專利名稱：與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業生物技術工程，特別涉及與白粉病抗性基因相連鎖的分子標記及其獲得方法。
盡管實踐中可以采取化學藥劑來防治小麥白粉病，但是，培育抗病品種是最為安全、經濟、有效的措施。70年代初，我國引入具1B/1R的小麥衍生品種做為抗源，曾經一度有90％以上的品種攜有Pm8抗白粉病基因，由于抗性基因的單一性，結果導致小麥白粉病在全國范圍內多次大流行。此后，我國小麥育種家致力于多方引入和轉育具有新抗病基因的品種，但由于有些抗病基因在不同遺傳背景中表達不一致，致使真正用于生產實際的抗白粉病基因很少，在育種中應用的僅有Pm2、Pm4a、Pm4b、Pm6、Pm8及其組合Pm2+6、Pm2+4等，再加上小麥白粉病菌具有群體大，適應范圍廣，生理小種多且毒力變異快等特點，使得許多花費多年時間培育的抗病品種(系)剛應用不久，有的甚至還未應用，便由于病菌群體毒性的變化而喪失了抗性。“九五”期間，Pm4a、Pm6在全國各地均已開始喪失抗性。二十世紀末，北京地區推出了我國第一個自行轉育成功并定名的Pm21基因有毒性的菌株。目前，我國小麥育種項目中較為廣泛地利用了該基因，應引起警惕，防止抗源單一現象再次發生，有效地控制白粉病的流行。為此必須大力挖掘和利用新抗源并不斷地進行抗病基因的累加，培育抗性持久的小麥品種。
為實現上述任務，挖掘新抗源，以往，育種家們大多借助形態學標記和生化標記來輔助育種，但這類標記具有工作量大、標記數量少、易受環境影響等缺點。隨著分子生物學的發展，一類基于DNA變異的分子標記技術已經被國內外許多學者應用于小麥抗白粉病研究。應用分子標記，可以免除傳統育種中繁重的工作程序，跟蹤、檢測外源基因，還可以把多個抗白粉病基因聚合到同一優良品種中，獲得持久抗性。此外，將基因精確定位于高密度的分子圖譜上，以緊密連鎖的分子標記為起點，應用染色體步行(Chromosome Walking)等方法，逐漸逼近目標基因，最終克隆該基因。實踐證明DNA分子標記是進行抗病性鑒定和輔助育種研究的重要工具。
小麥對白粉病的抗性主要由主效基因控制，早期基因符號為M1，正式命名的基因符號為Pm(powdery mildew)。自從1930年澳大利亞學者首次報道了澳大利亞春小麥品種Thew攜帶一個顯性抗白粉病基因以來，至今已鑒定出30個Pm基因位點，除Pm29外，其余主效基因已被定位到染色體或染色體臂上。此外尚有抗病基因未被正式命名，臨時以M1表示。自從90年代初開展小麥抗白粉病基因分子標記研究以來，已有接近一半的抗病基因找到了相應的分子標記。目前已經得到的分子標記有些由于白粉菌生理小種的變異而失效，抗性基因即失去作用。
采用RAPD和SSR分子標記進行篩選與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記的方法是(1)RAPD、SSR引物在抗、感親本以及它們的雜交后代間DNA多態性分析用RAPD標記技術篩選，采用美國OPERON公司開發的10bp寡核苷酸作為隨機引物，在PE-9700PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為小麥基因組DNA(20ng/μl)1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，MgCl2(25mM)2.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，引物(50μM)0.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μ1)0.25μl，ddH2O 17.75μl，總體系25μl。反應程序96℃變性1分鐘，35℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，4個循環；94℃變性45秒，36℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，45個循環；72℃補齊10分鐘；產物檢測在含有0.5％μg/μl EB的1.4％的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結果；用SSR標記技術篩選，采用根據Rder在1998年發表的SSR引物序列合成的引物，在PE-9700PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系20ng/μ1小麥基因組DNA2.5μl，10×PCR Buffer 2μl，25mM MgCl21.5μl，2mM dNTP2μl，20ng/μl引物2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O 9.7μl，總體系20μl；反應程序94℃變性3分鐘，94℃變性1分鐘，50℃(或55℃，60℃)退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，45個循環，72℃補齊10分鐘；產物檢測8％非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis＝39∶1)電泳，電極緩沖液為1×TBE，恒定電壓90-140伏。凝膠染色采用硝酸銀染色；實驗結果記錄照相和島津CS-930薄層層析掃描儀記錄實驗結果；(2)分子標記的連鎖性鑒定小麥雜交后代白粉病抗性鑒定在田間進行，白粉菌接種在孕穗期的小麥苗，將帶菌感病對照株移栽至田間待鑒定的材料旁，通過自然傳播接種，2-3周后調查抗病性，調查級別分為免疫、感病兩級；分別提取抗病、感病單株的總體DNA，用與前面同樣的反應體系、引物及程序進行單株的PCR擴增，統計抗、感單株標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，用MapmakerEXP3.0b計算標記與抗白粉病基因之間的遺傳距離。有益效果白粉病是影響小麥生產的一種嚴重病害。本發明是利用分子標記方法得到兩個新的與白粉病抗性基因緊密連鎖的分子標記。利用這種方法，不僅克服了常規育種方法所需時間周期長等缺點、有目標地將抗病基因在實驗室內選擇得到、并有目的地聚合多個抗白粉病基因、培育出具有穩定抗性的小麥新品種，同時也可利用這兩個新白粉病抗性基因的分子標記克隆抗白粉病基因、并對其進行結構和功能分析，這對于進一步了解小麥抗白粉病的分子遺傳學機理有積極意義。因此，本研究結果在小麥育種實踐及抗病理論研究上都很有價值。其優點具體歸納如下(1)本發明的與白粉病抗性基因緊密連鎖的分子標記，是在對華北地區白粉病菌免疫的小麥品種Brock及其抗性穩定的雜交后代單株中獲得的新的標記，對15號生理小種均有抗性，而且穩定存在，可以用于小麥白粉病品種鑒定和小麥抗病后代的輔助選擇育種。
(2)本研究所用材料為對15號生理小種(混合型生理小種，為華北地區流行的多種白粉病病菌)免疫的小麥品種，對華北地區白粉病菌具有比較廣普的抗性。因此，根據所得分子標記有望克隆到新的白粉病抗性基因。
(3)為克隆小麥抗白粉病基因、基因序列分析以及轉抗白粉病基因小麥研究奠定了良好基礎。
具體做法是抗病基因供體親本來自英國普通小麥品種Brock，其與感病普通小麥親本015和感病親本京411進行雜交，雜交組合為“Brock/015//京411”，抗病單株是通過雜交、回交和自交，從抗白粉病穩定的高世代株系中得到92株BC2F5；一、提取DNA取小麥葉片0.2g，在液氮中研磨成粉末，迅速加入DNA提取緩沖液(50mMTris-HCl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0；50mM NaCl)，65℃溫浴15分鐘，其間顛倒混勻2-3次，0℃冰浴10分鐘。3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液，加入等體積Tris-HCl(pH8.0)飽和酚，顛倒混勻，3000轉/分鐘離心10分鐘。取上清液，加入等體積酚、氯仿和異戊醇(25∶24∶1)抽提，顛倒混勻，3000轉/分鐘離心10分鐘。取上清液，加入等體積氯仿，顛倒混勻，3000轉/分鐘離心10分鐘。取上清液，加入兩倍體積的冷乙醇，-20℃沉淀2個小時，12000轉/分鐘離心20分鐘，傾去上清液，70％乙醇洗滌沉淀兩次，自然涼干后溶于100μl TE中。加入1μl RNase(10mg/ml)，37℃保溫1小時，以除去樣品中的RNA，加入等體積的酚、氯仿抽提一次，3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液，再用等體積的氯仿抽提一次，加入兩倍體積的冷乙醇，-20℃沉淀2小時以上，12000轉/分鐘離心20分鐘，70％乙醇洗滌沉淀兩次，風干后，溶于50μl TE中。紫外分光光度法檢測DNA樣品的濃度，0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。二、隨機擴增多態性DNA(RAPD)分析RAPD引物一部分購自美國OPERON公司開發的10bp寡核苷酸作為隨機引物(OPP01-OPP20，10mer共20個)，一部分購自上海生工生物工程公司(10mer共75個)。1、PCR擴增(1)反應體系為小麥基因組20ng/μlDNA 1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mM dNTP 0.5μl，50μM引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，ddH2O 17.75μl，總體系25μl。混勻，瞬間離心收集，美國PE公司PE9700進行反應。(2)反應程序96℃變性1分鐘，35℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，4個循環；94℃變性45秒，36℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，45個循環；72℃補齊10分鐘。2、電泳檢測取擴增產物8μl，1.4％的瓊脂糖凝膠(含有0.5％μg/μl EB)電泳，紫外燈下觀察并照相。
我們利用95個隨機引物對京411和雜交后代抗病單株進行了RAPD分析，發現其中有85個引物能擴增出清晰的譜帶，擴增片段大小分布在0.2kb-3.5kb之間，每個引物的擴增帶數為1-10條，平均為5條，大約對基因組的420個座位進行了分析。結果只有引物OPP15的擴增產物在京411和抗病單株中表現多態性。
圖1是引物OPP15的擴增結果，在抗病單株中能觀察到一條分子量約為900bp的特異帶OPP15900，重復實驗三次，此帶仍能穩定出現。繼續采用OPP15擴增雜交親本Brock和015發現，抗病親本Brock中能擴增出特異帶OPP15900，如圖1所示3(抗病親本Brock)和4(雜交后代抗病單株)中均能擴增出特異帶OPP15900，而1(感病親本京411)和2(感病親本015)中缺乏OPP15900。說明這條特異帶可能與小麥抗白粉病特性存在聯系。三、RAPD分子標記OPP15900的連鎖性鑒定
小麥雜交后代白粉病抗性鑒定在田間進行，白粉菌接種在孕穗期的小麥苗，將帶菌感病對照株移栽至田間待鑒定的材料旁，通過自然傳播接種，2-3周后調查抗病性，調查級別分為免疫、感病兩級。分別提取抗病、感病單株的總體DNA，用上述同樣的反應體系及程序，用引物OPP15進行單株的PCR擴增，統計抗、感單株標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，用MapmakerEXP3.0b計算標記與抗白粉病基因之間的遺傳距離。以OPP15對雜交后代群體92個單株進行PCR擴增。結果顯示，80個抗病單株中有72株存在特異帶，8株沒有特異帶；12個感病單株中5株有特異帶，7株沒有特異帶。這一實驗結果表明特異DNA片段OPP15900與小麥的抗病性是緊密連鎖的，但在抗病和感病單株中都有一定的交換。如圖2所示R是有OPP15900特異帶的雜交后代抗病單株；R*是沒有OPP15900特異帶，但表型為抗病的雜交后代單株，表明發生了交換；S是沒有OPP15900特異帶的雜交后代感病單株；S*是有OPP15900特異帶，但表型為敏感的雜交后代單株，表明發生了交換。經計算，其重組率為14.13％，OPP15900與抗病基因間的遺傳距離為16.6cM。
實施例2用SSR分子標記方法，得到與小麥抗白粉病基因相連鎖的新分子標記Xgwm114120。
植物材料同實施例1，具體做法如下一、提取DNA各取小麥葉片0.2g，在液氮中研磨成粉末，迅速加入DNA提取緩沖液(50mMTris-HCl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0；50mM NaCl，65℃溫浴15分鐘，其間顛倒混勻2-3次，0℃冰浴10分鐘。3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液，加入等體積Tris-HCl(pH8.0)飽和酚，顛倒混勻，3000轉/分鐘離心10分鐘。取上清液，加入等體積酚、氯仿和異戊醇(25∶24∶1)抽提，顛倒混勻，3000轉/分鐘離心10分鐘。取上清液，加入等體積氯仿，顛倒混勻，3000轉/分鐘離心10分鐘。取上清液，加入兩倍體積的冷乙醇，-20℃沉淀2個小時，12000轉/分鐘離心20分鐘，傾去上清液，70％乙醇洗滌沉淀兩次，自然涼干后溶于100μl TE中。加入1μl RNase(10mg/ml)，37℃保溫1小時，以除去樣品中的RNA，加入等體積的酚、氯仿抽提一次，3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液，再用等體積的氯仿抽提一次，加入兩倍體積的冷乙醇，-20℃沉淀2小時以上，12000轉/分鐘離心20分鐘，70％乙醇洗滌沉淀兩次，風干后，溶于50μl TE中。紫外分光光度法檢測DNA樣品的濃度，0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。二、SSR引物的合成根據Rder在1998年發表的SSR引物序列合成實驗所需引物(由上海生物工程公司合成)。三、微衛星引物(SSR)分析1、PCR擴增(1)反應體系20ng/μl小麥基因組DNA 2.5μl，10×PCR Buffer 2μl，25mMMgCl21.5μl，2mM dNTP2μl，20ng/μl引物2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O 9.7μl，總體系20μl。混勻，瞬間離心收集，美國PE-9700上進行反應。(2)反應程序94℃變性3分鐘，94℃變性1分鐘，50℃(或55℃，60℃)退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，45個循環，72℃補齊10分鐘。2、電泳檢測(1)凝膠電泳取擴增產物5μl，8％非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis＝39∶1)電泳，電極緩沖液為1×TBE，恒定電壓90-140伏。(2)凝膠染色10％醋酸固定，去離子水漂洗3次，0.1％硝酸銀250ml(加入40％甲醛375μl)染色，去離子水漂洗10秒，立即放入預冷的顯影液(7.5g無水碳酸鈉溶于250ml去離子水+40％甲醛375μl+10mg/ml硫代硫酸鈉50μl)，不斷搖動至DNA條帶清晰，10％醋酸終止反應。3、實驗結果記錄照相和島津CS-930薄層層析掃描儀記錄實驗結果。
利用20個微衛星引物對京411和雜交后代抗、感病單株進行了SSR分析，發現其中有17個引物能擴增出清晰的譜帶，擴增片段大小分布在110bp-300bp之間，每個引物的擴增帶數為1-5條，平均4條，大約對基因組的65個座位進行了分析。結果只有引物Xgwm114的擴增產物在京411和抗病單株中表現多態性。圖3是引物Xgwm114的擴增結果，在3(抗病親本)、4(抗病雜交后代單株)中能觀察到一條分子量約為120bp的特異帶Xgwm114120，重復實驗三次，此帶仍能穩定出現，而在1(感病親本京411)和2(感病親本015)中卻沒有此帶。說明該特異帶可能與小麥抗白粉病特性存在某種聯系。
Xgwm114引物序列為左翼5’-ACA AAC AGA AAA TCA AAA CCC G-3’，右翼5’-ATC CAT CGC CAT TGG AGT G-3’，定位于小麥3B和3D染色體上，復性溫度為60℃。四、SSR分子標記Xgwm114120的連鎖性鑒定采用引物Xgwm114進行單株的PCR擴增，其方法同實施例1的連鎖性鑒定。
為了檢測Xgwm114120的穩定性及其與抗病基因的連鎖關系，以引物Xgwm114對雜交后代92個單株進行擴增，如圖4所示。結果80個抗病單株中有63株(R)存在特異帶，17株沒有特異帶(R*)；12個感病單株中3株(S*)有特異帶，9株沒有特異帶(S)。經計算，其重組率為21.74％，Xgwm114120與抗病基因間的遺傳距離為28.5cM。
權利要求
1.與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記，其特征在于所述的分子標記OPP15900和Xgwm114120，其是用下述方法得到的(1)抗病基因供體親本來自英國普通小麥品種Brock，其與感病普通小麥親本015和感病親本京411進行雜交，雜交組合為“Brock/015//京411”，抗病單株是通過雜交、回交和自交，從抗白粉病穩定的高世代株系中得到；(2)用苯酚-氯仿方法提取小麥親本幼苗及雜交后代幼苗DNA；(3)采用RAPD和SSR兩種分子標記方法進行小麥白粉病抗性分子標記的篩選；(4)篩選出一個RAPD分子標記OPP15900和一個SSR標記Xgwm114120，經過連鎖性鑒定，發現該兩個標記與小麥抗白粉病基因相連鎖。
2.按照權利要求1所述的與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記，其特征在于采用RAPD和SSR分子標記進行篩選與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記的方法是(1)RAPD、SSR引物在抗、感親本以及它們的雜交后代間DNA多態性分析用RAPD標記技術篩選，采用美國OPERON公司開發的10bp寡核苷酸作為隨機引物，在PE-9700PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20ng/μl小麥基因組DNA1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mMdNTP0.5μl，50μM引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，ddH2O 17.75μl，總體系25μl。反應程序96℃變性1分鐘，35℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，4個循環；94℃變性45秒，36℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，45個循環；72℃補齊10分鐘；產物檢測在含有0.5％μg/μl EB的1.4％的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結果；用SSR標記技術篩選，采用根據Rder在1998年發表的SSR引物序列合成的引物，在PE-9700PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系20ng/μl小麥基因組DNA2.5μl，10×PCR Buffer 2μl，25mM MgCl21.5μl，2mM dNTP2μl，20ng/μl引物2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O 9.7μl，總體系20μl；反應程序94℃變性3分鐘，94℃變性1分鐘，50℃(或55℃，60℃)退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，45個循環，72℃補齊10分鐘；產物檢測8％非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis＝39∶1)電泳，電極緩沖液為1×TBE，恒定電壓90-140伏。凝膠染色采用硝酸銀染色；實驗結果記錄照相和島津CS-930薄層層析掃描儀記錄實驗結果；(2)分子標記的連鎖性鑒定小麥雜交后代白粉病抗性鑒定在田間進行，白粉菌接種在孕穗期的小麥苗，將帶菌感病對照株移栽至田間待鑒定的材料旁，通過自然傳播接種，2-3周后調查抗病性，調查級別分為免疫、感病兩級；分別提取抗病、感病單株的總體DNA，用與前面同樣的反應體系、引物及程序進行單株的PCR擴增，統計抗、感單株標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，用MapmakerEXP3.0b計算標記與抗白粉病基因之間的遺傳距離。
全文摘要
與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記屬于農業生物技術工程，特別涉及與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記及其獲得方法。本發明克服常規標記方法工作量大、易受環境影響、育種周期長等缺點。采用RAPD和SSR兩種分子標記方法對抗、感小麥親本及抗病雜交后代“Brock/015∥京411”進行抗性標記的篩選。其中RAPD標記用美國OPERON公司開發的10bp寡核苷酸為隨機引物；SSR標記用Rder在1998年發表的SSR引物序列合成的引物，篩選后得到與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記OPP1文檔編號C12Q1/68GK1428440SQ0213131
公開日2003年7月9日 申請日期2002年9月27日 優先權日2002年9月27日
發明者王振英, 陳宏 , 彭永康 申請人:天津師范大學