專利名稱：一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法
技術領域：
本發明涉及蛋白酶的提純領域，特別是涉及一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法。
背景技術：
木瓜蛋白酶(Papain)簡稱木瓜酶，又稱為木瓜酵素，酶學編號EC3.4.22.2，是利用未成 熟的番木瓜果實中的乳汁，采用現代生物工程技術提煉而成的純天然生物酶制品，它是一 類含巰基( SH)蛋白酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，其廣泛的特異性對動植物蛋白、多肽、 酯、酰胺等有較強的水解能力，能催化各種蛋白質，水解成一系列長短不一的短肽或氨基 酸，還能把蛋白水解物合成為類蛋白質，由于它的熱穩定性好及天然衛生安全等特點，廣 泛應用于食品、皮革、紡織、日化和制藥行業，提高產品質量與檔次，降低成本。目前，木瓜蛋白酶的提取純化主要是采用沉淀法，但是這種方法工藝繁瑣，產品中仍 然混有其它的蛋白酶，純度不高，不能達到制藥工業的需求。隨著人們對純度和安全性提 出進一步的要求，色譜技術應用于木瓜蛋白酶的純化，如離子交換色譜、親和色譜，該類 填料特異性高，純化倍數高，但分離速度受粒間擴散和低的軸向速率限制，壓降大，分離 時間長，處理量小，不能使用高的加料速度。而膜分離是一種根據分子的大小進行分離的 技術，特點是表面積大、擴散路徑短、操作壓低、處理量大，但傳統膜分離技術只有分離 相對分子質量相差IO倍以上的物系，不能滿足生化分離的需要。 發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，該方 法快速、簡便、有效、適用于規模化操作。本發明的一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，包括(1) 尼龍膜的活化改性尼龍膜先在25。C 1 MHCl中水解24h，然后浸入20 ml甲 醛溶液，加入0.2 ml 85wt。/Q磷酸，于60'C反應7h，40 5(TC熱水洗滌，再浸入10ml 1 wt% 2wt。/。的殼聚糖溶液中，室溫反應lh后，轉入烘箱60 90。C烘干1 h，分別用1.0vo1。/0 5.0 voP/。醋酸和去離子水洗滌；(2) 尼龍膜螯合金屬銅離子將上述尼龍膜浸入40 55ml的環氧氯丙垸、氫氧化鈉 和硼氫化鈉的混合溶液，室溫反應1 3 h，再加入23 ml環氧氯丙垸和46 m 12M的氫氧化 鈉溶液，60"C恒溫振蕩反應8 18h，洗滌后再將膜浸入114.4ml的碳酸鈉、0.14g硼氫化 鈉和86mmo1的偶聯劑的混合溶液，50 70 。C反應10 15 h，浸入500ml 50 150ppm硫酸銅的溶液，反應l 3h，得到螯合銅離子的金屬親和膜；(3) 蛋白酶的吸附洗脫將金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動泵送入緩沖液 和洗脫液，以0.05 M pH=8.5的Tris HCl緩沖液平衡15 min，流速2.0ml/min;接著送入 100ml0.25 2.0mg/mlpH值二5.0 10.0的木瓜蛋白酶，其中氯化鈉濃度為0 2.0M，反應 10 120min進行吸附，然后以Tris HCl緩沖液洗去未吸附上的蛋白質，最后以洗脫劑進 行洗脫，得到目標蛋白質木瓜蛋白酶；(4) 測試酶活性和蛋白質含量，計算純化倍數。所述的步驟(1)中殼聚糖溶液是以0.5 vol% 2.0 vol.。/。醋酸溶解。 所述的步驟(2)中環氧氯丙烷、氫氧化鈉與硼氫化鈉的混合溶液中，三者的濃度為l 3M，體積比為0.9 1.1 : 8 11 : 0.003 0.005。所述的步驟(2)中偶聯劑為亞氨基二乙酸(IDA)，其與碳酸鈉、硼氫化鈉的用量比為0.8 1.0 : 10 12 : 0.001 0.003。所述的步驟(2)中洗滌分別用去離子水和4.0vol。/。 8.0vol。/。的醋酸洗滌。 所述的步驟(3)最佳提取純化條件為反應時間為60min， pH = 8.5,木瓜蛋白酶的吸附濃度為2.0 mg/ml，離子強度為0 M的氯化鈉溶液，即木瓜蛋白酶溶液中不含氯化鈉溶液。所述的步驟(3)中洗脫劑為0.5 1.5M的硫氰酸鈉。 有益效果(1) 本發明快速、簡便、有效、適用于規模化操作。(2) 原料來源廣泛，純化的蛋白酶的倍數和酶活性較高；


圖1為不同反應時間的木瓜蛋白酶溶液吸附曲線；圖2為不同pH的木瓜蛋白酶溶液吸附曲線；圖3為不同濃度木瓜蛋白酶溶液的吸附曲線；圖4為不同離子強度的木瓜蛋白酶溶液吸附曲線；圖5為利用金屬親和螯合膜吸附木瓜蛋白酶的洗脫曲線。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而 不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。實施例1尼龍膜的活化和鍵合殼聚糖進行改性，具體步驟如下(1) 尼龍膜先在25'C lMHCl中水解24h，然后用甲醛進行活化。IO張水解的尼龍 膜浸入20ml甲醛溶液(〉36.5wt.%)，加入0.2 ml磷酸(85wt.%)，于60。C反應7h， 40 50。C熱水水洗多次。(2) 將上述甲醛活化的尼龍膜，浸入10ml質量分數為1.5%的殼聚糖溶液(以lvol.% 醋酸溶解)，室溫反應lh，然后轉入8(TC烘箱，lh后取出，分別用lvol.n/。醋酸和去離子 水洗去未反應的殼聚糖。尼龍膜上的殼聚糖含量可按茚三酮的方法進行測試。實施例2改性后的尼龍膜螯合金屬銅離子，具體步驟如下(1 )上述改性后的10張尼龍膜浸入4.6 ml環氧氯丙垸、46 ml 2M的氫氧化鈉和0.017 g硼氫化鈉混和液中，室溫反應2h后，再直接向混和液加入23ml還氧氯丙烷、46ml2M 的氫氧化鈉，60'C反應12h，用去離子水洗多次。(2) 將上述結合環丙烷的膜浸入含有10ml 8.6M的亞氨基二乙酸(IDA) 、 0.14g硼 氫化鈉和114.4 ml 2 M的碳酸鈉的混合溶液，60'C恒溫振蕩反應12 h，用去離子水、5 vol.% 醋酸和去離子水洗多次。(3) 將上述的膜浸入500ml 100 ppm的硫酸銅溶液，反應2h，就可得到螯合銅離子 的金屬膜。實施例3用金屬螯合膜吸附木瓜蛋白酶，進行條件優化，具體步驟如下(1) 反應時間的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入100ml 1.0mg/ml木瓜蛋白酶的Tris HCl溶液(pH二8.5)，流速為2.0ml/min，分別反應10min， 20 min, 30min, 40min, 50min， 60min， 80min和100min，進行吸附，測定木瓜蛋白酶 吸附的量。實驗結果如圖l，最適的反應時間選擇在60min。(2) 反應pH的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入100ml 不同pH值的1.0 mg/ml木瓜蛋白酶的Tris—HC1溶液，循環反應2 h，流速為2.0 ml/min， 加入木瓜蛋白酶的Tris HCl溶液的pH值分別為5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0， IO.O進行吸附， 測定木瓜蛋白酶吸附的量。實驗結果如圖2，最適的反應pH選擇在7.0 8.0。(3) 反應起始木瓜蛋白酶溶液濃度的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜 橋，以蠕動泵送入從100ml 0.25 mg/ml到2.0 mg/ml濃度不等的木瓜蛋白酶反應液，循環 反應2h，流速為2.0 ml/min，測定木瓜蛋白酶吸附的量。實驗結果如圖3，最佳吸附濃度 為2.0mg/ml的木瓜蛋白酶反應液。(4) 反應離子強度的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送 入含有不同量氯化鈉的100ml 1.0 ppm的木瓜蛋白酶溶液，循環反應2 h，流速為2.0 ml/min，所加入的氯化鈉濃度為0， 0.25， 1.0， 1.5， 2.0M (即離子強度)，測定木瓜蛋白 酶吸附的量。實驗結果如圖4，最佳離子強度為OM的氯化鈉溶液(即不含氯化鈉溶液)。實施例4用l.OM的硫氰酸鈉溶液洗脫吸附木瓜蛋白酶的膜，具體步驟如下 將10張吸附木瓜蛋白酶的膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動泵送入l.OM的硫氰酸鈉溶液，流速為2.0 ml/min，進行洗脫，測定木瓜蛋白酶洗脫的量，得到木瓜蛋白酶的活性保留率和洗脫率都在95%以上。實施例5螯合膜組成膜堆對木瓜蛋白酶進行分離純化包括如下步驟10張上述方法制備的金屬螯合膜上疊成膜堆，作為分離介質，放入一種過濾容器膜橋， 以分離木瓜蛋白酶。以蠕動泵送入緩沖液和洗脫液等。首先以0.05MTris—HCl緩沖液(pH 8.5)平衡15min，流速1.0ml/min;接著送樣，35ml的1.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，然后 以0.05 MTris HCl緩沖液(pH 8.5)洗去未吸附上的蛋白質。最后以0.05MTris—HC1緩沖 液(pH8.0)配制的l.OMNaSCN.進行洗脫，得到目標蛋白質木瓜蛋白酶，其純化倍數為 10.2。實施例6精確稱取一定量按上述方法制備的金屬螯合膜，置于0.05M，不同pH值的緩沖液配 制的木瓜蛋白酶溶液中，室溫震蕩不同時間后，測量吸附前后蛋白質溶液在280nm下的吸 光度，按下式計算吸附量《=(Ci隱Ct)Ks/mq是吸附在單位膜量上的銅離子量(mg/g); Ci和Ct是吸附前和吸附后硫酸銅溶液的濃 度；VS是硫酸銅溶液的體積；m是反應的膜的質量。
權利要求
1. 一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，包括(1)尼龍膜的活化改性尼龍膜先在25℃1M HCl中水解24h，然后浸入20ml甲醛溶液，加入0.2ml 85wt.％磷酸，于60℃反應7h，40～50℃熱水洗滌，再浸入10ml 1wt％～2wt％的殼聚糖溶液中，室溫反應1h后，轉入烘箱60～90℃烘干1h，分別用1.0vol％～5.0vol％醋酸和去離子水洗滌；(2)尼龍膜螯合金屬銅離子將上述尼龍膜浸入40～55ml的環氧氯丙烷、氫氧化鈉和硼氫化鈉的混合溶液，室溫反應1～3h，再加入23ml環氧氯丙烷和46ml 2M的氫氧化鈉溶液，60℃恒溫振蕩反應8～18h，洗滌后再將膜浸入114.4ml的碳酸鈉、0.14g硼氫化鈉和86mmol的偶聯劑的混合溶液，50～70℃反應10～15h，浸入500ml 50～150ppm硫酸銅的溶液，反應1～3h，得到螯合銅離子的金屬親和膜；(3)蛋白酶的吸附洗脫將金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動泵送入緩沖液和洗脫液，以0.05M pH＝8.5的Tris～HCl緩沖液平衡15min，流速2.0ml/min；接著送入100ml0.25～2.0mg/ml pH值＝5.0～10.0的木瓜蛋白酶，其中氯化鈉濃度為0～2.0M，反應10～120min進行吸附，然后以Tris～HCl緩沖液洗去未吸附上的蛋白質，最后以洗脫劑進行洗脫，得到目標蛋白質木瓜蛋白酶；(4)測試酶活性和蛋白質含量，計算純化倍數。
2. 根據權利要求1所述的采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的 步驟(1)中殼聚糖溶液是以0.5 vol.% 2.0 vo"/。醋酸溶解。
3. 根據權利要求1所述的采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的 步驟(2)中環氧氯丙烷、氫氧化鈉與硼氫化鈉的混合溶液中，三者的濃度為1 3 M，其體積比為0.9 1.1 : 8 11 : 0.003 0.005。
4. 根據權利要求1所述的采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的步驟(2)中偶聯劑為亞氨基二乙酸IDA,其與碳酸鈉、硼氫化鈉的用量比為0.8 1.0 : 10 12: 0.001 0.003。
5. 根據權利要求1所述的采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的 步驟(2)中洗滌分別用去離子水和4.0voiy。 8.0voin/。的醋酸洗滌。
6. 根據權利要求1所述的釆用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的步驟(3)最佳提取純化條件為反應時間為60min， pH=8.5，木瓜蛋白酶的吸附濃度為 2.0mg/ml，離子強度為OM的氯化鈉溶液，即木瓜蛋白酶溶液不含氯化鈉溶液。
7. 根據權利要求1所述的采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的步驟(3)中洗脫劑為0.5 1.5M的硫氰酸鈉。
全文摘要
本發明涉及一種采用金屬親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，包括(1)尼龍膜經甲醛活化和殼聚糖改性；(2)經活化改性的尼龍膜與環氧氯丙烷、氫氧化鈉和硼氫化鈉的混合溶液反應，再將膜分別浸入碳酸鈉、硼氫化鈉和偶聯劑的混合溶液和硫酸銅溶液，得到螯合銅離子的金屬親和膜；(3)將金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動泵送入Tris-HCl緩沖液和洗脫液，接著送入木瓜蛋白酶溶液，然后以洗脫劑進行洗脫，得到目標產物木瓜蛋白酶；(4)測試酶活性和蛋白質含量，計算純化倍數。該方法快速、簡便、分離量大，提取的酶活性好，適用于規模化生產。
文檔編號C12N9/50GK101270351SQ200810036788
公開日2008年9月24日 申請日期2008年4月29日 優先權日2008年4月29日
發明者何智妍, 朱利民, 聶華麗 申請人:東華大學