專利名稱：一種體細胞核移植中的電融合方法
技術領域：
本發明涉及細胞核融合方法，具體涉及一種體細胞核移植中的電融合方法。
背景技術：
細胞核移植(nuelea rtransfer 或 nuelear transplantation)技術也即廣為人知的動物克隆技術。通常是通過顯微操作的方法，將供體細胞的細胞核注入預先去核的成熟卵母細胞或早期合子內，形成一個新的核質重組體(即重構卵)，移入的核在受體胞質的作用下，發生發育程序重編Oteprogramming)，使得核質重組體與正常受精卵一樣，經細胞分裂、分化并在母體內發育成一個新的個體(張運海，2005)，其獲得的個體與親本具有相同遺傳性狀。將供體細胞的細胞核導入到卵母細胞質中，這個過程稱之為融合。最早使用的融合方法是使用滅活的仙臺病毒(HVJ) (McGrath and Solter, 1983)介導細胞融合融合,獲得了成功，但是效果很不穩定而且毒性大。Willadsen等(1986)在利用胚胎細胞克隆羊試驗中采用的是直流電介導融合的方法，簡便而且高效，電融合技術也是從這個時候開始發展起來的，其原理是通過電流的刺激使緊密接觸的細胞膜磷脂雙分子層發生結構改變，進而形成細胞間的孔道，隨著孔道逐漸擴大使胞質交融在一起。目前已經成為動物克隆中普遍采用的融合方法。然而，由于技術操作上的差異和供體細胞類型等因素的影響導致融合率不穩定，是影響克隆效率的重要因素。在現有技術中普遍的操作是重構卵放入融合槽內后，使供體細胞-受體卵細胞膜接觸面與電極平行后即施加不同參數的的直流電脈沖誘導融合，而沒有考慮體細胞朝向正極或負極對融合效率的影響，從而使融合效率很不穩定。

發明內容
本發明的發明目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種融合效率高的電融合方法。為實現上述發明目的，本發明采用如下技術方案，一種體細胞核移植中的電融合方法，包括以下步驟SI、將恢復后的重構卵分批轉移到融合液中平衡；S2、用融合激活液洗滌重構卵；S3、將洗滌后的重構卵放入裝有融合液的融合槽內，調整供體細胞-受體卵細胞膜接觸面與電極平行并使供體細胞一端朝向電極的負極，用融合儀施加直流電脈沖誘導融合同時激活重構卵；S4、將融合激活后的重構卵用胚胎培養液洗滌，然后轉入培養箱中，在礦物油覆蓋的胚胎培養液中或輔助激活液中融合；該方法在融合的過程中，將供體細胞一端朝向電極的負極，提高了融合效率。所述融合激活液中含有含有濃度為O. 2 W O. 5mmol/L甘露醇、濃度為O. 05 ^ O. 2mmol/L CaCl2 · 2H20、濃度為 0· 05 …O. 2mmol/L MgCl2 · 6H20、濃度為0. 5 ^ 2mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、濃度為O. 01%聚乙烯醇(W/V)。所述步驟SI中平衡的時間為1-5分鐘。所述步驟SI中每批放入裝有融合液的融合槽內的重構卵的數量為5-8個。所述步驟S3中融合激活參數電場強度為80-100v/mm，脈沖時間為80-100 μ S，實施2-3次電脈沖。
所述步驟S4中培養箱內的溫度為38. 5°〇或39°〇。所述步驟S4中培養箱內的C02的飽和度為5%。本發明的有益效果，采用本融合方法能顯著提高融合效率。
具體實施例方式將供體細胞的細胞核注入到去核的卵母細胞以后形成重構卵，因為這個過程對卵母細胞是一個傷害的過程，需放置于培養箱內，待卵母細胞胞質恢復30min后利于后面的融合操作，即恢復過程。每批將5-8個恢復后的重構卵轉移到融合液中平衡2min，當換一種液體時，都需預先放入相應的液體中，相當于一個適應的過程，即平衡。用融合激活液洗滌3遍，再將洗滌后的重構卵放入已經鋪滿融合液的融合槽內，用拉制的很細的實心玻璃針撥動重組卵，使供體細胞-受體卵細胞膜接觸面與電極平行同時使供體細胞一端都朝向電極的負極，用BLS-150B融合儀(匈牙利)施加不同融合參數的的直流電脈沖誘導融合同時激活，其中融合激活參數為電場強度為80-100v/mm，電脈沖時間為80-100 μ s，實施2-3次電脈沖。接著將重構卵用培養液洗滌3遍，立即將洗滌后的重構卵轉入礦物油覆蓋的胚胎培養液中或輔助激活液中，放置入38. 5°C或39°C，5%C02飽和度的培養箱中培養，4h后在體視顯微鏡下判定融合。其中融合激活液中含有含有濃度為O. 2 ^ O. 5mmol/L 的甘露醇(Mannitol )、濃度為 O. 05 ^ O. 2mmol/L 的 CaCl2 · 2H20、濃度為O. 05 O. 2mmol/L 的Mg Cl2 ·6Η20、濃度為 O. 5 …2mmol/L 的 4-輕乙基喊嚷乙橫酸(HEPES)、濃度為O. 01% (W/V)的聚乙烯醇(PVA)。經多次試驗，得到如表I的結果表I、融合時體細胞朝向對核移植效率的影響
權利要求
1.一種體細胞核移植中的電融合方法，其特征在于，包括以下步驟 51、將恢復好的重構卵分批轉移到融合激活液中平衡； 52、用融合激活液洗滌重構卵； 53、將洗滌后的重構卵放入裝有融合激活液的融合槽內，調整供體細胞-受體卵細胞膜接觸面使之與電極平行并使供體細胞一端都朝向電極的負極，用融合儀施加直流電脈沖誘導融合同時激活重構卵； 54、將融合激活后的重構卵用胚胎培養液洗滌，然后轉入培養箱中，在礦物油覆蓋的胚胎培養液中或輔助激活液中融合。
2.根據權利要求I所述的體細胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述融合激活液中含有含有濃度為O. 2 μ O. 5mmol/L甘露醇、濃度為O. 05 ^ O. 2mmol/L CaCl2 · 2H20、濃度為O. 05 ^ O. 2mmol/L MgCl2 · 6H20、濃度為O. 5 ^ 2mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、濃度為O. 01%聚乙烯醇(W/V)。
3.根據權利要求I所述的體細胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述步驟SI中平衡的時間為1-5分鐘。
4.根據權利要求I所述的體細胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述步驟SI中每批移入融合液平衡的重構卵的數量為5-8個。
5.根據權利要求I所述的體細胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述步驟S3中融合激活參數電場強度為80-100v/mm，脈沖時間為80-100 μ S，實施2_3次電脈沖。
6.根據權利要求I所述的體細胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述步驟S4中培養箱內的溫度為38. 5°〇或39°〇。
7.根據權利要求I所述的體細胞核移植中的電融合方法，其特征在于，所述步驟S4中培養箱內的C02的飽和度為5%。
全文摘要
本發明公開了一種體細胞核移植中的電融合方法，包括以下步驟S1、將恢復后的重構卵分批轉移到融合液中平衡；S2、用融合激活液洗滌重構卵；S3、將洗滌后的重構卵放入裝有融合液的融合槽內，調整供體細胞-受體卵細胞膜接觸面與電極平行并使供體細胞一端朝向電極的負極，用融合儀施加直流電脈沖誘導融合同時激活重構卵；S4、將融合激活后的重構卵用胚胎培養液洗滌，然后轉入培養箱中，在礦物油覆蓋的胚胎培養液中或輔助激活液中融合；該方法在融合的過程中，將供體細胞一端朝向電極的負極，提高了融合效率。
文檔編號C12N15/873GK102876719SQ20121041970
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月27日 優先權日2012年10月27日
發明者吳珍芳, 周榮, 石俊松 申請人:廣東溫氏食品集團有限公司