專利名稱：小麥抗白粉病(相關)基因克隆的制作方法
技術領域：
小麥抗白粉病(相關)基因克隆，屬于生物工程領域。
背景技術：
普通小麥是異源六倍體(AABBDD)，基因組龐大(1. 6X 101Qbp)且含大量的重復序 列(約為總量的80%) (Flavell等，1974)，使得圖位克隆法和篩選基因組文庫法很難應用； 而由于小麥本身不含有轉座子，轉座子標簽法也很難奏效；PCR法克隆與常規方法相比具 有快速而廉價的特點，但PCR擴增有時會引入突變，而且由于PCR法需要根據已知的資料設 計引物，創新性不高。可見，僅用某一種方法克隆小麥抗白粉病基因全長序列困難較大。這 也是目前小麥抗白粉病基因克隆進展較緩慢的主要原因。 研究表明，植物中參與抗性反應的基因可以分為抗病基因和防衛反應基 因。在抗白粉病的防御體系中，除抗白粉病基因以外，防衛反應基因如病程相關基因 (pathogenesis-relatedgene)等對于抵御白粉病的侵害都有一定的作用，因此，由于研究 策略或實驗技術方面的原因，相關克隆存在克隆抗白粉病病程相關基因和抗白粉病(候 選)基因兩個方面。

發明內容
病程相關基因的編碼產物——病程相關蛋白(pathogenesis-related proteins, 簡稱PRP或PRs)最早于由Van Loon和Van Kammen于1970年在煙草花葉病毒(TMV)誘發 產生過敏性反應的煙草葉片中檢測到，由PR基因編碼，且只有在病理或病理相關環境下才 被誘導產生。植物系統中的PRP主要有1)幾丁質酶，其功能之一是裂解幾丁質。研究表 明，許多危害植物的病原真菌的細胞壁主要成分是幾丁質；2) P-l，3-葡聚糖酶，其功能之 一是水解P-l，3-葡聚糖多聚體，已證實P-l，3-葡聚糖酶與幾丁質酶一道具有較強的抗 真菌的活性，且兩種酶具有很強的協同作用。3)P-l，3-l，4-葡聚糖酶；4)脫乙酰殼多糖 酶；5)過氧化物酶；6)類甜味蛋白；7) a -淀粉酶；8)溶菌酶。PRP的作用底物為葡聚糖和 甲殼素(chitosan，又名殼聚糖，是幾丁質、幾丁聚糖的通稱)，高等植物中不含甲殼素，只 含有少量的葡聚糖，但它們是除卵菌綱以外的絕大多數真菌細胞壁的主要碳水化合物。
現在認為，PRP參與了植物的誘導抗病性，特別是幾丁質酶和13 -1，3_葡聚糖酶是 植物潛在的抗病物質。因此，PR基因的克隆受到廣泛的重視。Schweizer等(1989)用大麥 白粉菌(Egh)接種小麥幼苗，通過構建cDNA文庫和差異篩選分離得到6種不同誘導表達的 植物mRNA的cDNA克隆，這些基因在接種小麥白粉菌(Egt)和大麥白粉菌(Egh)后3小時被 迅速誘導。其中一個克隆(WIR3)的部分多肽序列推導分析表明其mRNA編碼一種過氧化物 酶。2004年，孔凡晶等利用差異顯示分析(different display analysis)技術，獲得編碼 產物類似幾丁質酶的cDNA片段。在小麥中克隆到的與抗白粉病相關的蛋白還有類甜蛋白 (Rebmann， 1991 ;Yu Ling等，2003)、谷胱苷月太_S轉移酶(Dudler， 1991)。普通小麥在水楊 酸(SA)、2，6-二氯異煙酸(INA)和苯并噻二唑類(BTH)物質誘導下，可產生一組與抗白粉病有關的富含硫元素的病程相關蛋白(Buschges，1997)，Niu Ji-shan等(2002)用mRNA差 異顯示和RACE技術相結合也篩選出一個與抗病防衛反應有關的硫代硫酸硫轉移酶基因。
此外，HtATP酶與細胞抗性的產生直接相關(Jaffe et al. ， 1981)。研究發 現，當植物受到化學物質、物理因素及病原菌作用后，H+-ATP酶基因表達及活性迅速提高 (Serrano, 1989) 。Yu Ling(2002)用根據抗病基因保守結構域設計的簡并引物，通過RT-PCR 篩選獲得一段與『41 酶高度同源的(^脆片段。顧小偉(2003)以Pm4a近等基因系 Yumai/8*Cc和Chancelor (Cc)為材料用RT-PCR和RACE技術獲得一個H+-ATP酶全長cDNA 序列(Thai)，這是第一個被克隆的小麥跨膜質子泵類似基因。
權利要求
Srichumpa等(2005)利用與Pm3b緊密連鎖的分子標記對含有Pm3位點10個等位基因的10個品系進行了單元型分析，發現所有品系都有一個由與Pm3b共分離的標記界定的基因組保守區域，該區域包含一個結構上與Pm3b相似的基因。然后以含有Pm3a、Pm3d和Pm3f的品系為材料進行PCR為基礎的同源克隆，得到三個類似Pm3b的序列。通過瞬間轉化(transient transformation)分析發現，所得到的Pm3a、Pm3d和Pm3f的候選基因均能提供分別由AvrPm3a-、AvrPm3d-和AvrPm3f-3個基因產物誘導的抗性，在氨基酸水平上，Pm3a、Pm3b、Pm3d和Pm3f編碼產物有高達97.8％的相似性，在coiled-coil結構域內4種蛋白質氨基酸序列100％保守，但在NBS區內存在序列交換，表明在等位基因之間存在基因內重組(intragenicrecombination)或基因轉換(gene conversion)，這些證據說明所克隆的3個候選基因是真正的抗白粉病基因，且Pm3a、Pm3b、Pm3d和Pm3f4個基因是等位基因。
全文摘要
植物中參與抗性反應的基因可以分為抗病基因和防衛反應基因。在抗白粉病的防御體系中，除抗白粉病基因以外，防衛反應基因如病程相關基因(pathogenesis-related gene)等對于抵御白粉病的侵害都有一定的作用，因此，由于研究策略或實驗技術方面的原因，相關克隆存在克隆抗白粉病病程相關基因和抗白粉病(候選)基因兩個方面。
文檔編號C12N15/29GK101760461SQ200810238570
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月19日 優先權日2008年12月19日
發明者李祥 申請人:李祥