隨后為離心以使經洗滌的膀胱細胞形成 團塊。形成團塊的經洗滌的膀胱細胞可以在甲醇/乙醇(3 1)中固定，在2x SSC/0.5% NP-40，pH 7中在37°C下預處理30分鐘，隨后為在乙醇中在90°C下脫水5分鐘。如對于本 領域普通技術人員顯而易見，適合于制備用于與經標記的DNA探針雜交的膀胱細胞的其他 處理技術可以作為常規實驗內容執行。使膀胱細胞與經標記的DNA探針雜交可以通過本領域技術人員已知的任何技術 來執行。經標記的DNA探針可以包括任何DNA序列和任何可檢測部分，前提是探針識別極 光激酶A基因的至少部分。在一個實施方案中，可檢測部分包括熒光團。在一個實施方案 中，可檢測部分包括放射性同位素。來自人(H. sapiens)的極光激酶A的cDNA序列顯示為SEQ ID NO 1 (GenBank登 記號BC001280)，并且來自人的極光激酶A的基因組序列顯示為SEQ ID NO :2。盡管在其他 方面相同，但2個序列在位置301處不同，并且cDNA包含基因組序列缺乏的16聚體腺苷尾部。“探針識別極光激酶A基因的至少部分”意指探針包括具有這樣的序列的DNA分 子，所述序列與極光激酶A基因的部分的至少一條DNA鏈基本上完全互補(即，至少約90 % 互補，例如至少約95%互補、至少約96%互補、至少約97%互補、至少約98%互補、至少約 99%互補、至少約99. 5%互補或至少約99. 9%互補)，并且進一步地，探針的DNA分子足夠 長并且具有這樣的序列，使得它將基本上僅與極光激酶A基因雜交，并且將基本上不與膀 胱細胞的任何其他基因或不表達的基因組元件雜交。進一步希望探針的DNA分子不是那么 長，以需要長時間與極光激酶A基因雜交。在一個實施方案中，經標記的DNA探針包括AURKA 20ql3(MP Biomedicals/Qbiogene，Illkirch，France)。AURKA 20ql3 特異性 DNA 探針進行 最佳化，以檢測在中期/間期散布、血涂片和石蠟包膜組織切片上在區域20ql3處在染色體 20上的極光激酶A基因拷貝數。可以使用可以與探針的DNA分子結合的任何熒光團。在一個實施方案中，熒光團 選自若丹明和熒光素。在一個實施方案中，AURKA 20ql3探針用若丹明(紅色)直接進行 標記，并且染色體20 α-衛星探針用熒光素(綠色)直接進行標記。這種雙色極光激酶A FISH探針可以用于檢測排泄尿樣品的剝落細胞中的極光激酶A基因拷貝數。在一個實施方案中，雜交技術可以涉及脫水的膀胱細胞與10 μ IAURKA 20ql3探針在37°C下溫育約16小時(例如過夜)。為了去除未雜交的探針，細胞可以例如在0.5x SSC/0. SDS中在65°C下洗滌5分鐘。在計數前細胞可以用DAPI (4‘，6-二脒基-2-苯 基吲哚)進行復染并且在抗衰退溶液中進行固定。在一個進一步的實施方案中，對于極光激酶A基因非特異性的第二種經標記的 DNA探針可以與膀胱細胞雜交，以允許計數對于本領域普通技術人員可能感興趣的其他 DNA區域。雜交步驟產生與經標記的DNA探針雜交的膀胱細胞樣品。計數樣品中的膀胱細胞數目、樣品中的每個膀胱細胞中的極光激酶A基因拷貝 數、和樣品中具有極光激酶A基因的至少拷貝數第一閾值的膀胱細胞數目，可以通過流式 細胞術、熒光顯微鏡檢查或放射性同位素檢測領域的普通技術人員已知的任何合適技術來 執行。流式細胞儀或熒光激活細胞分選器的使用是本領域眾所周知的。當可檢測部分是 熒光團時，可以用任何合適的顯微鏡計數并且捕獲熒光信號，例如Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss Microimaging GmbH，Jena, Germany) 0計數產生樣品中的膀胱細胞數目、樣品中的每個膀胱細胞中的極光激酶A基因拷 貝數、和樣品中具有極光激酶A基因的至少拷貝數第一閾值的膀胱細胞數目。拷貝數第一 閾值可以選擇為等于在膀胱癌細胞中通常發現的極光激酶A基因的最小拷貝數。在一個實 施方案中，極光激酶A基因的拷貝數第一閾值是3。在一個進一步的實施方案中，計數進一步包括計數具有極光激酶A基因的至少拷 貝數第二閾值的膀胱細胞數目，其中拷貝數第二閾值大于拷貝數第一閾值。拷貝數第二閾 值可以選擇為等于在侵略性膀胱癌細胞中通常發現的極光激酶A基因的最小拷貝數。在一 個實施方案中，極光激酶A基因的拷貝數第二閾值是5。通過計數樣品中的膀胱細胞數目、和樣品中具有極光激酶A基因的至少拷貝數第 一閾值的膀胱細胞數目，后面一個數目可以除以膀胱細胞數目，以計算具有極光激酶A基 因的至少拷貝數第一閾值的膀胱細胞百分比。在一個實施方案中，如果大于或等于第一閾值百分比的膀胱細胞具有極光激酶A 基因的至少拷貝數第一閾值，那么該方法進一步包括假定患者具有膀胱癌的步驟。具有極 光激酶A基因的至少拷貝數第一閾值的膀胱細胞的百分比任何值可以用作第一閾值百分 比。在一個實施方案中，第一閾值百分比是15%。在一個進一步的實施方案中，如果大于或等于第二閾值百分比的膀胱細胞具有極 光激酶A基因的至少拷貝數第一閾值，其中第二閾值百分比大于第一閾值百分比，那么該 方法進一步包括假定患者具有侵略性膀胱癌的步驟。“侵略性(aggressive)”膀胱癌指具 有特征在于呈現侵入性腫瘤、非乳頭狀腫瘤、或具有組織學級別3的腫瘤中的一種或多種 的膀胱癌。在一個實施方案中，第一閾值百分比是15%，并且第二閾值百分比是20%。通過執行該方法，在假定患者是否具有膀胱癌以及如果具有膀胱癌，那么侵略性 是如何中有用的因素可以由醫生通過非侵入性技術進行定量。通過對因素定量，醫生可以 決定是否應執行或考慮執行其他診斷或治療方法，例如膀胱鏡檢查、手術切除、BCG滴注到 膀胱內、其他化學治療分子滴注到膀胱內、輻照處理或膽囊切除術。通過在目前對膀胱癌進 行治療(例如通過化學治療或輻射)的患者的復發基礎上執行該方法，可以監控治療的功 效。通過在先前對膀胱癌進行治療的患者的復發基礎上執行該方法，可以監控可能存在的復發的程度。我們已發現該方法具有高特異性(在下文實施例中，當η = 81時，特異性是1. 0， 意指假陽性率是0%)和高靈敏度(在下文實施例中，靈敏度是0.86，意指假陰性率是 14% )。就我們所知，沒有其他同事報告了在至少80名個體的樣本大小上測試的非侵入性 膀胱癌篩選方法，具有超過0. 85的特異性和超過0. 85的靈敏度，更不必說1. 0的特異性和 至少0. 86的靈敏度。包括下述實施例以證實本發明的優選實施方案。本領域技術人員應當理解在下述 實施例中公開的技術代表由本發明人發現在本發明的實踐中工作良好的技術，并且因此可 以被視為構成用于其實踐的優選方式。然而，根據本公開內容，本領域技術人員應當理解可 以在所公開的具體實施方案中進行許多改變，并且仍獲得相同或相似結果，而不背離本發 明的精神和范圍。實施例1概括背景導致非整倍性的染色體錯誤分離是瘤形成中的常見體細胞遺傳改變，并且 調節染色體分離的基因可能是潛在的癌癥檢測標記。有絲分裂的關鍵調節物——極光激酶 A的擴增/過表達已在人癌癥(包括膀胱癌)中頻繁檢測出，并且擴增程度與非整倍性程度 相關。方法我們測量了在膀胱癌細胞中的極光激酶A表達的水平，并且使之與3種所選 擇的染色體的拷貝數和核DNA總含量相關聯。極光激酶A對中心體倍增和染色體拷貝數的 影響在體外使用腺病毒表達構建體進行測量。為了評估該基因作為關于膀胱癌的生物標記 的適用性，還在來自膀胱癌患者的排泄尿的脫落細胞上使用熒光原位雜交(FISH)測量了 極光激酶A基因拷貝數。發現極光激酶A在人尿道上皮細胞中的過表達誘導中心體的擴增、染色體錯誤 分離和非整倍性。此外，極光激酶A基因的過表達在腫瘤發生的早期發生，并且可以在原位 損傷中以及在具有膀胱癌的患者的排泄尿中檢測出。在由來自具有膀胱癌的患者的51份 排泄尿樣品和30份未受影響的健康對照中組成的不知情驗證測試上執行的關于極光激酶 A基因拷貝數的FI SH測試，以特異性1. 0和靈敏度0. 86檢測出膀胱癌。解釋我們的發現指出過表達的極光激酶A可以引起尿道上皮細胞的非整倍性， 并且是用于檢測膀胱癌的有希望的生物標記。前言人膀胱癌是研究染色體不穩定性機制的理想系統，因為它經由乳頭狀和非乳頭狀 途徑從原位腫瘤前狀態發展，這顯示侵略性和非整倍性程度之間的強關聯。“源于尿道上 皮增生的大多數低級別、淺表乳頭狀腫瘤是近二倍體。盡管它們經常復發，但它們不太可能 侵入膀胱壁且轉移。相比之下，通過由嚴重發育異常癌原位進展而發展的基本上所有高級 別、非乳頭狀腫瘤顯示顯著的非整倍性，并且具有侵入膀胱壁且轉移的高傾向。在本文研究中，評估了極光激酶A在來自原位尿道上皮增生的膀胱癌發展中的作 用。我們研究了在人膀胱腫瘤樣品和膀胱癌細胞系中的極光激酶A擴增和過表達水平，并 且使之與非整倍性程度相關聯。極光激酶A過表達的功能牽涉通過體外轉染研究進行驗 證。最后，鑒定極光激酶A作為用于在尿中進行膀胱癌的非侵入性檢測的潛在生物標記。
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材料與方法腫瘤樣品和細胞系。如先前所述從21份人膽囊切除術樣品中獲得膀胱和相鄰尿 道上皮的移行細胞癌(TCC)的成對樣品的細胞懸浮液。12簡言之，刮下與腫瘤相鄰的粘膜 表面，并且將細胞轉移到包含磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的錐形管內。腫瘤從冷凍塊中切開，以 使由非腫瘤細胞的污染降到最低，并且類似地轉移至包含PBS的錐形管。通過機械攪動組 織片段將腫瘤細胞釋放到PBS溶液內。僅產生超過90%顯微鏡可識別腫瘤細胞或完整尿 道上皮的那些樣品用于這個研究。在腫瘤的經尿道切除前收集來自具有膀胱鏡檢查明顯的 膀胱癌的74個患者的排泄尿樣品(約100-200ml)，并且在1000RPI下離心15分鐘。使尿 樣品重懸浮于具有10% DMSO的2ml DMEM中并且貯存于_70°C。將尿道上皮內癌前病變 分類為輕度、中度和重度發育異常或原位癌。腫瘤根據三層世界衛生組織(World Health Organization)組織學分級系統和生長模式(乳頭狀與非乳頭狀)進行分類。侵入深度根據 TNM(腫瘤_結節-轉移)分期系統進行記錄。來自37個無膀胱癌證據的未受影響的健康個 體的排泄尿樣品作為對照。人膀胱癌細胞系UM-UC-1、UM-UC-2、UM-UC3、UM-UC-6、UM-UC-9、 UM-UC-10, UM-UC-12, UM-UC-13, UM-UC-15, UM-UC-16 和 UM-UC-17，以及正常人尿道上皮細 胞由我們建立，并且SV40永生化人尿道上皮細胞系SVHUC得自Dr. C. A. Reznikoff,并且如 先前所述進行培養。13用于極光激酶A的表達測定法。如先前所述定量RT-PCR用于分析相鄰尿道上皮 /膀胱腫瘤和細胞系的成對樣品中的極光激酶A的表達水平。12簡言之，對于RT-PCR，使用 TaqMan RT 試劑根據制造商的方案(Applied Biosystems, Foster City, CA)從 2 μ g 總 RNA 巾gj^cDNA。 ffligi Applied BiosystemsAssays-by-Design Service i^if
每種基因的引物和熒光探針。在PerkinElmer/AppliedBiosystems 7700Prism儀器上執行 RT-PCR分析，使用持家基因18S作為內部標準化標準。由不含尿道上皮瘤形成的來自腎切 除術樣品的輸尿管制備的尿道上皮懸浮液用作標準，根據其計算來自相鄰尿道上皮和膀胱 腫瘤的極光激酶A的相對表達。NU204人尿道上皮細胞如先前所述在體外生長14，并且用作 參考以計算在體外生長的膀胱癌細胞系中的極光激酶A的相對表達水平。極光激酶A基因拷貝數分析。購自MP Biomedicals/Qbiogene(Illkirch,France) 的雙色極光激酶A FISH探針(AURKA 20gl3/a_衛星20DNA探針)用于檢測排泄尿樣品的脫 落細胞中的極光激酶A基因拷貝數。AURKA 20813探針用若丹明(紅色)直接進行標記，并 且染色體20 α-衛星探針用熒光素(綠色)直接進行標記。雜交條件根據制造商的建議。 15簡言之，使排泄尿樣品解凍，并且在PBS中洗滌3次，隨后離心。使細胞離心(cystospin) 制備物在甲醇/乙醇(3 1)中固定，并且在2x SSC/0. 5%NP-40, pH 7中在37°C下預處 理30分鐘，隨后在梯度增加的乙醇中脫水。在90°C下變性5分鐘后，使細胞與10 μ 1 AURKA 20ql3探針在37°C下雜交過夜。在0. 5x SSC/0. 1 % SDS中在65°C下洗滌5分鐘后，細胞用 DAPI進行復染并且在抗衰退溶液中進行固定。用Zeiss Axioplan 2顯微鏡計數并且捕獲 熒光信號。DNA倍數性分析。如先前所述用關于染色體3、7和17的著絲粒FISH探針(Vysis Abbott ；Park, IL)并且通過用 SAMBA 4000 系統(Ampersand Medical ；Chicago, IL)的圖像 分析通過測量核總DNA來分析間期核的倍數性。6來自切除的腎切除術樣品的正常人尿道 上皮細胞都用于測試正常人二倍體組織中的FISH探針的表現和充當陰性對照。
在用Feulgen反應染色的相鄰尿道上皮/膀胱腫瘤和膀胱癌細胞系的成對樣品的 細胞離心制備物上執行DNA倍數性測量。DNA指數計算為腫瘤細胞的平均核DNA含量與二 倍體標準(人外周血淋巴細胞)的平均核DNA含量的比。具有DNA指數為0.9-1. 2的腫瘤 分類為二倍體/近二倍體，而其中在直方圖上具有獨特峰的超過20%細胞的DNA指數超過 1. 2的腫瘤分類為非整倍體。體外轉染測定法。如先前所述使用pcDNA3野生型極光激酶A和猿猴病毒40 (SV40) 永生化人尿道上皮細胞來執行體外轉染研究。4簡言之，用不含極光激酶A的腺病毒GFP載 體轉染的細胞充當對照。僅接受顯示大于或等于80%轉染率的那些實驗用于分析。通過 western印跡分析使用抗GFP抗體且通過RT-PCR使用靶向極光激酶A-GFP融合序列的引 物，驗證極光激酶A-GFP異位表達的程度。隨后在轉染后第1-4天時收獲細胞并且用于分 析中心體拷貝數的分析、DNA總含量和極光激酶A表達水平的同時流式細胞術測量、用關于 染色體3、7和17的著絲粒FISH探針的染色體拷貝數、和軟瓊脂集落形成測定法。如先前所述對于中心體拷貝數，使甲醇固定的細胞暴露于抗-y_微管蛋白小鼠 抗體(1 2000 稀釋，Sigma Chemical Corp.，St. Louis, MO)共 1 小時。4 簡言之，使用 DAPI作為復染劑用Texas Red綴合的抗小鼠抗體(1 500稀釋，Vector Labora tories, Burlingame, CA)檢測結合的一抗。使用熒光激活細胞分選器(EPICSXL-MCL, Beckman Coulter，Inc，Miami，FL.)執 行DNA含量(碘化丙啶的紅色熒光；PI)和極光激酶A(GFP的綠色熒光)的表達水平的同時 流式細胞術分析。具有異常DNA含量的細胞群體計算為具有DNA指數< 2c和> 4c的GFP 陽性細胞數目。對于軟瓊脂集落形成測定法，用包含用GFP標記的野生型極光激酶A的腺病毒載 體或僅包含GFP的對照腺病毒感染SV40永生化尿道上皮細胞。在病毒感染后1天，將細胞 以10，000細胞/平板的濃度鋪平板在包含UM-UC-3條件培養基的軟瓊脂上。在鋪平板后 2周記錄集落數目/平板。統計分析。對于FISH的定量分析，在來自每個尿樣品的至少20個細胞中計數綠 色和紅色信號，并且記錄關于每個細胞的綠色和紅色信號數目。將包含異常極光激酶A信 號的細胞分成2個亞組，由具有低(3-4個拷貝)和高(> 4個拷貝)水平的極光激酶A基 因擴增的細胞組成。對于每個樣品，通過將具有升高水平(3個或更多拷貝)的細胞數目除 以檢查的總細胞數目，計算極光激酶A得分。極光激酶A得分> 0. 15被視為是升高的，并 且與一組20個中具有至少3個紅色FISH信號的> 3個細胞相對應。這個得分用于產生關 于7份對照和23份膀胱癌尿樣品的訓練組的ROG曲線(η = 30)。極光激酶A FISH測試的 表現在30份對照和51份膀胱癌尿樣品的測試組上進一步進行驗證(η = 81)。曲線下面 積(AUC)用于評估標記的表現。AUC等價于使案例和對照組相比較的Wilcoxon-Marm-Whi tney秩和檢驗，16并且后面一種檢驗用于衍生ρ值。對來自癌癥樣品的數據使用卡方檢驗， 以評估極光激酶A得分和腫瘤的病理學特征(例如組織學級別、生長模式和分期之間的關 系。在其中列聯表計數很小的情況下，P值通過用固定的邊緣計數模擬進行評估(P < -0. 05 被視為顯著的)。結果我們首先研究了膀胱的TCC樣品及其相鄰原位腫瘤發生前尿道上皮中的極光激酶A的表達水平。通過定量RT-PCR揭示的極光激酶AmRNA水平在相鄰尿道上皮和TCC中都 是升高的(圖1A)。極光激酶A的表達水平與腫瘤級別、分期和非整倍性相關(圖1B-D)。 與正常尿道上皮相比較，顯示與其核DNA總含量的正常二倍體的最低限度偏差并且分類為 近二倍體的低級別、淺表TCC顯示極光激酶A表達的輕微升高(約2倍)。相比之下，具有 顯著的非整倍性的高級別、侵入性TCC顯示極光激酶A表達的顯著升高(約7倍)。為了測定染色體不穩定性的程度是否與極光激酶A的過表達程度相關，我們分析 了膀胱癌細胞系中的極光激酶A表達水平和染色體拷貝數(圖2A，B)。使用極光激酶A的 表達水平，將膀胱癌細胞系分成3個組(圖2C)。第一組由不具有極光激酶A表達升高的6 個細胞系組成。第二組由具有輕微極光激酶A升高(2至5倍)的4個細胞系組成。其余 3個細胞系顯示明顯升高水平的極光激酶A(6至14倍)。使用關于所選擇的染色體(3、7、 17)的著絲粒FISH探針的染色體拷貝數分析顯示在具有明顯升高水平的極光激酶A的細胞 系中明顯增加的染色體數目(圖2D)。這些相關研究暗示通過擴增和過表達獲得的極光激酶A的功能產生在膀胱癌發 展期間的非整倍體細胞表型。通過體外轉染研究，使用SV40永生化尿道上皮細胞和包含野 生型極光激酶A-GFP插入片段的腺病毒構建體驗證這個假設。經轉染的尿道上皮細胞顯示 與中心體的擴增和非整倍性的發展相關的明顯升高的異位表達的極光激酶A，以及通過存 在中心體信號、染色體拷貝數、DNA總含量和在軟瓊脂上的集落形成能力的獲得的數目增加 而揭示的經轉化的細胞表型(圖3A-D)。為了測定極光激酶A是否可以用作用于膀胱癌檢測的標記，我們使用FISH技術就 極光激酶A的擴增分析具有膀胱癌的患者的排泄尿樣品(圖4A)。分析以不知情方式進行； 即，對FISH結果評分的觀察者不知道樣品得自具有膀胱癌的患者還是未受影響的對照。初 始測試在來自具有膀胱癌的23個患者和7個健康對照的排泄尿樣品的訓練組上執行。它揭 示在具有膀胱癌的所有23個患者中至少低水平的基因擴增(3-4個拷貝)。來自具有低級 別TCC的患者的排泄尿樣品包含具有極光激酶A的3-4個拷貝的原代細胞，而來自具有高 級別TCC的患者的基本比例的細胞(> 20% )具有> 4個拷貝的極光激酶A(圖4B)。在一 個對照中檢測出具有極光激酶A信號的3個拷貝的2個細胞。在其余6個對照的尿樣品中 未檢測出極光激酶A的異常拷貝數。來自使用> 15%細胞具有極光激酶A的至少3個拷貝 作為關于測試陽性的截止的訓練組的數據分析得到1. 0的特異性、0. 91的靈敏度和0. 997 的 ROCAUC (P = IxliT4)。在由來自51個膀胱癌患者和30個健康對照的排泄尿樣品組成的其他不知情的測 試組上驗證用于膀胱癌的極光激酶A FISH測試的表現。使用用于測試的陽性的相同截止 點分析數據，即> 15%細胞具有極光激酶A的至少3個拷貝。測試在具有膀胱癌的患者的 44份樣品中是陽性的。在具有膀胱癌的7個患者中未鑒定出異常極光激酶A基因拷貝數。 在30份對照樣品中的5份中，鑒定出具有極光激酶A基因的3個拷貝的1-3個細胞。測試 組的分析得到1. 0的特異性、0. 84的靈敏度和0. 925的ROC AUC(ρ = 6. 79x10-")。在關于 具有膀胱癌的74個患者和37個健康對照的排泄尿中的細胞的定量FISH分析結果概括于 圖5中。如通過極光得分測量的極光激酶A擴增的程度與腫瘤的組織學級別強相關。高組 織學級別(級另U 3)的膀胱癌具有比低級別(級另Ij 1-2)腫瘤(0. 13 + 0. 15)明顯更高的極 光激酶A得分(0.60 士0.29)。在得分和腫瘤生長模式(乳頭狀與非乳頭狀)、或分期(淺表與侵入)之間不存在顯著關聯(數據未顯示)。討論根據早期公開的那些的目前發現提供了支持極光激酶A擴增過表達是膀胱癌發 生中的早期事件的強烈證據，這與中心體擴增和非整倍體基因組含量的發展相關。這些觀 察假定就我們較早報告的發現而言的重要生物學意義極光激酶A促進腫瘤抑制蛋白質 P53的降解，并且具有極光激酶A的升高表達的人膀胱腫瘤樣品揭示極低的細胞p53含量， 模擬關鍵的腫瘤抑制途徑的喪失。17在本文背景中相關提及特定腫瘤抑制蛋白質(最顯著地是P53)的喪失或滅活突 變引起中心體擴增18，并且P53突變和細胞周期蛋白E過表達的伴隨發生與膀胱癌中的染 色體不穩定性和中心體擴增強相關。19極光激酶A和粘著斑支架蛋白質HEFl之間的相互 作用和反饋調節的近期發現指出，極光激酶A的升高表達可能協同地干擾控制細胞附著、 遷移和細胞存活的整聯蛋白依賴性信號過程，連同表現為非整倍性的染色體不穩定性的誘 導。2°這些觀察不僅提供關于極光激酶A在尿道上皮細胞的惡性轉化中的關鍵作用的強烈 證據，還暗示它可能是用于膀胱癌的新生物標記。總的來說，我們的數據指出極光激酶A在尿道上皮細胞中過表達時，引起中心體 擴增和染色體的錯誤分離，導致非整倍性和經轉化的表型。在具有膀胱癌的患者的排泄尿 樣品上的目前FISH研究連同先前公開的數據指出，極光激酶A的過表達和擴增在膀胱癌 中是頻繁的，并且可以在來自排泄尿樣品的脫落尿道上皮細胞中檢測出。關于極光激酶A 基因和α-衛星著絲粒染色體20DNA的雙色FISH探針以高特異性和靈敏度檢測膀胱癌。 此外，極光激酶A擴增的程度與高級別臨床侵略性的膀胱癌相關。這暗示關于在尿中通過 FISH技術的這種極光激酶A拷貝數的測試是用于膀胱癌的有希望的非侵入性測試。此外，就我們所知，我們的工作是首先超越相關研究的，暗示通過擴增和過表達獲 得的極光激酶A的功能產生在膀胱癌發展期間的非整倍體細胞表型，以顯示極光激酶A在 尿道上皮細胞中的過表達引起中心體擴增和染色體的錯誤分離，導致非整倍性和經轉化的 表型。本文公開且請求保護的所有方法可以根據本公開內容無需過度實驗而進行且完 成。盡管本發明的組合物和方法已就優選實施方案而言進行描述，但對于本領域技術人員 顯而易見的是，可以對本文描述的方法和方法的步驟或步驟的順序應用變化，而不背離本 發明的概念、精神和范圍。更具體而言，顯而易見的是化學和生理學相關的特定試劑可以取 代本文描述的試劑，同時仍達到相同或相似結果。對于本領域技術人員顯而易見的所有此 類相似取代物和修飾被認為在如由附加權利要求限定的本發明的精神、概念和范圍內。參考文獻下述參考文獻特別通過引用合并入本文，至它們提供本文描述的那些的補充的示 例性操作或其他細節的程度。1.Perkins AS， Stern DF.Molecular biology of cancer !oncogenes.In Cancer Principles and practices of oncology. 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權利要求
檢測患者中的膀胱癌的方法，其包括從所述患者的尿中分離膀胱細胞；使所述膀胱細胞與經標記的DNA探針雜交，其中所述探針識別極光激酶A基因的至少部分，以產生與所述經標記的DNA探針雜交的膀胱細胞樣品；和計數所述樣品中的膀胱細胞數目、所述樣品中的每個膀胱細胞中的極光激酶A基因拷貝數、和所述樣品中具有極光激酶A基因的至少拷貝數第一閾值的膀胱細胞數目。
2.權利要求1的方法，其中極光激酶A基因的拷貝數第一閾值是3。
3.權利要求1的方法，其中計數進一步包括計數具有極光激酶A基因的至少拷貝數第 二閾值的膀胱細胞數目，其中所述拷貝數第二閾值大于所述拷貝數第一閾值。
4.權利要求3的方法，其中極光激酶A基因的拷貝數第二閾值是5。
5.權利要求1的方法，如果大于或等于第一閾值百分比的膀胱細胞具有極光激酶A基 因的至少拷貝數第一閾值，那么所述方法進一步包括假定所述患者具有膀胱癌。
6.權利要求5的方法，其中第一閾值百分比是15%。
7.權利要求5的方法，如果大于或等于第二閾值百分比的膀胱細胞具有極光激酶A基 因的至少拷貝數第一閾值，其中第二閾值百分比大于第一閾值百分比，那么所述方法進一 步包括假定所述患者具有侵略性膀胱癌。
8.權利要求7的方法，其中第一閾值百分比是15%，并且第二閾值百分比是20%。
9.權利要求1的方法，其中經標記的DNA探針包括AURKA20ql3。
10.權利要求1的方法，其中極光激酶A基因包括選自SEQID NO :1和SEQ ID NO 2 的DNA序列。
全文摘要
公開了檢測患者中的膀胱癌的方法，其包括從患者的尿中分離膀胱細胞；使膀胱細胞與經標記的DNA探針雜交，其中探針識別極光激酶A基因的至少部分，以產生與經標記的DNA探針雜交的膀胱細胞樣品；并且計數樣品中的膀胱細胞數目、樣品中的每個膀胱細胞中的極光激酶A基因拷貝數、和樣品中具有極光激酶A基因的至少拷貝數第一閾值的膀胱細胞數目。
文檔編號C12Q1/68GK101932727SQ200880123846
公開日2010年12月29日 申請日期2008年12月12日 優先權日2008年1月3日
發明者B·切爾尼亞克, H·B·格羅斯曼, S·薩伯拉塔 申請人:得克薩斯大學體系董事會