專利名稱：硒代木瓜蛋白酶的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物化學領域，特別涉及制備具有高谷胱甘肽過氧化物酶活性的人工酶的方法。
背景技術：
谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)是生物體內重要的含硒酶。由于它具有優良的抗氧化性，對治療和預防克山病、心血管病、炎癥及癌癥等具有很大潛力。但由于該酶不穩定、來源有限，大分子量會引起人體免疫反應等缺點，極大限制了此酶醫藥學方面的開發及應用，因此，對此酶的模擬越來越受到重視。
跟本發明最相接近的技術是，Hilvert小組做的硒化枯草桿菌蛋白酶，該硒化枯草桿菌蛋白酶是具有GPx活力的半合成的含硒酶。制備方法是以枯草桿菌蛋白酶、對甲苯基磺酰氟(PMSF)、硒氫化鈉(NaHSe)為原料，經活化-硒化-后處理過程制得硒化枯草桿菌蛋白酶。具體的是，將5.5μmol、150mg的枯草桿菌蛋白酶溶于50mM哌嗪(PIPES)與10mM氯化鈣(CaCl2)的4.5mL溶液中，使之保持PH值為7.0，加入含150μL、20mg/mL對甲苯基磺酰氟(PMSF)的乙腈溶液，在25℃溫度下反應1小時，得到的磺化酶由凝膠過濾柱葡聚糖G-25分離，用50mM PIPES和10mM CaCl2PH值7.0洗脫；蛋白峰溶于10mL，與等體積1M的NaHSe溶液混合，在惰性氣體保護下40℃保溫36小時；得到的蛋白由Sephadex G-25分離。
背景技術：
的工藝仍不夠簡單，所制得的硒化枯草桿菌蛋白酶的GPx活力遠低于天然酶。

發明內容
我們選用半胱氨酸蛋白酶家族中的代表-木瓜蛋白酶(Papain)作為蛋白骨架來制備GPx模擬物。達到制備工藝簡單，制備出穩定性和水溶性好、活力高的GPx模擬物的目的。
木瓜蛋白酶的晶體結構、酶學性質、作用機制都已有較詳盡的研究。它由分子量為23350的一條肽鏈組成。活性部位的25位半胱氨酸和158位組氨酸對催化至關重要。它的底物專一性較差，主要有蛋白水解酶和脂酶活性等，本身不具有過氧化物酶活性。本發明的原理是利用木瓜蛋白酶活性部位催化機制與GPx的相似性及其底物結合部位對GSH的親合力，對木瓜蛋白酶底物結合部位進行化學修飾，引入GPx的活性氨基酸—硒代半胱氨酸，從而使其具有高GPx活力。
本發明的硒代木瓜蛋白酶的合成是以木瓜蛋白酶和硒氫化鈉(NaHSe)為原料，工藝步驟分為硒化和后處理兩步。所說的硒化，是用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解木瓜蛋白酶，再加入過量的硒氫化鈉，氮氣保護下硒化15～55小時。硒化的溫度范圍為20℃-45℃。所說的后處理，是硒化后取出凍干，干粉用磷酸鹽緩沖液溶解，離心除硒后，經除鹽，收集蛋白峰，凍干，即得硒代木瓜蛋白酶。
上述的磷酸鹽緩沖液(PBS)的濃度范圍是10～100mM(mmol/L)、PH值5.0～9.0。控制硒化溫度和時間是必要的，溫度低于20℃，時間低于15小時，硒化效果不好，高于45℃，高于55小時，都能使酶變性嚴重，收率太低。當用50mM pH7.0PBS溶解酶，35-40℃硒化36-40小時時，硒化效果更好。
為了得到含硒量不同，其GPx活力也不同的產品，可以在硒化之前，先進行活化處理。即用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解木瓜蛋白酶，加入對甲苯基磺酰氟(PMSF)的乙腈溶液，對木瓜蛋白酶進行活化。PMSF分兩次加入，兩次之間間隔10～40分鐘。PMSF的用量可從0到酶摩爾數的100倍不等。在15～40℃溫度下活化1～4小時。當PMSF的用量為0時，即表示不經過活化處理過程。
本發明具有如下特點1.木瓜蛋白酶作為原料穩定、易得、成本低、分離提純簡單方便，適用于工業生產。
2.硒代木瓜蛋白酶制備方法簡單、步驟少，可擴大生產。
3.硒代木瓜蛋白酶模型的GPx活力高于已有文獻報道的大分子GPx模擬物，且高于天然兔肝GPx數倍。
4.硒代木瓜蛋白酶穩定性好，具有優良的抗氧化性，具有藥用潛力及工業應用價值，如化妝品工業等。


圖1是硒代木瓜蛋白酶對線粒體膨脹度的影響具體實施方式
實施例1硒氫化鈉的制備將81mg NaBH4溶解于裝有1mL水的小瓶中，再將79mg硒粉緩慢加到NaBH4的溶液，此刻看到水中有大量氣體冒出，在室溫下反應5分鐘。然后蓋上一插入針頭的膠蓋，直到反應沒有氣體溢出，取下針頭，密封，用時用針吸出。反應方程式為由于NaBH4與H+反應，有少量H2Se氣體產生。為防止中毒，反應在通風櫥中進行。
實施例2硒代木瓜蛋白酶的制備木瓜蛋白酶(2mg)溶于2mL 50mM PBS，pH7.0，用注射器加入實施例1制備的200μL 1M的NaHSe溶液，氮氣保護下40℃保溫36小時，然后取出凍干，干粉用10mM PBS(pH7.0)溶解，離心除硒后，經Sephadex G-25除鹽，收集蛋白峰，凍干，即得硒代木瓜蛋白酶。得到的硒代木瓜蛋白酶比活可達44770.3U/μmol。
實施例3硒代木瓜蛋白酶的制備(經活化再硒化)木瓜蛋白酶(2mg)溶于2mL 50mM PBS，pH7.0，50μL PMSF(20mg/mL乙腈溶液)分兩次隔30分鐘加入上述緩沖液，室溫保溫3小時，然后通高純氮約20分鐘以排除氧氣。用注射器加入實施例1制備的200μL 1M的NaHSe溶液，氮氣保護下30℃保溫36小時。此后的后處理過程同實施例2。得到的硒代木瓜蛋白酶比活可達54018.7U/μmol。
實施例4硒代木瓜蛋白酶的GPX活力根據Wilson方法測量了硒化前和硒化后酶的GPX活力[4]。反應在37℃，反應體系為500μL，含50mM PBS，pH7.0、1mM EDTA、1mMNaN3、1mM GSH、1U GSH還原酶和10-50nM酶。反應預保溫7分鐘，加0.25mM NADPH再保溫3分鐘，然后加入0.5mM氫過氧化物啟動反應。在340nm處監測NADPH被氧化時吸光度值的降低。以緩沖液代替人工酶為空白以消除非酶促反應。GPX活力單位定義為37℃每分鐘每消耗1微摩爾NADPH所需的人工酶的量。酶活力表示為每摩爾酶模擬物的活力單位數(U/μmol)。硒代枯草桿菌蛋白酶對芳香巰基化合物具有特異親和性，因而對于芳香巰基化合物表現出較高的催化活性，而對GPX天然底物GSH只表現出很低的活性。而硒代木瓜蛋白酶的GPx活力遠高于硒化枯草桿菌蛋白酶，從表一中可以看出它甚至比天然兔肝GPx活力還高好幾倍。
表一酶 底物 比活(U/μmol)木瓜蛋白酶 H2O20硒代木瓜蛋白酶 H2O254018.7天然兔肝GPx H2O25780實施例5硒代木瓜蛋白酶的生物學效應主要測定GPX模擬物對心肌線粒體抗氧化損傷的保護作用。
從新鮮牛心中提取線粒體，線粒體濃度用考馬斯亮蘭法確定，標準蛋白為牛血清白蛋白。
在pH7.4的磷酸鉀緩沖液中，含有0.125M KCl、1mM MgCl2、5mM谷氨酸鹽、線粒體(0.5mg/ml)、1μM GSH及GPX模擬物，于37℃保溫。加入終濃度為0.5mM Vc和12.5μM FeSO4后開始振蕩，并記時，分別于不同時間取出測膨脹度。不含模擬物的為損傷組，相同條件下只含線粒體不含模擬物、Vc和FeSO4的作為空白對照組。
線粒體膜受損傷后其形態發生變化，于520nm波長測其渾濁度變化。橫坐標為時間，縱坐標為光密度。光密度下降表示線粒體膨脹度增加。圖1中(■▲●)分別表示空白對照組、損傷組、含硒代木瓜蛋白酶的實驗組的線粒體膨脹度隨時間的增加。由圖可見，實驗組曲線下降趨勢明顯小于損傷組，說明硒代木瓜蛋白酶可以大大抑制線粒體膨脹，明顯減輕線粒體損傷，具有抗氧化活性，是一種很好的GPx模擬物。
權利要求
1.一種硒代木瓜蛋白酶的制備方法，是以硒氫化鈉為原料，工藝步驟為硒化和后處理兩步；其特征在于，原料還有木瓜蛋白酶；所說的硒化，是用磷酸鹽緩沖液溶解木瓜蛋白酶，再加入過量的硒氫化鈉，氮氣保護下硒化15～55小時，硒化的溫度范圍為20℃-45℃；所說的后處理，是硒化后取出凍干，干粉用磷酸鹽緩沖液溶解，離心除硒后，經除鹽，收集蛋白峰，凍干，得硒代木瓜蛋白酶。
2.按照權利要求1所述的硒代木瓜蛋白酶的制備方法，其特征在于，在硒化之前，先進行活化處理；用磷酸鹽緩沖液溶解木瓜蛋白酶，加入對甲苯基磺酰氟的乙腈溶液，對木瓜蛋白酶進行活化；對甲苯基磺酰氟分兩次加入，兩次之間間隔10～40分鐘.。
3.按照權利要求1或2所述的硒代木瓜蛋白酶的制備方法，其特征在于，硒氫化鈉的制備過程是將NaBH4溶解于裝有水的小瓶中，再將硒粉緩慢加到NaBH4的溶液，在室溫下反應5分鐘；然后蓋上一插入針頭的膠蓋，直到反應沒有氣體溢出，取下針頭，密封。
全文摘要
本發明的硒代木瓜蛋白酶的制備方法屬于生物化學領域，特別涉及制備具有高谷胱甘肽過氧化物酶活性的人工酶的方法。以木瓜蛋白酶、硒氫化鈉為原料，工藝步驟分為硒化和后處理兩步。所說的硒化，是用磷酸鹽緩沖液溶解木瓜蛋白酶，再加入過量的硒氫化鈉，氮氣保護下進行硒化；所說的后處理，是硒化后凍干，干粉用磷酸鹽緩沖液溶解，離心除硒后，經除鹽，收集蛋白峰，凍干得硒代木瓜蛋白酶。硒化前可以進行活化處理。本發明具有如下特點制備方法簡單、步驟少；原料穩定、易得、成本低、分離提純簡單方便；制得的產物穩定性好，具有優良的抗氧化性，谷胱甘肽過氧化物酶活力高，適用于工業生產，具有藥用潛力及工業應用價值。
文檔編號C12N9/08GK1431301SQ0311083
公開日2003年7月23日 申請日期2003年1月10日 優先權日2003年1月10日
發明者俞慧君, 羅貴民, 劉俊秋, 任曉君, 沈家驄 申請人:吉林大學