專利名稱：一種動物體細胞核移植中的融合方法
技術領域：
本發明涉及動物克隆技術領域，具體涉及一種克隆過程中動物體細胞核移植的融合方法。
背景技術：
1997年，世界首例體細胞克隆綿羊“多莉(Dolly) (ffiImut et al，1997)”誕生，在世界上第一次否定了“在體細胞核內基因組經歷不可逆”這一傳統觀念，揭示了高度分化的體細胞核在去核(去染色體)卵胞質中能重新編程(Reprogramming),宣告人類已經進入高等動物體細胞可以進行無性繁殖(克隆)的新時代，在國際社會引起了轟動，由此體細胞克隆成為一個全世界科學家研究的熱點。動物克隆是指動物不經過有性生殖的方式而直接獲得與親本具有相同遺傳性狀后代的過程，包括孤雌生殖、卵裂球分離與培養、胚胎分割以 及細胞核移植等(桑潤滋，2002)。而產生克隆動物的方法則稱之為動物克隆技術。目前，廣為人知的動物克隆技術實際上就是指細胞核移植技術。細胞核移植(nuelear transfer或nuelear transplantation)通常是指通過顯微操作的方法,將供體細胞的細胞核注入預先去核的成熟卵母細胞或早期合子內，形成一個新的核質重組體，移入的核在受體胞質的作用下，發生發育程序重編Oteprogramming)，使得核質重組體與正常受精卵一樣，經細胞分裂、分化并在母體內發育成一個新的個體(張運海，2005 )。手工克隆(handmade cloning, HMC)技術是一項不需要顯微操作儀操作的克隆技術。在體視顯微鏡下用特制的切割刀直接切割去核，然后將兩個不含有細胞核的半卵與一個供體細胞靠近并施以直流電脈沖使其融合，最后將重構胚單個培養。因為此法需要去除透明帶，并用兩個半卵胞質體和供體細胞融合，因而也被稱為去透明帶雙半卵法(Peura，1998)。同時又因為此法的整個過程靠手工操作即可完成并且不需一些精密的儀器，Vajta等(Vajta et al，2001)將其稱之為手工克隆。將供體細胞的細胞核導入到卵母細胞質中，這個過程稱之為融合。最早使用的融合方法是使用滅活的仙臺病毒(HVJ) (McGrath and Solter, 1983)介導細胞融合融合,獲得了成功，但是效果很不穩定而且毒性大。Willadsen等(1986)在利用胚胎細胞克隆羊試驗中采用的是直流電介導融合的方法，簡便而且高效，電融合技術也是從這個時候開始發展起來的，其原理是通過電流的刺激使緊密接觸的細胞膜磷脂雙分子層發生結構改變，進而形成細胞間的孔道，隨著孔道逐漸擴大使胞質交融在一起。目前已經成為動物克隆中普遍采用的融合方法。然而，由于供體細胞的體積較小，與卵母細胞的接觸面積小，會影響供體細胞與卵母細胞的融合率。特別是在手工克隆操作中，卵母細胞一般采用切割法去核，會去除約1/3胞質，由于切除胞質過多，采用的是雙半卵融合，即先將一枚半卵與一枚供體細胞粘合，再放入電融合槽交流電場定位后通過手工撥動使體細胞對正后融合，然后融合后的半卵再與另一枚半卵進行融合。在實際操作過程中存在幾個問題1、卵母細胞變小也會影響操作，從而影響與供體細胞的融合；2、做一次融合時是靠交流電定位后貼于融合槽一側后再撥正體細胞，操作上會使半卵發散；3、這種融合方法先融合供體細胞，操作相對麻煩，若后來判融合時卵發散，會浪費更大的工作量。

發明內容
本發明的發明目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種操作簡單、融合效果好的動物體細胞核移植的融合方法。為實現上述發明目的本發明采用如下技術方案，一種動物體細胞核移植中的融合方法，包括以下步驟(I)、將兩枚半卵細胞放入植物凝集素濃度為0. 5-5mg/ml的操作液中粘合形成卵-卵細胞對；(2)、將粘合好的卵-卵細胞對放入融合液中平衡1-3分鐘； (3)、將平衡后的卵-卵細胞對放入電融合槽中電融合，并施加交流場對卵-卵細胞對進行瞬間定位；(4)、將融合好的卵-卵細胞對移入含有供體細胞的操作液中與供體細胞粘合形成體-卵細胞；(5)、將粘合好的體-卵細胞移入融合激發液中平衡1-3分鐘，再移入到融合槽中進行電融合同時激活。本發明所采用的方法先將兩個半卵細胞融合，再將融合后的卵-卵細胞與供體細胞融合，增大卵細胞與供體細胞的接觸面積，操作上更加簡單。本發明進一步改進在于，在進行步驟(I)前先將所述兩枚半卵細胞分別放入含有植物凝集素的操作液中3-8秒。本發明的優選方式，步驟(2)中所述融合液中，含有濃度為0. 2 w 0. 5mmol/L的甘露醇、濃度為0. 5 - 2mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、以及濃度為0. 01g/L的聚乙烯醇。本發明的優選方式，步驟(5)中所述融合激發液中含有濃度為0. 2…0. 5mmol/L甘露醇、濃度為 0. 05 ⑵ 0. 2mmol/L CaCl2 2H20、濃度為 0. 05 ⑵ 0. 2mmol/L Mg Cl2 6H20、濃度為0. 5 - 2mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、濃度為0. 01g/L聚乙烯醇。本發明的有益效果先將兩枚半卵粘合，粘合好的半卵對放入融合液中平衡數秒鐘，再放入電融合槽中交流電瞬間定位，其接觸面會自動與電場方向垂直，然后再施加直流電誘導融合。將融合好的半卵細胞對再與供體細胞進行融合激活，由于是融合了雙半卵，體積較大會更方便操作，無需施加交流電場，直接以圓頭玻璃針撥正體細胞即可。
具體實施例方式本發明所述的一種動物體細胞核移植中的融合方法，其特征在于，包括以下步驟(I)、將兩枚半卵細胞放入含有0.5_5mg/ml植物凝集素的操作液中粘合形成卵-卵細胞對；(2)、將粘合好的卵-卵細胞對放入融合液中平衡1-3分鐘；(3)、將平衡后的卵-卵細胞對放入電融合槽中電融合，并施加交流場對卵-卵細胞對進行瞬間定位；(4)、將融合好的卵-卵細胞對移入含有供體細胞的操作液中與供體細胞粘合形成體-卵細胞；操作液中植物凝集素濃度為0. 5-5mg/ml的；(5)、將粘合好的體-卵細胞移入融合激發液中平衡1-3分鐘，再移入到融合槽中進行電融合同時激活。上述步驟(2)中所述融合液中，含有濃度為0. 2…0. 5mmol/L的甘露醇、濃度為0. 5 - 2mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、濃度為0. 01g/L的聚乙烯醇。上述步驟(5)中所述融合激發液中含有濃度為0. 2 w0. 5mmol/L甘露醇、濃度為 0. 05 w 0. 2mmol/L CaCl2 2H20、濃度為 0. 05 …0. 2mmol/L Mg C12*6H20、濃度為0. 5 - 2mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸、濃度為0. 01g/L聚乙烯醇。本發明的進一步改進在于，在進行步驟(I)前先將所述兩枚半卵細胞分別放入含、有植物凝集素的操作液中3-8秒。
權利要求
1.ー種動物體細胞核移植中的融合方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、將兩枚半卵細胞放入植物凝集素濃度為O.5-5mg/ml的操作液中粘合形成卵-卵細胞對； (2)、將粘合好的卵-卵細胞對放入融合液中平衡1-3分鐘； (3)、將平衡后的卵-卵細胞對放入電融合槽中電融合，并施加交流場對卵-卵細胞對進行瞬間定位； (4)、將融合好的卵-卵細胞對移入含有供體細胞的操作液中與供體細胞粘合形成體-卵細胞； (5)、將粘合好的體-卵細胞移入融合激發液中平衡1-3分鐘，再移入到融合槽中進行電融合同時激活。
2.根據權利要求I所述的動物體細胞核移植中的融合方法，其特征在于，在進行步驟(O前先將所述兩枚半卵細胞分別放入含有植物凝集素的操作液中3-8秒。
3.根據權利要求I所述的動物體細胞核移植中的融合方法，其特征在于，步驟(2)中所述融合液中，含有濃度為O. 2⑷O. 5mmol/L的甘露醇、濃度為O. 5 - 2mmol/L的4-羥こ基哌嗪こ磺酸、以及濃度為O. Olg/L的聚こ烯醇。
4.根據權利要求I所述的動物體細胞核移植中的融合方法，其特征在于，步驟(5)中所述融合激發液中含有濃度為O. 2⑷O. 5mmol/L甘露醇、濃度為O. 05 - O. 2mmol/LCaCl2 · 2H20、濃度為 O. 05 ^ O. 2mmol/LMg Cl2 · 6H20、濃度為 O. 5 ^ 2mmol/L 4-羥こ基哌嗪こ磺酸、濃度為O. 01g/L聚こ烯醇。
全文摘要
本發明公開了一種動物體細胞核移植中的融合方法，包括以下步驟(1)將兩枚半卵細胞放入植物凝集素濃度為0.5-5mg/ml的操作液中粘合形成卵-卵細胞對；(2)將粘合好的卵-卵細胞對放入融合液中平衡1-3分鐘；(3)將平衡后的卵-卵細胞對放入電融合槽中電融合，并施加交流場對卵-卵細胞對進行瞬間定位；(4)將融合好的卵-卵細胞對移入含有供體細胞的操作液中與供體細胞粘合形成體-卵細胞；(5)將粘合好的體-卵細胞移入融合激發液中平衡1-3分鐘，再移入到融合槽中進行電融合同時激活。本發明所采用的方法先將兩個半卵細胞融合，再將融合后的卵-卵細胞與供體細胞融合，增大卵細胞與供體細胞的接觸面積，操作上更加簡單。
文檔編號C12N15/873GK102703511SQ20121019440
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月10日 優先權日2012年6月10日
發明者吳珍芳, 周秀, 周榮, 石俊松, 羅綠花 申請人:廣東溫氏食品集團有限公司